专利名称：与黄瓜单性花控制基因m紧密连锁的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，具体是与黄瓜单性花控制基因M紧密 连锁的分子标记。
背景技术：
黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(cucumis) —年 蔓生的草本植物，由于其多样的性型分化，在大量的生理学和遗传学的基础上，黄瓜已逐 渐成为研究植物性型分化的模式材料。常见的黄瓜品种是雌雄花独立着生的异花同株型 (monoecious)；不过某些品种也会出现两性花(hermaphrodite)。黄瓜单性花性状研究始 于1921年，一般认为单性花(不完全花，雌花或雄花)是黄瓜的野生性状，其对两性花(完 全花)性状具有显性作用。单性/两性花性状由M/m(monoecious)基因控制，其与黄瓜全 雌性控制基因F(female)共同作用，控制黄瓜的主要性型分化。由单性花(雌花)发育成的果实一般为长条状，瓜条长宽比较大，符合大众的食用 传统；由两性花发育成的果实为球形，因其不具有消费习惯优势，故在长期育种实践中培育 的品种较少。但有文献表明，两性花黄瓜品种具有明显高于单性花株的结实率；两性花株的 始座果节位也明显低于单性花株。这两方面的因素决定了两性花株的单株总产量要高于单 性花株。另外，也有报道称两性花株的生长速度快于单性花株。更为重要的是，单基因位点 决定性型分化是葫芦科甜瓜属(还包括甜瓜)所特有的表型。该基因位点的克隆和作用方 式的阐明将丰富植物性型决定机制。不难预见，如果以该基因作为工具，改造其它植物，特 别是在植物界绝大部分比例的自花授粉植物，将可能产生极大的经济和社会价值。对黄瓜单性花性型决定M基因分子水平的研究主要开始于2000年以后。有多 篇文献报告试图从基因的表达差异入手克隆该基因，但均没有获得满意的结果。2008年， Liu等和Li等利用不同的植物分离群体分别对M基因进行了分子标记定位，前者用一个 来源近等基因系亲本构建的96株F2群体将M基因定位在一个2. 5cM的遗传区间内；后 者使用两个栽培品种配置的约900株的F2群体将M基因定位在6. IcM的区间内，并发 现一个在该群体内与M基因共分离的标记S_ME8SA7。详细结果可以参看Liu，S. Q等在 ((Theoretical and AppliedGenetics))(理论应用遗传学)2008 年第 117 期 927-933 页发 表的题为《Genetic association ofETHYLENE-INSENSITIVE3-like sequence with the sex-determining M locus in cucumber (Cucumis sativus L.)〉〉(黄瓜性别决定 M 位点 与类乙烯响应基因ETHYLENE-INSENSITIVE3序列的遗传相关性)一文，以及Li，Z等在 ((Theoretical and Applied Genetics》(理论应用遗传学)2008 年第 117 期 1253-1260 页 发表的题为〈〈Development and fine mapping of threeco-dominant SCAR markers linked to the M/m gene in the cucumber plant (Cucumis sativusL.)》(三个与黄瓜 M/m 基因 连锁的共显性SCAR标记的开发及精细定位)一文。但上述标记还存在分析群体相对较小， 连锁距离相对较远等问题，还不足以克隆M基因位点的候选基因。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供与黄瓜单性花控制基因M紧密连锁 的分子标记。本发明的3个分子标记与M基因位点连锁更加紧密，对关于单性花/两性花 的黄瓜分子标记辅助育种体系的建立更有帮助；本发明的分子标记可以简便、快速、高通量 地应用于黄瓜育种实践。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及的第一种与黄瓜单性花基因M紧密连锁的分子标记，由序列表中SEQ IDN0. 1所示的223个核苷酸和SEQ ID NO. 2所示的221个核苷酸组成；其中223个核苷酸 的片段与单性花基因M连锁，221个核苷酸的片段与两性花基因m连锁。所述与黄瓜单性花基因M紧密连锁的分子标记，由SEQ ID NO. 7所示上游引物和 SEQ IDN0. 8所示的下游引物扩增得到。本发明涉及的第二种与黄瓜单性花基因M紧密连锁的分子标记，由序列表中SEQ IDN0. 3所示的155个核苷酸和SEQ ID NO. 4所示的157个核苷酸组成；其中155个核苷酸 的片段与单性花基因M连锁，157个核苷酸的片段与两性花基因m连锁。所述与黄瓜单性花基因M紧密连锁的分子标记，由SEQ ID NO. 9所示的上游引物 和SEQID NO. 10所示的下游引物扩增得到。本发明涉及的第三种与黄瓜单性花基因M紧密连锁的分子标记，由序列表中SEQ ID N0. 5所示的110个核苷酸和SEQ ID N0. 6所示的108个核苷酸组成；其中110个核苷 酸的片段与单性花基因M连锁，108个核苷酸的片段与两性花基因m连锁。所述与黄瓜单性花基因M紧密连锁的分子标记，由SEQ ID NO. 11所示的上游引物 和SEQID N0. 12所示的下游引物扩增得到。本发明利用单性花自交系亲本S52和两性花自交系亲本H34杂交获得F1代，F1植 株再自交获得较大的F2分离群体。随后利用标记S_ME8SA7筛选该扩大的群体，在该标记 和M/m基因位点间获得两个交换单株。同时利用该标记筛选黄瓜基因组细菌人工染色体 (BAC)文库，获得含有该标记片段的BAC克隆B78。该BAC克隆经末端测序获得两末端序 列，并利用B78克隆T7末端序列信息筛选BAC文库，获得了第二个BAC克隆B07。对克隆 B07进行鸟枪法测序并拼接后获得该克隆全长约80. 6kb序列，并利用该序列开发出SSR标 记R70。经连锁分析发现，R70也同S_ME8SA7 —样位于M基因位点同侧，但与M位点仅存 在1个交换单株。在此基础上，利用BAC克隆B07的一侧不与BAC克隆B78重叠的序列信 息筛选BAC文库，获得第三个独立的BAC克隆B58。仿照B07相同的方法获得了约100. 81Λ 的序列信息，并利用该序列开发出SSR标记R81和R84。经连锁分析，这两个标记相对于S_ ME8SA7均M基因位点的异侧，R81与M基因位点存在3个交换单株，而R84与M基因位点存 在两个交换单株。基于以上结果，在约2700单株分离群体中，本发明将M基因位点定位在 一个包含3个交换单株，约501Λ的黄瓜基因组区间内；上述黄瓜染色体步移的详细情况可 参看本发明说明书图5。本发明具有如下的有益效果本发明的3个分子标记与M基因的连锁程度在所有 已知的标记中最为紧密，由它们构建的局部遗传图谱密度极高，已将M基因限定在了一个 < Icm的遗传区间内；由于所有3个标记的开发均与BAC克隆相关，由此而获得的黄瓜M基 因局部物理图谱将有利于M基因的最终克隆。
本发明中涉及的分子标记S_ME8SA7已公开，可参看Li，Z等在《Theoretical and AppliedGenetics))(理论应用遗传学)2008年第117期1253 1260页发表的题为 ((Development and finemapping of three co-dominant SCAR markers linked to the M/ m gene in the cucumber plant (Cucumis sativus L.)》(三个与黄瓜 M/m 基因连锁的共 显性SCAR标记的开发及精细定位)一文；本发明中涉及的黄瓜基因组BAC文库的筛选操作已公开，可参看Guan，Y等 在《Progressof Natural Science》(自然科学进展)2OO8年第I8期143 14了页发 表白勺题为〈〈Construction ofa BAC library from cucumber (Cucumis sativus L.) and identification of linkage group specificclones》(黄瓜 BAC 文库的构建及连锁群特 异克隆的鉴定)一文；本发明中PCR产物克隆测序中所使用的E. coli DH5 α菌株已在文献《李欣，等。电 转化法制备高转化效率的Ε. coli感受态细胞研究。食品与生物技术学报，2007，26 (6) 48 51》中公开；本发明中涉及的Ε. coli DH5a菌株可通过公开市售的商业渠道取得，购于宝 生物工程(大连)有限公司，公司地址大连经济技术开发区东北二街19号。
图1是SSR标记R70对黄瓜亲本材料S52，H34，F1世代单株及在F2群体随机单株 的检测结果；图2是SSR标记R81对黄瓜亲本材料S52，H34，F1世代单株及在F2群体随机单株 的检测结果；图3是SSR标记R84对黄瓜亲本材料S52，H34，F1世代单株及在F2群体随机单株 的检测结果；图4是本发明中3个SSR标记与M基因位点的连锁情况；图5是本发明中黄瓜染色体步移的详细情况说明。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中涉及的鉴定SSR标记位点的ItepeatMasker软件可通过网址http //www. repeatmasker. org/ 免费下载；本发明中涉及的BAC克隆末端和鸟枪全测序由北京华大基因研究中心提供技术 服务，地址北京顺义空港科技创业园B-6 ；本发明涉及的其它常规测序(包括PCR产物直接测序和克隆测序)均由上海生工 生物工程技术服务有限公司提供技术支持，地址上海市松江区车墩工业区香闵路698号。实施例1步骤一，遗传分离群体的构建与交换单株的鉴定1. F2分离群体的构建
欧洲温室类型自交系H34 (父本)，两性花品种，正常生长条件下全株着生两性花， 植株生长速度较快，成熟果实成球型，深绿色；华南类型自交系S52 (母本)，单性花品种，植 株生长早期(较低节位)着生雄花，随后雄花雌花交替分布，生长后期(较高节位)完全 着生雌花，植株生长速度较慢，成熟果实长条状，白色；前述父本及母本材料均可通过公开 渠道获取。二者杂交获得F1子代，单性花株(强雌株)，果实长条状，墨绿色。自交系S52、 H34.F!子代和单性花株/两性花株判断标准，可参看Li，Z等在《Theoretical andApplied Genetics))(理论应用遗传学)2008年第117期1253 1260页发表的题为((Development and fine mapping ofthree co-dominant SCAR markers linked to the M/m gene in the cucumber plant (Cucumissativus L.)))(三个与黄瓜M/m基因连锁的共显性SCAR标记的 开发及精细定位)一文。本实施例利用F1代自交产生F2代群体。共种植约2700株&单 株，鉴定单性花株/两性花株，卡方分析法进行验证。2.交换单株的筛选①黄瓜基因组DNA的提取用CTAB法提取亲本及F2分离群体的叶片总DNA。方法为取上部幼嫩叶片在液 氮中快速研磨成粉末状，放于1. 5ml的离心管中；加入预热的500 μ 1 CTAB提取缓冲液， 60°C水浴0. Ih;加入等体积氯仿异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为M 1，混勻 后12000r/min 4°C离心IOmin ；将上清液转入新的离心管，加等体积异丙醇，轻轻混勻，冰 浴0. 5h以上；12000r/min4°C离心IOmin ；倒去上清液，用体积分数为70%的乙醇冲洗沉淀 两次，干燥后，加入TE缓冲液150 μ 1溶解后，加入10 μ g/ml的RNA酶去除RNA，37°C水浴 30min ；在0. 8%琼脂糖凝胶电泳，以50ng/ μ 1的λ DNA为标准，估计所得DNA的浓度；后用 TE稀释终浓度为30ng/ μ 1，存于_20°C备用。②标记扫描F2分离群体利用与已有的与M基因连锁的分子标记(S_ME8SA7)和本发明中开发的3个分子 标记(R70，R81，R84)扫描上述获得的F2分离群体，寻找标记基因型(通过分析显隐亲本 获得)与性状表现型(单性花/两性花)的差别单株，获得标记与M基因的交换单株。PCR 体系基因组 DNA 30ng，引物 0. 2ymol/L，200ymol/L dNTPs, 2mmol/L MgCl2, IXiTaq 缓冲 液，0. 5UTaqDNA聚合酶，总反应体系为10 μ L，其中TaqDNA聚合酶购于!Iomega公司。PCR 扩增程序为94°C 5min ；35cycles, 94°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。上述 PCR 产 物检测方法为标记S_ME8SA7使用3%琼脂糖凝胶电泳显示结果；其余(R70，R81，R84)PCR 产物使用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为1XTBE，50W恒功率，电泳lh。电泳后进行银染。 银染方法为将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动至指示剂颜色褪去，其中固 定液的组成为冰醋酸、无水乙醇、蒸馏水的体积比为1 10 100;用超纯水洗Imin 3min ；将冲洗后的胶板放入染色液中摇动半小时，其中染色液的组分为2g/L硝酸银；将染 色后的胶板放入超纯水中漂洗^后放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动至条带清晰， 放入自来水中冲洗aiiin;室温下干燥，干燥后拍照，其中显影液是在IL蒸馏水中加入15g NaOH和:3ml甲醛混勻得到的。③多态性片段的回收、克隆和测序将多态性片段从聚丙烯酰胺凝胶上切下，置于离心管中，用枪头捣碎，加入超纯水冲洗三遍，然后加入IOul超纯水95°C水浴15min，快速离心取上清液，用相对应的SRAP引 物进行PCR扩增，PCR反应体系为目标条带DNA 5ul，引物0. 5umol/L, 200umol/L dNTPs, 1 XTaqBuffer, 1. 5mmol/L MgCl2, 2U Taq DNA聚合酶，总反应体系为 50ul，其中 iTaqDNA聚合 酶购于 Promega 公司。目标条带 PCR扩增程序为-MV 5min ；35cycles, 94°C 30s ；50°C 30s ； 72°C Imin ；72°C 5min。将PCR产物中加入goldview荧光染料!3ul，4°C下放置IOmin让染 料同DNA结合，然后加入上样缓冲液2ul，混勻后通过1 %琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下 切下目标片段放入1. 5ml的离心管中，用DNA回收试剂盒回收，其中DNA回收试剂盒为上海 生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，产品号为Cat. No. SK1132。将回收产物与载体连接采 用上海申能博彩公司的PUCm-T vector系统。用电击法将连有目标片段的T-vector转化 进E. coliDH5 α感受态细胞，将菌液均勻涂布于LB固体培养基的平板上，涂好的平板倒置 于37°C培养箱培养过夜，挑菌、摇菌及PCR菌液检测，进行相关序列的测定。步骤二，染色体步移与标记开发1.黄瓜基因组BAC文库的扫描本发明中前后共使用3个PCR标记对黄瓜基因组BAC文库进行扫描筛选，分别为 利用先前报道的标记S_ME8SA7扫描BAC文库获得含有该片段的克隆B78 ；利用B78克隆T7 端序列信息设计PCR扩增片段扫描文库获得另一个含有该片段信息的克隆B07 ；利用B07 克隆T7端序列信息设计PCR扩增片段扫描文库获得另一个含有该片段信息的克隆B58。 所有PCR反应体系均为BAC文库质粒20ng，双向引物各0. 2ymol/L，200ymol/L dNTPs, 2mmol/LMgCl2，lXTaq缓冲液，0. 5U TaqDNA聚合酶，总反应体系为10μ 1，其中TaqDNA聚 合酶购于 Promega 公司。扩增程序为94°C 3min ；40cycles, 94°C 20s, 65°C 30s, 72°C 30s ； 72°C 5min, 1. 5%琼脂糖凝胶电泳显示结果。2.遗传分子标记的开发本发明对获得的第二个BAC克隆B07进行了全长测序，根据序列信息，本发明寻找 到3个潜在的SSR位点，并设计引物在两亲本间进行PCR扩增并使用6%变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳检测。发现其中1个SSR位点在两亲本间可以产生差异(图1)，随后对其进行测序 并获得SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2中的序列信息，该标记命名为R70。本发明对获得的第三个BAC克隆B58进行了全长测序，根据序列信息，本发明寻找 到5个潜在的SSR位点，并设计引物在两亲本间进行PCR扩增并使用6 %变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳检测。发现其中2个SSR位点在两亲本间可以产生差异(图2，图幻，随后对其进行 测序并获得SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4及SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6中的序列信息， 这两个标记分别被命名为R81和R84。以上3个新开发的分子标记经过分离群体验证，均与M基因位点紧密连锁(图4， 图中X表示交换事件)。由于都是特异性PCR扩增，故这些标记具有高稳定。利用这些标记 构建的高密度遗传和物理图谱，将有助于黄瓜单性花基因的最终克隆。
权利要求
1.一种与黄瓜单性花基因M紧密连锁的分子标记，其特征在于，由序列表中SEQ ID NO. 5所示的108个核苷酸和SEQ ID NO. 6所示的110个核苷酸组成。
2.根据权利要求1所述的与黄瓜单性花基因M紧密连锁的分子标记，其特征是，SEQ IDN0. 5所示的108个核苷酸的片段与单性花基因M连锁。
3.根据权利要求1所述的与黄瓜单性花基因M紧密连锁的分子标记，其特征是，SEQ IDN0. 6所示的110个核苷酸的片段与两性花基因m连锁。
4.根据权利要求1所述的与黄瓜单性花基因M紧密连锁的分子标记，其特征是，由 SEQID NO. 11所示的上游引物和SEQ ID NO. 12所示的下游引物扩增得到。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域的与黄瓜单性花控制基因M紧密连锁的分子标记，第一种分子标记由序列表中SEQ ID NO.1所示的223个核苷酸和SEQ ID NO.2所示的221个核苷酸组成；第二种分子标记由序列表中SEQ ID NO.3所示的155个核苷酸和SEQ ID NO.4所示的157个核苷酸组成；第三种分子标记由序列表中SEQ ID NO.5所示的110个核苷酸和SEQ ID NO.6所示的108个核苷酸组成。本发明的3个分子标记与M基因位点连锁更加紧密，对关于单性花/两性花的黄瓜分子标记辅助育种体系的建立更有帮助；本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于黄瓜育种实践。
文档编号C12N15/11GK102140456SQ201110042638
公开日2011年8月3日 申请日期2009年5月14日 优先权日2009年5月14日
发明者何欢乐, 李征, 潘俊松, 蔡润, 陶倩怡 申请人:上海交通大学