专利名称：一种编码木糖异构酶的核酸分子及其编码的木糖异构酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的编码木糖异构酶的核酸分子及其编码的木糖异构酶。本发明涉及木糖异构酶酶学性质的研究。本发明涉及木糖异构酶在酶基因工程技术领域的应用。 本发明还涉及用编码木糖异构酶的核酸序列转化的宿主细胞。
背景技术：
石油价格的持续上涨和温室效应引起的全球变暖，使得人们越来越重视可再生能源的开发和利用。生物质能便是一种重要的可再生能源，以生物质为原料生产燃料乙醇具有广阔的发展空间。长期以来，人们利用淀粉和糖类发酵生产乙醇。这些原料成本较高，大大限制了生物质燃料乙醇产业的发展。在全球每年光合作用生产的高达1500亿吨 2000 亿吨的生物质中80%以上为木质纤维素类物质，它十分廉价且容易获得，因此以木质纤维素为原料生产燃料乙醇，具有重要的实践意义。木质纤维素是纤维素、半纤维素和木质素等的聚合物。利用酸解或酶解的方法可将木质纤维素转化为大量的五碳糖(木糖和阿拉伯糖)和六碳糖(葡萄糖、半乳糖和甘露糖)。木糖在大多数木质纤维素水解物中是含量仅次于葡萄糖的一种单糖，可达30 %。分析表明，充分利用木质纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇能使乙醇产量在原有基础上提高25% (Nigam et al.，J Appl Microbiol, 2001,90 (2) 208-21 。但是，大部分能够进行乙醇发酵的酿酒酵母(Saccharomyce cerevisise)不能够以木糖作为碳源。所以，如何通过对已有菌株进行改造使其能高效利用木糖产乙醇已成为使木质纤维素资源得以充分利用的关键问题之一。自然界利用木糖的酵母菌同化木糖的最初两步反应是在木糖还原酶(xylose reductase, XR)及木糖醇脱氢酶(xylitoldehydrogenase，XDH)催化下完成的。木糖首先在)(R的催化下，还原成木糖醇，随后由》)H氧化成木酮糖(Tdff et al.，Appl Environ Microbiol,2001,67 :5668-5674)。在大多数细菌，如 E. coli 和 Bacillus 等中，木糖通过木糖异构酶(XI)直接转化为木酮糖(Tdffet al.，Appl Environ Microbiol, 2001,67 5668-5674)。然后，木酮糖在木酮糖激酶(XK)的作用下转变成5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖途径。酿酒酵母(Saccharomyce cerevisise)具有高的酒精产量和产率，对抑制因子以及发酵过程中的不利因素的高耐受性，对高浓度酒精的耐受以及非致病性等优良特性。但由于缺乏木糖代谢的最初两个酶)(R和》)H而不能代谢木糖。为了使酿酒酵母具有发酵木糖的能力，将依赖NAD⑵H的)(R及依赖NAD+的毕赤酵母)(DH克隆到其中，得到能够发酵木糖生产酒精的重组菌(Walfridsson et al. ,Appl Environ Microbiol, 1995,61 :4184-4190 ； Sedlak et al.，Appl Biochem Biotechnol，2004，113-116 :403-416)。但同时带来的问题是:)(R对NADPH的亲和性远远大于NADH，这就导致在)(DH催化的木糖醇氧化成木酮糖的过程中，辅因子的不平衡，其直接后果就是副产物木糖醇的积累和甘油等的生成，从而影响终产物酒精的产量。木糖异构酶因不需要辅助因子，因此它再次受到研究者们的注意(Kuyper et al. , FEMS Yeast Research,2004，4 :655-664)。木糖异构酶(Xylose isomerase，XI) (EC5. 3. 1. 5)可以催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，微生物体内的糖代谢工程起着重要的作用；在体外亦能催化D-葡萄糖到 D-果糖的异构化反应，所以又称为葡萄糖异构酶。在基础研究方面，由于该酶的结构非常稳定，是研究蛋白质结构与功能关系较好的模型之一(Bhosale et al. , Protein Eng Des Sel, 12004,17(12) :861-869)。更重要的是，木糖异构酶所具有的极其重要的工业应用价值，使它和蛋白酶及淀粉酶并称为重要的工业用酶(田沈等微生物学通报，2007,34 ) 355-358 ；Bhosale et al. ,Microbiol Rev, 1996,60(2) :280-300)而引起科学家们的关注， 并对其开展了较为广泛的研究。从上个世纪70年代以来，木糖异构酶的应用主要集中在高果糖浆生产和燃料乙醇产生两个方面。然而，近几年，科学家研究发现，在一定条件下木糖异构酶可以转化生产许多制药工业重要的原料稀有糖，如核糖、甘露糖、阿拉伯糖、来苏糖等(Karimaki et al. ,Protein Eng Des Se，12004，17 (12) :861-869)。这些发现为木糖异构酶的研究注入新的活力。据报道，虽然多种细菌来源的木糖异构酶基因都曾被插入到酿酒酵母中，但是常见嗜温性原核生物的XI在酿酒酵母中不能表达有活性的XI。在目前已公布的约450个木糖异构酶氨基酸序列中，两种来自嗜热细菌的XI在酿酒酵母中表达产物在 85°C下具有lU/mg的木糖异构酶特异活性，但是，在酿酒酵母的生理温度(30°C)仅仅保留这种活性的极少部分。其他来源的能够在酿酒酵母中活性表达的木糖异构酶基因来源包括真菌 Piromyces sp-E2, Orpinomyces sp-Ukkl, Cyllamyces aberensis 禾口细菌 Clostridium phytofermentans, Clostridium difficile, Bacteroides fragilis, Fusobacterium-mortiferum及 Ciona intestinalis。其中，仅仅有真菌 Piromyces sp_E2, 细菌Clostridium phytofermentans来源的木糖异构酶在酿酒酵母中得到较高活性表达， 尤其是前者的活性更高。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种新来源的嗜温性木糖异构酶，及编码该酶的基因，以及表达该酶的宿主细胞。本发明是通过以下技术方案实现的一种编码木糖异构酶的核酸分子，其序列为以下核苷酸序列之一(I)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；(2) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个核苷酸的具有至少40%序列一致性的同源序列；(3)在严格条件下，与(1)或O)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(4)由于遗传密码子的简并性区别于(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。一种木糖异构酶，其序列为以下氨基酸序列之一(I)SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列；(2) SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个氨基酸的具有至少40%序列一致性的同源序列。本发明的编码木糖异构酶的核苷酸编码的氨基酸不包括选自以下各组的氨基酸序列(I)Piromyces sp_E2木糖异构酶在WO 03/062340中公开的序列；
(2)Bacteroides thetaiotaomicron 木糖异构酶在 WO 04/099381 和 WO 06/009434中公开的序列；(3) Cyllamyces aberensis 木糖异构酶在 WO 04/099381 中公开的序列；(4) Orpinomyces sp-Ukkl 木糖异构酶在 Madhavan et al. (2008，supra)中公开的序列；(5)Clostridium difficile,Fusobacterium-mortiferum及Ciona intestinalis 的木糖异构酶在WO 2010/074577中公开的序列。本发明的编码木糖异构酶的核苷酸编码的氨基酸序列，其序列不包括选自以下各组的氨基酸序列序列一致性高于选自以下各组的氨基酸序列的99，98，97，96，95，94，93， 92，91，90，89，88，87，86，85，84，83，82，81，80，79，78，77，76，75，74，73，72，71 或 70 % 的氨
基酸序列。(I)Piromyces sp_E2木糖异构酶在WO 03/062340中公开的序列；(2)Bacteroides thetaiotaomicron 木糖异构酶在 WO 04/099381 和 WO 06/009434中公开的序列；(3) Cyllamyces aberensis 木糖异构酶在 WO 04/099381 中公开的序列；(4) Orpinomyces sp-Ukkl 木糖异构酶在 Madhavan et al. (2008，supra)中公开的序列；(5)Clostridium difficile,Fusobacterium-mortiferum及Ciona intestinalis 的木糖异构酶在WO 2010/074577中公开的序列。所述木糖异构酶在化工、食品和医疗等领域的应用。本发明的木糖异构酶具有的极其重要的工业应用价值，其应用主要集中在高果糖浆生产和燃料乙醇产生两个方面。在一定条件下木糖异构酶还可以转化生产许多制药工业重要的原料稀有糖，如核糖、甘露糖、阿拉伯糖、来苏糖等。在基础研究方面，由于该酶的结构非常稳定，是研究蛋白质结构与功能关系较好的模型之一。一种重组载体，其含上述的编码木糖异构酶的核酸分子的完整编码阅读框序列。一种重组细胞，其宿主细胞为细菌、酵母或丝状真菌，优选具有厌氧乙醇发酵能力的酵母；宿主细胞内含有上述的重组载体，编码木糖异构酶的核苷酸序列被可操作地连接于宿主细胞中引起木糖异构酶充分表达的启动子，从而赋予了宿主胞将木糖异构化木酮糖的能力。所述宿主细胞优选含有主动糖酵解、戊糖磷酸途径和含有木酮糖激酶活性使得从木糖异构得到的木酮糖可以被代谢为丙酮酸的宿主细胞。所述宿主细胞优选含有将丙酮酸转化为期望的分解代谢物如乙醇、乙烯或乳酸的酶的宿主细胞。所述宿主细胞优选具有厌氧乙醇发酵能力的酵母；所述宿主细胞还优选对乙醇和有机酸如乙酸、乳酸或蚁酸及糖分解代谢物如糠醛和羟甲基糠醛具有耐受能力的宿主细胞。上述宿主细胞的这些特征或活性之一可以是天然存在于宿主细胞或通过遗传修饰被引入或改进。所述宿主细胞包含一种遗传修饰，该遗传修饰降低非特异性醛糖还原酶活性。
所述宿主细胞具有将L-阿拉伯糖转化为D-木酮糖5-磷酸的能力。所述宿主细胞包含一种或多种遗传修饰，该遗传修饰产生选自如下一组的特征(1)增加木糖转运到宿主细胞内；(2)木酮糖激酶活性增强；(3)戊糖磷酸途径的流量增加；(4)对分解代谢物阻遏的敏感性降低；(5)对乙醇、渗透性或有机酸的耐受力增强；(6)副产物生成下降；(7)细胞电子链传递和氧化呼吸链阻断。所述副产物被理解为是指含碳分子而不是期望的发酵产物，包括如木糖醇、甘油或乙酸。所述遗传修饰由过度表达内源基因、表达异源基因或其组合组成，且所述基因选自下列基因己糖或戊糖转运蛋白基因、木酮糖激酶基因、来自戊糖磷酸途径的酶的基因、 糖酵解酶的基因或/和乙醇发酵相关的酶的基因。所述宿主细胞表达一种或多种酶，所述的酶赋予宿主细胞产生乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或/和头孢菌素等系列代谢产物的能力。一种利用上述重组细胞生产发酵产物的方法宿主细胞发酵含有木糖原料或/和葡萄糖原料的培养基，然后分离纯化发酵产物，所述发酵产物为乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β -内酰胺抗生素或/和头孢菌素。上述被转化的宿主细胞异构木糖为木酮糖的能力是直接将木糖异构化为木酮糖， 不同于木糖通过木糖醇过度两步转化为木酮糖，其分别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化。本发明的编码木糖异构酶的核苷酸序列以活性形式在被转化的宿主细胞中表达， 因此，核苷酸序列在宿主细胞中表达生成具有特定活性的木糖异构酶。在被转化的宿主细胞中表达的木糖异构酶特异性活性在此定义为宿主细胞的无细胞溶解产物如酵母的无细胞溶解产物中的每mg蛋白的木糖异构酶活性单位量。木糖异构酶活性的确定、蛋白含量和无细胞溶解产物的制备在下述实施例2中描述。新木糖异构酶在酿酒酵母中高活性表达。 30°C下，采用 XI-SDH—步法测定木糖异构酶酶活(Kuyper et al. ,FEMS Yeast Research, 2003，4 :69-78)，该酶酶活为1. 3U/mg，高于Piromyces sp_E2来源的木糖异构酶酶活1. IU/ mg (Kuyper et al. ,FEMS Yeast Research，2003，4 :69-78)。但是新来源的木糖异构酶是一种嗜温性木糖异构酶，最适酶活温度在60°C (图3)。
图1 验证重组细胞中含有木糖异构酶基因RuXI。以反提重组酵母质粒为模板，特异性引物 BamHI-GXI-F，SbfI-GXI-R(表 1)扩增 RuXI。M Marker，IkbDNA ladder 1 =RuXI ；图2 验证重组细胞中含有木糖异构酶基因RuXI。将反提质粒反转到大肠杆菌 DH5a 中，提取质粒，BamHI 和 Sbf I 双酶切验证结果。M :Marker，IkbDNA ladder 1 约 1. 3kb 为RuXI，约61Λ的为线性载体PJFE3 ；
图3 酿酒酵母转化子的新木糖异构酶最适酶活温度测定；图4 酿酒酵母转化子在含有20g/L葡萄糖、20g/L木糖作为碳源的培养基中的生长曲线；图5 酿酒酵母转化子在含有20g/L木糖作为唯一碳源的培养基中的生长曲线；图6 酿酒酵母转化子在含有20g/L木糖作为唯一碳源的培养基中的限氧乙醇发酵结果分析。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1克隆来自牛瘤胃液宏基因组文库的木糖异构酶的DNA序列木糖异构酶保守区域间的部分糖异构酶的DNA序列的克隆以构建好的牛瘤胃液宏基因组文库为模板，以简并引物XIcF和XIcR(表1)为引物，PCR扩增，得到大约400bp的片段，将清晰的条带纯化并连接到T载体上，任意挑取22个采用通用引物验证的克隆送去测序。测序结果表明22个克隆的DNA插入片段的序列全属于木糖异构酶的特有序列。其中21个克隆的DNA插入片段的序列为大肠杆菌的木糖异构酶基因保守序列，只有一个克隆的DNA插入片段属于新来源的木糖异构酶基因保守序列。该片段命名为2PXI-3，374bp。表1所用的引物序列
权利要求
1.一种编码木糖异构酶的核酸分子，其特征在于，其序列为以下核苷酸序列之一(1)SEQID NO. 1所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个核苷酸的具有至少40%序列一致性的同源序列；(3)在严格条件下，与(1)或O)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(4)由于遗传密码子的简并性区别于(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。
2.一种木糖异构酶，其特征在于，其序列为以下氨基酸序列之一(1)SEQID NO. 2所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个氨基酸的具有至少40%序列一致性的同源序列。
3.—种重组载体，其特征在于所述重组载体含有权利要求1所述的编码木糖异构酶的核酸分子的完整编码阅读框序列。
4.一种重组细胞，其特征在于所述宿主细胞为细菌、酵母或丝状真菌，宿主细胞内含有权利要求3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于所述宿主细胞包含一种遗传修饰，该遗传修饰降低非特异性醛糖还原酶活性。
6.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于所述宿主细胞包含一种或多种遗传修饰，该遗传修饰产生选自如下一组的特征(1)增加木糖转运到宿主细胞内；(2)木酮糖激酶活性增强；(3)戊糖磷酸途径的流量增加；(4)对分解代谢物阻遏的敏感性降低；(5)对乙醇、渗透性或有机酸的耐受力增强；(6)副产物生成下降；(7)细胞电子链传递和氧化呼吸链阻断。
7.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于所述遗传修饰由过度表达内源基因、 表达异源基因或其组合组成，且所述基因选自下列基因己糖或戊糖转运蛋白基因、木酮糖激酶基因、来自戊糖磷酸途径的酶的基因、糖酵解酶的基因或/和乙醇发酵相关的酶的基因。
8.根据权利要求5、6或7所述的重组细胞，其特征在于所述宿主细胞表达一种或多种酶，所述的酶赋予宿主细胞产生乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β 一内酰胺抗生素或/和头孢菌素的能力。
9.利用权利要求8所述的重组细胞生产发酵产物的方法，其特征在于所述宿主细胞发酵含有木糖原料或/和葡萄糖原料的培养基，然后分离纯化发酵产物，所述发酵产物为乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β —内酰胺抗生素或/和头孢菌素。
10.权利要求2所述的木糖异构酶在燃料乙醇生产或高果糖浆生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了从牛瘤胃液宏基因组文库中获得的一种新的木糖异构酶核苷酸序列，还提供了该核苷酸序列编码的氨基酸序列。本发明还涉及含有该核苷酸序列的载体及转化体。当该木糖异构酶被表达时，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力，木酮糖进一步被宿主细胞代谢。因此，宿主细胞能够以木糖作为碳源生长。新来源的木糖异构酶在酿酒酵母内高活性表达，且该酶为嗜温性酶，最适酶活温度为60℃。本发明还涉及木糖异构酶可作为模式蛋白在理论研究上的应用，及在燃料乙醇、高果糖浆等实际生产上的应用。
文档编号C12P7/20GK102174549SQ201110042170
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月22日 优先权日2011年2月22日
发明者沈煜, 葛瑞蕾, 鲍晓明 申请人:山东大学