专利名称：烟草腺毛cDNA表达谱芯片及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因芯片领域，具体涉及一种烟草腺毛CDNA表达谱芯片及其制备与应用。
背景技术：
植物腺毛作为植物表皮细胞的特化结构，因其在植物病虫害防御、抵抗逆境胁迫以及次生产物合成等过程中所起的重要作用而倍受关注。随着功能基因组学技术的进步， 利用芯片技术研究植物腺毛的发育、代谢和分泌的分子机制逐渐成为植物生物学研究领域的一大热点。拟南芥因其完整的基因组信息和完善的芯片产品，其腺毛的分子生物学研究存在诸多有利条件。但由于拟南芥属于典型非分泌型腺毛，因而这些有利条件无法在腺毛物质代谢和分泌领域广泛应用。烟草腺毛属于典型的分泌型腺毛，其主要分泌物是糖脂和二萜类化合物，与烟叶的品质和抗性密切相关。目前关于烟草腺毛的研究多集中在腺毛类型、密度、组织结构、化学成分等方面，而对于烟草腺毛的生长发育及物质代谢的分子机制还缺乏深入研究。虽有一些利用分子生物学技术对烟草腺毛的特异基因进行克隆和表达的报道，但目前对烟草腺毛的基因表达模式进行全景式分析仍缺乏有效的途径。这与烟草基因组庞大，测序尚未完成，Genebank中烟草基因信息缺乏，商业化烟草基因芯片不完善有关。目前，市场上出现的 Agilent和Nibergen的烟草芯片主要是根据美国及欧洲烟草基因组计划中的EST序列进行设计的。这些芯片缺乏相应的注释信息，同时也缺乏腺毛中特有的EST序列，因而不适用于烟草腺毛的基因表达谱研究。目前关于烟草腺毛基因表达谱的研究报道，主要是采用cDNA 文库随机测序技术方法来完成的。例如最近发表的“铬对烟草腺毛基因表达的影响研究” (Harada, 2010)该文章作者建立了两个腺毛cDNA文库(处理和对照)，并对两个文库分别进行随机测序，通过对测序结果进行比对和分析，找到处理和对照之间的基因表达差异。这种方法的主要缺点是要对不同cDNA文库进行分别测序，因而测序成本高，不适用于对大量样品进行研究。表达i普基因芯片(DNA microarrays for geneexpression profiles)是基因芯片的一种，对不同细胞或组织来源的mRNA在逆转录反应中分别用不同颜色的荧光标记成探针(目前常用Cy3 - dUTP(绿色)标记对照组rnRNA，Cy5 一 dUTP(红色)标记样品组 mRNA)，探针混合后与芯片或微阵列板上的基因进行严格杂交，再通过不同波长的荧光扫描芯片，将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值(ratio值)，同时计算机还给出直观的显色图。在样品中呈高表达的基因其杂交点呈红色，相反，在对照组中高表达的基因其杂交点呈绿色，在两组中表达水平相当的显黄色，这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况。基因表达谱可直接检测mRNA的种类及丰度，可以同时分析上万个基因的表达变化，来揭示基因之间表达变化的相互关系。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种烟草腺毛cDNA表达谱芯片，可利用该芯片进行腺毛基因表达研究，从而鉴定烟草腺毛特异基因的表达，同时还给出了烟草腺毛cDNA 表达谱芯片的制备与应用方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是
一种烟草腺毛cDNA表达谱芯片，包括载片，在其平面上包覆有带正电荷的膜，在该膜的表层设有点阵，点阵上排布样点，其特征在于，在该点阵上排布有含来源于烟草腺毛cDNA 克隆的PCR产物，且含有阳性对照和阴性对照样点。所述所述烟草腺毛cDNA克隆的PCR产物是通过以下方法制得
(1)腺毛总RNA提取挑选发育良好、健康的烟草叶片，采用冻刷法收集叶面腺毛，冻纯存后提取烟草腺毛总RNA ；
(2)cDNA文库构建采用SMART法构建出烟草腺毛的全长cDNA文库；
(3)cDNA文库随机测序及EST文库建立随机挑选cDNA克隆，利用ADI3700进行5，端测序，得到烟草有效序列，再采用lOObp，90%的原则对其归并unigene，得到unigene数，通过Blastx对EST进行序列比对和功能注释，挑出ESTs对应克隆，以M13+和M13-为通用引物进行PCR扩增，用异丙醇纯化法对PCR产物进行纯化。所述样点为矩阵排布，单个矩阵排布76X114个样点，每个样点在芯片矩阵内设
置3次重复。所述阳性对照样点为烟草actin基因。所述阴性对照样点为与烟草无同源性的人基因及空白点样稀释液。
上述烟草腺毛cDNA表达谱芯片的制备方法如下
(1)腺毛总RNA提取挑选发育良好、健康的烟草叶片，采用冻刷法收集叶面腺毛，冻纯存后提取烟草腺毛总RNA ；
(2)cDNA文库构建采用SMART法构建出烟草腺毛的全长cDNA文库；
(3)cDNA文库随机测序及EST文库建立随机挑选cDNA克隆，利用ADI3700进行5，端测序，得到烟草有效序列，再采用lOObp，90%的原则对其归并unigene，得到unigene数，通过Blastx对EST进行序列比对和功能注释，挑出ESTs对应克隆，以M13+和M13-为通用引物进行PCR扩增，用异丙醇纯化法对PCR产物进行纯化；
(4)点制芯片将上步所得PCR产物溶于点样稀释液中，再以点样仪将其按点样方案点制于点样基片上；点样完成的芯片置点样仪中进行水合、干燥，再经封闭液封闭、水冲洗、室温干燥后放4°C保存备用。 上述烟草腺毛cDNA表达谱芯片在筛选烟草腺毛特异表达基因上的应用，具体包括以下步骤
(1)RNA提取和纯化采用Trizol —步法分别提取烟草腺毛和去腺毛叶片总RNA ；
(2)荧光探针标记逆转录标记cDNA探针并纯化，在一链合成中掺入荧光标记dCTP，用 Cy5-dCTP标记腺毛样品，Cy3-dCTP标记去腺毛叶片样品，同时进行反标，DNA纯化后真空抽干，备用；
(3)芯片杂交采用常规方法进行芯片杂交；
(4)数据收集用激光扫描仪扫描杂交后的芯片，并对芯片所获得的原始信号进行整体校准和数据均一化处理，计算每个基因点在本试验中的表达差异值Rati0，Rati0 > 2. 0为上调表达，Ratio ( 0. 5为下调表达，由此筛选出差异表达基因。本发明具有积极有益的效果
1.本发明制备出的芯片具有高通量、高精确性、特异性强的优势，因而可以一次检测大量基因的表达模式，并可在在相同试验条件下，综合分析多个样品的基因表达变化规律， 适用于烟草腺毛与栽培措施、环境胁迫等关系方面的研究，与cDNA测序手段相比，具有高效、经济、快速的特点。2.设立了可检测的质量控制系统，如阴性、阳性、空白对照，保证了检测结果的特异性，可达到高效、灵敏、准确、高通量平行检测的效果。3.本发明的烟草腺毛cDNA表达谱芯片建立在烟草腺毛cDNA文库基础之上，并对大部分序列进行了功能注释，与其它烟草EST来源的芯片相比，在候选基因方面具有针对性、精确性和可释性，并且提高了分离到腺毛中特异表达的低丰度基因可能性，是烟草腺毛基因表达研究和新基因挖掘的有力工具。
图1为烟草腺毛cDNA表达谱芯片扫描图。图2为本发明基因芯片表达结果与RT-PCR结果比较图谱。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试齐Ll商店。实施例1 一种烟草腺毛cDNA表达谱芯片，包括载片，在其平面上包覆有带正电荷的膜，在该膜的表层设有点阵，点阵上排布样点，在该点阵上排布有含来源于烟草腺毛 2830个cDNA克隆的PCR产物，其长度在400 1000 bp,并含有阳性对照和阴性对照；样点为矩阵排布，单个矩阵排布76X114个样点，每个样点在芯片矩阵内设置3次重复。阳性对照为烟草actin基因，阴性对参照是与烟草无同源性的人基因及空白点样稀释液。上述烟草腺毛cDNA表达谱芯片的制备方法，具体包括以下步骤 (1)烟草腺毛的收集和腺毛总RNA提取
以烟草品种为材料，挑选发育良好、健康叶片，采用冻刷法(Erming，2001)进行叶面腺毛的收集，收集前用清水冲洗所选叶片。叶片在液氮中冻存五分钟，选用硬度适中的鬃毛刷子，沿主脉从叶基向叶尖方向刷取腺毛于冻存管里，液氮罐中保存。腺毛总RNA提取按照GIBCO BRL公司的1Trizol reagent说明书上的操作规程进行。将0. 56g腺毛组织放入碾钵，在液氮中研磨至粉末状，转至勻浆管，加入5. 5 mL Trizol勻浆；氯仿抽提，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤沉淀晾干，MilliQ水溶解沉淀，紫外分析及电泳检测后备用。(2)烟草叶面腺毛cDNA文库构建
采用 SMART (Switching Mechanism At 5，end of RNA Transcript )技术构建烟草腺毛的全长cDNA文库。LD PCR法合成双链cDNA，按照试剂盒(Clontech，SMART cDNA Library Construction Kit，634901)说明添加试剂和引物，反应在已预热到95°C的HYBAID PCREXPRESS PCR仪上进行，95°C变性15 sec，68°C延长6 min，共30个循环。取反应产物5 mL 在1. 琼脂糖凝胶上进行电泳检测。吸取50 mL扩增的dscDNA (2 ;3mg)至0. 5 mL灭菌的离心管中，加入蛋白酶 K，经酚氯仿异戊醇抽提、乙醇沉淀后，用限制性内切酶分Y I酶切，然后通过CHROMA SPIN-400柱子分离纯化，依次收集经分离纯化的cDNA共10管，1. 1%琼脂糖凝胶电泳检测 cDNA含量及片段大小。^pBluescript II SK载体进行改造，将EcoR I和Not I之间的序列改造为Sfi I A和Sfi I B接头序列。酶切以后，将分离纯化后的cDNA定向连接到该载体上(Sfi I A —Sfi I B)。连接反应按试剂盒(Fermentas，T4 DNA Ligase, #EL0012)说明进行，cDNA 与载体浓度按照1 3进行混合。取200 mL感受态宿主菌(DH-5 α)至灭菌的50mL离心管中，加入上述IuL连接液，轻轻混勻后冰浴45 min, 42 °C水浴热激90 sec,加入2 mL LB培养基，37 "C培养45min后，3000rpm 离心10 min收集菌体，250 mL LB培养基重悬。取200 mL菌液涂布于含有Apr-IPTG/x-gal的LB固体培养基，37 V过夜， 计算菌落数及蓝白斑比例，并根据菌落数计算文库的重组率、库容量和文库滴度
ο为了对文库进行快速鉴定，随即选取M个克隆进行5’末端测序，并对测序结果进行unigene归并。在得到的24条有效序列中，有23条为unigene，unigene比例为95. 8%。 同时对序列进行全长分析，在M条序列中有21条序列有相关同源信息，其中14条为全长， 完整性比率为66. 7%。说明所构建的烟草腺毛cDNA文库具有较高的质量。烟草叶面腺毛cDNA文库构建方法还可参见文献“烟草腺毛全长cDNA文库的构建” (厦门大学学报(自然科学版)，2006年11月，第45卷第6期，859-861)。(3) cDNA文库随机测序及EST文库建立
随机挑选cDNA克隆，利用ADI3700进行5，端测序。根据phred软件QClO标准、载体屏蔽(参数为-minmatch 14 -penalty -2 - minscore 30)，取长度尝500，得到烟草有效序列5139条。再采用lOObp，90%的原则对这5139条序列归并unigene，得到unigene数为观30条。通过Blastx对EST进行序列比对和功能注释。结果发现观31个unigene中，987 个(34. 9 %)无法找到匹配序列，其功能未知；将其它1844(65. 1 %)个基因提交到amigo网站(http://amigo.geneontology.org)进行功能注释和分类，发现其中61.5% ESTs编码与代谢相关的蛋白，与生物调节、转运、刺激反应、信号转导、发育、生长相关的序列分别占 16. 8%、16· 1%、12· 9%、6· 5%、4· 4% 和 0. 6%。(4)点样制片
将观30个ESTs对应克隆挑出，以M13+和M13-为通用引物进行PCR扩增，PCR体系体积为80 μ 1，其中dNTP终浓度为0. 2mM，引物终浓度为0. 2 μ Μ,Mg2+终浓度为1. 5mM,rTaq酶 4U, cDNA克隆2-IOng左右。PCR反应程序如下
①940C30 sec ；
②940C30 sec ；
③560C30sec ；⑤ go to ②35Cycles ；
⑦ 10°C (或 4°C)for ever οPCR完毕，通过1%琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物的质量和产量。用异丙醇纯化法对PCR产物进行纯化，纯化步骤如下分别取8 μ 1 NaAc (ρΗ=7. 0，3mol/L)和85 μ 1异丙醇依次加入PCR产物板中，混勻，于_20°C冰柜或冰箱中沉淀过夜(或-20°C静置3 hr以上)，沉淀完毕，将96孔板置于离心机，4500 rpm离心 30min，弃去上清液，倒置5min，每孔中加入75%的乙醇100 μ ，轻轻混勻后置96孔板离心机中4500 rpm离心20min，弃去上清液，室温静置干燥4hr以上。点制芯片将96孔PCR板中干燥的PCR产物溶于16μ1左右点样稀释液(上海博星基因芯片公司)中，充分溶解。用十二道微量移液器将96孔PCR板中的样品按一定顺序移至 384孔板(Genetix公司)中。打开OmniGrid点样仪，装上MicroQuill 2000点样针(Majer Precision公司)，按点样方案设计程序，放上384孔样品板及待点样基片(上海博星基因芯片公司)，运行程序开始点样。点样完成的芯片置点样仪中水合30 min、室温干燥2 hr ；以封闭液(上海博星基因芯片公司)封闭15min、水冲洗、室温干燥后备用。每个克隆在同一个基片不同位置重复点样三次，以烟草actin基因做阳性对照， 与烟草无同源性的人基因做阴性对照，芯片质检合格后放4°C保存备用。利用上述烟草腺毛cDNA芯片筛选腺毛特异表达基因的方法 (I)RNA提取和纯化
采用Trizol —步法分别提取腺毛和去腺毛叶片总RNA。采用QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA，RNA的线性放大采用Ambion公司生产的MessageAmpTM 11 aRNA Amplification Kit, RNA Amplification for Array Analysis 试剂盒。严格按试剂盒说明书操作。(2)荧光探针标记具体步骤如下
①在灭菌的1. 5 mL Eppendorf管内依次加入以下试剂(反应终体积为50 μ L，以下试剂均为RNase-free) ddH2023 μ L
随机引物 5 μ L aRNA3 μ g
振荡混勻，置于70°C水浴10 min，取出后，迅速置于冰上。②分别加入以下试剂 逆转录酶缓冲液10 μ L DTT 5 μ L
dNTPs 4 yL
③而后在暗室中加入以下试剂
逆转录酶2 μL
Cy5-dCTP 或 Cy3-dCTP 3 yL④用手指弹打管壁以混勻样品，手浴2 min0将Eppendorf管置于42°C水浴2 hr。⑤依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4 μ1，65 水浴10 min后加入标记试剂II 4 μ 1，混勻，合并对照组、实验组，避光，真空抽干至50 μ L左右。⑥使用DNA纯化柱(或乙醇沉淀)纯化DNA。⑦加入标记试剂III 8 μ 1，真空抽干。逆转录标记cDNA探针并纯化，在一链合成中掺入荧光标记dCTP，用Cy5_dCTP标记腺毛样品，Cy3-dCTP标记去腺毛叶片样品，同时进行反标。DNA纯化后真空抽干，备用。(3)芯片杂交具体步骤如下
①在抽干的探针管中加6. 5μ L杂交试剂I，充分混勻，使探针溶解。再加入6. 5μ L杂交试剂II，混勻备用。②将预杂交的玻片取出，用ddH20冲去盖玻片。③将探针置于95°C水浴中变性2 min ；玻片置于95°C水浴中变性30 sec,玻片取出浸无水乙醇30 sec，探针取出后迅速置于冰上。④将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入 42°C杂交箱内杂交过夜(16 18 h)。⑤用0. 5%的洗涤液1冲洗玻片，去除盖玻片。⑥准备两个染色缸，分别装有0. 5%的洗片试剂1 +洲的洗片试剂2、5%的洗片试剂3，放入60°C水浴锅中。⑦将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10 min。⑧用0. 5%的洗涤液1冲洗玻片，晾干后扫描。 (4)数据收集
芯片用kanArray4000激光扫描仪进行扫描，得图1所示的扫描图。采用GenePix Pro 3. 0图像分析软件(Axon Instruments公司)对芯片图像进行分析，芯片杂交扫描后，用分析软件对芯片所获得的原始信号进行整体校准和数据均一化处理。均一化处理依据以下2 个原则筛选有效基因点第一，该基因点的Cy3、Cy5信号值皆大于200，或者其中之一大于 800;第二，该基因点的Ratio值在0. 1 10之间，然后求出r=ln (Ratio)，再算出全部有效基因点r的平均值R，试验的均一化系数就等于R的倒数即EXP(R)。所有基因点的Cy3 信号值乘上均一化系数，得出调整后的Cy3*，计算每个基因点在本试验中的表达差异值 Ratio=Cy5 / Cy3*，Ratio彡2. 0为上调表达，Ratio ^ 0. 5为下调表达，由此筛选出差异表达基因。(5)差异基因RT-PCR验证
根据芯片杂交结果分析选择部分基因进行RT-PCR验证。根据引物设计软件ft~imer5 设计引物如表1。采用superscript One-Step体系进行RT-PCR检测，操作按照说明书程序进行。25 μ L体系，30个循环，反应条件如下94° C变性1 min, 50 55° C退火2 min, 72° C延伸2 min。用Actin基因作内标。芯片表达结果与RT-PCR结果比较见附图2。表1 RT-PCR引物序列表
权利要求
1.一种烟草腺毛CDNA表达谱芯片，包括载片，在其平面上包覆有带正电荷的膜，在该膜的表层设有点阵，点阵上排布样点，其特征在于，在该点阵上排布有含来源于烟草腺毛 cDNA克隆的PCR产物，且含有阳性对照和阴性对照样点。
2.根据权利要求1所述的烟草腺毛cDNA表达谱芯片，其特征在于，所述烟草腺毛cDNA 克隆的PCR产物是通过以下方法制得(1)腺毛总RNA提取挑选发育良好、健康的烟草叶片，采用冻刷法收集叶面腺毛，冻纯存后提取烟草腺毛总RNA ；(2)cDNA文库构建采用SMART法构建出烟草腺毛的全长cDNA文库；(3)cDNA文库随机测序及EST文库建立随机挑选cDNA克隆，利用ADI3700进行5，端测序，得到烟草有效序列，再采用lOObp，90%的原则对其归并unigene，得到unigene数，通过Blastx对EST进行序列比对和功能注释，挑出ESTs对应克隆，以M13+和M13-为通用引物进行PCR扩增，用异丙醇纯化法对PCR产物进行纯化。
3.根据权利要求2所述的烟草腺毛cDNA表达谱芯片，其特征在于，所述样点为矩阵排布，单个矩阵排布76X114个样点，每个样点在芯片矩阵内设置3次重复。
4.根据权利要求2所述的烟草腺毛cDNA表达谱芯片，其特征在于，所述阳性对照样点为烟草actin基因。
5.根据权利要求2所述的烟草腺毛cDNA表达谱芯片，其特征在于，所述阴性对照样点为与烟草无同源性的人基因及空白点样稀释液。
6.权利要求1所述烟草腺毛cDNA表达谱芯片的制备方法，包括以下步骤(1)腺毛总RNA提取挑选发育良好、健康的烟草叶片，采用冻刷法收集叶面腺毛，冻纯存后提取烟草腺毛总RNA ；(2)cDNA文库构建采用SMART法构建出烟草腺毛的全长cDNA文库；(3)cDNA文库随机测序及EST文库建立随机挑选cDNA克隆，利用ADI3700进行5，端测序，得到烟草有效序列，再采用lOObp，90%的原则对其归并unigene，得到unigene数，通过Blastx对EST进行序列比对和功能注释，挑出ESTs对应克隆，以M13+和M13-为通用引物进行PCR扩增，用异丙醇纯化法对PCR产物进行纯化；(4)点制芯片将上步所得PCR产物溶于点样稀释液中，再以点样仪将其按点样方案点制于点样基片上；点样完成的芯片置点样仪中进行水合、干燥，再经封闭液封闭、水冲洗、室温干燥后放4°C保存备用。
7.权利要求1所述烟草腺毛cDNA表达谱芯片在筛选烟草腺毛特异表达基因上的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤(1)RNA提取和纯化采用Trizol—步法分别提取烟草腺毛和去腺毛叶片总RNA ；(2)荧光探针标记逆转录标记cDNA探针并纯化，在一链合成中掺入荧光标记dCTP，用 Cy5-dCTP标记腺毛样品，Cy3-dCTP标记去腺毛叶片样品，同时进行反标，DNA纯化后真空抽干，备用；(3)芯片杂交(4)数据收集用激光扫描仪扫描杂交后的芯片，并对芯片所获得的原始信号进行整体校准和数据均一化处理，计算每个基因点在本试验中的表达差异值Rati0，Rati0 > 2. O为上调表达，Ratio ( 0. 5为下调表达，由此筛选出差异表达基因。
全文摘要
本发明涉及一种烟草腺毛cDNA表达谱芯片及其制备与应用。本发明通过分离烟草叶面腺毛，提取总RNA，构建烟草腺毛cDNA文库；对cDNA文库进行随机测序，获得烟草腺毛EST数据库，利用PCR扩增EST序列，制备出烟草腺毛cDNA表达谱芯片；该芯片对烟草腺毛和去腺毛叶片基因表达进行分析，获得腺毛中表达上调的ESTs，筛选出特异表达基因。本发明制备出的芯片具有高效、灵敏、高通量、高精确性、特异性强的优势，可一次检测大量基因的表达模式，并在在相同试验条件下，综合分析多个样品的基因表达变化规律，适用于烟草腺毛与栽培措施、环境胁迫等关系方面的研究。
文档编号C12Q1/68GK102154484SQ201110041870
公开日2011年8月17日 申请日期2011年2月22日 优先权日2011年2月22日
发明者冀浩, 刘国顺, 叶协锋, 崔红, 张松涛, 杨慧娟, 肖炳光, 靳超 申请人:河南农业大学