专利名称：：一种木糖异构酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种木糖异构酶及其编码基因与应用，属酶基因工程
技术领域：
。技术背景木糖异构酶(D-XyloseIsomerase，XI)在体内催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，在体外催化六碳糖D-葡萄糖转化为D-果糖的异构化反应，又称葡萄糖异构酶(GlucoseIsomerase,GI)，广泛存在于细菌、少部分真菌中。木质纤维素(lignocelluiosic)是地球上最丰富的可再生资源，主要存在于农副产品及林产业的木质废弃物中。其主要成分为纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)及木质素(lignin)。纤维素是由葡萄糖残基经P-1，4糖苷键连接成的不分支结晶状多聚体；半纤维素是包括木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等多种五碳糖为主的非结晶异质多聚体，其中木糖含量在不同原料中占6%—28%，仅次于葡萄糖含量。可逆的木糖异构化反应把木糖异构化成木酮糖，木酮糖进入三羧酸循环，发酵生产乙醇。此外，葡萄糖异构化反应是工业上大规模以淀粉制备高果糖浆(highfructosecornsyr叩，HFCS)的关键反应。多种来源的木糖异构酶基因被克隆表达，如^5c力en'c^acoh'，5aci"wssw力ti7is，7Tei7Z7(9tc^sspecies,5Yre/^o历yces1species,Jct/nOjO/aoes/M'ssof/riensis,77&n/7ixsspecies和/Jrt力ro/wcterspecies等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株——酿酒酵母(&cc力aro//cescew'Wae)中得到活性表达，而且，在3(TC左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤，因此新型木糖异构酶的开发和酶分子改造十分必要。中温型细菌纤维堆囊菌(6br朋^'"ace77"A^"历)，是粘细菌中唯一能降解纤维素的菌种，在土壤中广泛分布。XceW"A^譜能够在隐含有结晶纤维素(如滤纸)或木聚糖的简单无机盐平板上生长并能有效地降解大分子底物。前期工作中，我们克隆了5:cf^/""s"历的木糖异构酶基因^J^4，其在酿酒酵母中能够表现出活性，但比酶活不够高，因而有必要进行进一步的改造。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种木糖异构酶及其编码基因与应用。一种编码木糖异构酶的DNA序列，它是在纤维堆囊菌(5br朋giw迈ce〃"7os鹏)157-2中的木糖异构酶基因(GenebankEU643621)的53位由C突变为T;219位由C突变为A;243位由G突变为A;265位由A突变为G;437位由G突变为T;503位由T突变为A;596位由G突变为A;635位由A突变为T;755位由A突变为G;914位由G突变为T;930位由C突变为T;1006位由G突变为A;1175位由G突变为A;1255位由A突变为G。一种编码木糖异构酶的DNA序列，基因序列如下atgaccgtcgtgattggaaacaaagggtacttccccggtgtcggcaagatcctctacgag604<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>1329。一种木糖异构酶，它是在纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)157-2中的木糖异构酶基因xylA编码的多肽(GenebankACC99633)的突变酶，与突变前比较，有十二个位点的氨基酸残基发生了变化，它包括18位由P突变为L、73位由F突变为L、89位由T突变为A、146位由G突变为V、168位由V突变为E、199位由G突变为D、212位由K突变为M、252位由D突变为G、305位由R突变为L、336位由G突变为R、392位由R突变为H以及419位由N突变为D。种木糖异构酶，氨基酸序列如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>GGEVKLTSGQQELYENIVNRWIR443。本发明还保护含有上述DM片段的基因载体。本发明还保护含有上述基因载体的转化细胞。上述木糖异构酶、DNA序列、基因载体和转化细胞在化工、食品、医药领域的应用。本发明提供的木糖异构酶基因ffi^W是从纤维堆囊菌(5bra/7&譜ce"Wo^/顶)157-2中克隆得到木糖异构酶基因义/"(GenebankEU643621),然后通过易错PCR同DNA改组相结合的体外分子定向进化技术引入突变点，筛选获得，具体步骤如下1、目的基因的获得(1)从纤维堆囊菌(&ra;^j7朋ce""hs鹏)157-2中提取总DNA-收集O.lg菌体，加入O.75mLGTE缓冲液(25%蔗糖，50隨I/LTris-HC1，100mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0)和适量玻璃珠，漩涡振荡，充分混匀菌体。转移菌体至5mL的离心管中，补加0.5mLGTE，漩涡振荡器混匀后加入10%SDS(十二烷基磺酸钠)150uL，20mg/raL的蛋G酶K15yL，充分混匀，37'C保温1h。期间每隔一定时间颠倒混匀。加0.25mL5mol/LNaCl，混匀后静置10min，然后加0.25mLCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)/NaCl(10%CTAB/0.7mol/LNaCl)，混匀，65。C保温20min(CTAB事先放入65。C水浴中保温)。等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提两次，轻混30min左右5000g离心10min，上清转移至新管。加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置10idn，10000g离心10min，加入70°/。乙醇洗涤，室温千燥20min，加入20f)wLTE，一2(TC保存。(2)根据纤维堆囊菌157-2木糖异构酶基因开放式阅读框(0RF)设计扩增引物引物l:5'-ATCGAGATCTATGACCGTCGTGATTGGA-3'引物2:5'-TTCGGAGCTCTTACCGGATCCACCGATT-3';以步骤(1)中获得的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94'C变性2min;94。C变性lmin;62t:退火lmin;72'C延伸90sec;反应进行30个循环，最后一个循环延伸时间为5min。PCR反应体系中，dATP浓度为0.2mmol/L，dGTP浓度为0.2mmol/L，dTTP浓度为1mmol/L，dCTP浓度为l咖ol/L，MgCL浓度为7mmol/L，MnCl2为浓度0.3咖ol/L。经回收纯化后，用终浓度为0.01U/uL的DNAaesI处理总量约5yg的DM，15。C处理4一5min后立即置于8(TC下灭活10min，得DNA小片段。(3)将歩骤(2)获得的DNA小片段在2wty。的琼脂糖凝胶中电泳，回收100-200bp之间的DNA片段，并放入没有引物的PCR体系中，进行DNA片段重组反应。(4)以步骤(3)获得的重组反应产物为模板，以步骤(2)提供的引物l，引物2为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为94。C变性2min;94。C变性lmin;62。C退火lmin;72°C延伸90sec;反应进行30个循环，最后一个循环延伸时间为5min。获得的PCR产物电泳后回收1.4kb附近的条带，得目的基因。ii、目的基因的表达(1)将目的基因的提取步骤中获得的目的基因以i^jn、^cl酶切，采取定向连接技术与经过万WII、5"s6'I酶酶切处理的质粒载体pYPX251(GenBankAY]78046)定向连接，构建木糖异构酶基因突变文库；(2)将步骤(1)获得的木糖异构酶基因突变文库转化大肠杆菌HB101(ATCC33694);并涂布在以木糖为唯一碳源的加有50呢/L氨苄素的M9平板上，经过2040小时的培养，平板上出现单菌落；依据菌落大小进行初筛，选择菌落较大菌落；所述的固体M9培养基具体配方为NH4C15g/L，Na2HP0430g/L，KH2P0415g/L，NaCl2.5g/L，MgS04.7H200.25g/L，木糖20g/L，琼脂15g/L。(3)从步骤(2)筛选到的较大菌落中，通过如下方式进行酶液的提取，37'C下在LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0)中培养较大菌落1012小时至对数期，8000转离心5min收集菌体，用0.9%NaCl洗涤两次，然后溶于新配制的裂解缓冲液(lmMPMSF，50mmol/LTris-HCl，pH7.0)，加入适量玻璃珠(直径O.5mm)，在细胞破碎仪最大速度下处理3050s，冰浴5min，破碎重复35次，10000g离心10min，收集上清，即为酶液。对上述酶液的酶活进行测定700臓ol/LD-木糖，0.01-0.025U木糖异构酶，含10mmol/LMnCl2的50mmol/LTris-HClpH7.0缓冲液中，分别在45。C反应20min，加入150叱50%三氯乙酸终止反应和185pL2MNa2C03中和反应缓冲液。取O.5mL加入0.04USDH(山梨醇脱氢酶，sigma公司)和O.15mMNADH(还原型烟胺酸腺嘌呤二核苷酸)，立即混匀，在340nm下检测NADH被氧化的量(即在340nm做时间扫描)。根据标准曲线求得木酮糖量。木糖异构酶(XI)的一个比活力单位(U/mg)定义为每mg酶蛋白每分钟转化底物的uraol/L数。通过酶活测定进行复筛获得一株突变体，提取其质粒，对^F^J部分测序，测序的结果是SEQNO.l所示的序列(历xyZ4),编码SEQN0.2所示的多肽，即得木糖异构酶。本发明提供的木糖异构酶基因孤^W是从纤维堆囊菌(5br朋gi"/"ce77"7o6Wfl)157-2中克隆得到木糖异构酶基因(GenebankEU643621)，然后通过易错PCR同DNA改组相结合的体外分子定向进化技术引入突变点，筛选获得。其具有SEQNO.l所示的核苷酸序列，ORF长为1329bp，编码443个氨基酸的蛋白(SEQNO.2)。与GenebankEU643621比较，它包括53位C—T;219位C—A;243位G—A;265位A—G;437位G—T;503位T—A;596位G—A;635位A—T;755位A—G;914位G—T;930位C—T;1006位G—A;1175位G—A;1255位A—G。本发明涉及的DNA序列，除了SEQNO.1所示的核苷酸序列以外还应当包括与SEQNO.1互补的序列、因密码子的简并性引起的能够编码本发明涉及的突变的木糖异构酶(SEQNO.2)的其他DNA序列以及以上各个位置的点突变的各种组合。本发明提供新的多肽，其含有上述核苷酸序列所编码的氨基酸序列，即含有SEQN0.2所示的序列，编码蛋白为突变的纤维堆囊菌(5bra/^i鹏ceW"7os"/ff)木糖异构酶(Sl)。此多肽与基因义y"编码的多肽(GenebankACC99633)比较，有十二个位点的氨基酸残基发生了变化，它包括P18-L、F73-L、T89-A、G146-V、V168-E、G199-D、K212-M、D252-G、R305-L、G336-R、R392-H以及N419-D。本发明涉及的多肽序列也包括以上各个位置的点突变的各种组合。本发明所述木糖异构酶比传统木糖异构酶的优点如下一种中温的可以在酿酒酵母中表达出活性的木糖异构酶，在酿酒酵母可耐受的生长温度条件下仍能够表现出较高的活性，并且，经过本发明涉及的突变，其在酿酒酵母中的活性比突变前提高了2.8倍。图1本发明所述木糖异构酶基因突变文库的构建流程图；图2本发明所述木糖异构酶的最适pH;图3重组载体pHX-Sl/pHX-SXI的构建图。具体实施方式实施例1本发明提供的木糖异构酶基因孤7"是从纤维堆囊菌(5br朋gi咖ceWwios"历)157-2中克隆得到木糖异构酶基因义/"(GenebankEU643621)，然后通过易错PCR同DNA改组相结合的体外分子定向进化技术引入突变点，筛选获得，具体步骤如卜(1)从纤维堆囊菌(5bra/^i"ffl"Wu/o5mb)157-2中提取总DNA:收集O.lg菌体，加入O.75mLGTE缓冲液(25%蔗糖，50mmol/LTris-Cl，100画1/LEDTA，PH8.0)和适量玻璃珠，漩涡振荡，充分混匀菌体。转移菌体至5mL的离心管中，补加O.5mLGTE，漩涡振荡器混匀后加入10%SDS150uL，20mgAnL的蛋白酶K15uL，充分混匀，37"C保温1h。期间每隔一定时间颠倒混匀。加0.25mL5mol/LNaCl，混匀后静置10min，然后加0.25mLCTAB/NaCl(10%CTAB/0.7mol/LNaCl)，混匀，65。C保温20min(CTAB事先放入65'C水浴中保温)。等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提两次，轻混30min左右5000g离心10min，上清转移至新管。加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置10min，10000g离心10min，加入70%乙醇洗涤，室温T燥20min，加入200yLTE，一20。C保存。(2)根据纤维堆囊菌157-2木糖异构酶基因0RF设计扩增引物引物l:5'-ATCGAGATCTATGACCGTCGTGATTGGA-3'引物2:5'-TTCGGAGCTCTTACCGGATCCACCGATT-3'。(3)利用步骤(2)中提供的引物l，引物2和TaqDNA合成酶，以歩骤(1)中获得的纤维堆囊菌(5bra，'"/ceW〃7。遍)总DNA为模板，在含有0.2mmol/L的dATP，0.2mmol/L的dGTP，l誦ol/L的dTTP，lmmol/L的dCTP，7ramol/L的MgC丄"0.3mmol/L的MnCl"其他均为正常条件的PCR反应体系下进行PCR扩增。(4)将多个独立的步骤(3)中反应体系获得的PCR产物分别回收纯化，然后等量混匀，用终浓度为0.01L:/yL的DNAaesI处理总量约5ug的DIVA，15。C处理4m30s后立即置于8CTC下火活10min。(5)将歩骤(4)获得的DNA小片段在2%的琼脂糖凝胶中电泳，回收100-200bp之间小片段，在没有引物的体系中以溶解的DNA小片段为模板进行类似PCR样的DNA片段重组反应。(6)以歩骤(5)获得的重组反应产物为模板，以步骤(2)提供的引物l，引物2为引物，进行PCR扩增。(7)步骤(6)获得的PCR产物电泳后回收1.4kb附近的条带。(8)将步骤(7)获得的片段以5^/11、5"scl酶切，采取定向连接策略与同样酶切处理的质粒载体pYPX251(GenBankAY178046)定向连接，构建木糖异构酶基因突变文库(图l)。(9)步骤(7)获得的木糖异构酶基因突变文库转化大肠杆菌HB101(ATCC33694)，大肠杆菌HB101遗传特性为《//祝4,/asy/520(iV岛-),rec/113,arrl4'prM2，7况'n,^Jffi,，风5,加7-1,2e我tM-l。(10)步骤(9)转化后的菌液涂布在以木糖为唯一碳源的加有50mg/L氨苄素的M9平板上，经过2040小时的培养，平板上出现单菌落。依据菌落大小进行初筛，选择菌落较大的进行下一轮复筛。所用到的固体M9培养基具体配方为NH4C15g/L，Na2HP0430g/L，KH2P0415g/L，NaCl2.5g/L,MgS04.7H200.25g/L，木糖20g/L，琼脂15g/L。(11)从步骤(10)筛选突变体，37'C下在LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10gZL,pH7.0)中培养重组菌1012小时至对数期，8000转离心5min收集菌体，用0.9%NaCl洗涤两次，然后溶于新配制的裂解缓冲液(lmMPMSF，50咖ol/LTris-Cl,pH7.0)，加入适量玻璃珠(直径0.5mra)，在细胞破碎仪最大速度下处理3050s，冰浴5min。破碎重复35次。10000g离心10min,收集上清，即为粗酶液；采用XI-SDI1方法测定酶活力，步骤如下将700誦ol/LD-木糖，0,01-0.025U木糖异构酶，含10mmol/LMnCl2的50mntol/LTris-HClpH7.0缓冲液中，分别在45°C反应20min，加入150yL50%二氯乙酸终止反应和2MN载中和反应缓冲液。取0.5mL加入0.04USDH(sigma)和0.15rnMNADH，立即混匀，在340咖下检测NADH被氧化的量(即在340nm做时间扫描)。根据标准曲线求得木酮糖量。木糖异构酶(XI)的一个比活力单位(L7rag)定义为每mg酶蛋白每分钟转化底物的ti图1/L数。通过酶活测定进行复筛获得一株突变体，提取其质粒，对x/"部分测序，测序的结果是SEQNO.l所示的序列(fflxyW)，编码SEQNO.2所示的多肽，该多肽为木糖异构酶的进化酶，命名为Sl，带有Sl编码基闲的相应重组载体为pYPX251-Sl，含有重组载体的重组菌株为HB101-S1。实施例2进化酶S1的酶活测定(1)以纤维堆囊菌"ora"p'柳ce77"Jos哪)157-2的总DNA为模板，利用引物1和引物2扩增野生型木糖异构酶基因以Zfe711、5"scl酶切，采取定向连接策略与同样酶切处理的质粒载体pYPX251(GenBankAY178046)定向连接，获得重组质粒pYPX251一SXI。(2)步骤(1)中的重组质粒转化大肠杆菌HBIOI，获得重组菌株HR101—SXI。(3)按照实施例1中步骤(11)中描述的酶活测定方式，在不同温度下测定不同菌株来源的粗酶液屮含有的木糖异构酶的比活力见表1。表1在不同温度下不同菌株中的木糖异构酶比活力<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(4)按照实施例1中步骤(11)中描述的酶活测定方式，调整测定缓冲液的pH分别在pH等于5、6、7、8、9和10的条件下测定进化酶S1的最适pH为7.0(附图2)。实施例3突变木糖异构酶基因在酿酒酵母中的活性表达(1)根据酿酒酵母基因组数据库中//J77基因上游一375bp——lbp序列设计引物引物3:5，-GATCCCCGGGCGGGCCCCTGCGTG-3'引物4:5，-TTGCGGTACCTTTTTGATTAAAATTAAAAAAAC-3'以酿酒酵母染色体为模板，PCR扩增HXT7启动子(HXT7p)片段，并用和i^"I双酶切PCR产物。(2)根据SEQNO.l所示的核苷酸序列设计引物引物5:5，-AGCTGGTACCATGACCGTCGTGATTGGAAAC-3'引物6:5，-TTGCAGATCTTTACCGGATCCACCGATTGAC-3'以pYPX251-Sl为模板，PCR扩增w矽"，并用和Sg/II双酶切PCR产物。(3)根据SEQNO.l所示的核苷酸序列设计引物引物5:5，陽AGCTGGTACCATGACCGTCGTGATTGGAAAC-3，引物6:5，-TTGCAGATCTTTACCGGATCCACCGATTGAC墨3'以纤维堆囊菌染色体为模板，PCR扩增xy"，并用《p"I和Sg/II双酶切PCR产物。(4)根据酿酒酵母基因组数据库中尸G《7基因下游lbp—279bp序列设计引物引物7:5，-GCTAGATCTTAACGAACGCAGAATTTTCG-3'引物8:5，-TTGAAGCTTTAAATTGAATTGAATTGAAAT-3，以酿酒酵母染色体为模板，PCR扩增PGK1终止子(PGKlt)，用历"dIII和Bg/II双酶切PCR产物。(5)将步骤(1)，(2)，(4)中获得的产物等量连接混合物作为模板，用引物3和引物8扩增，回收2000bp处的片段，用历milII和5Vnal双酶切。(6)质粒YEp24用历"dlII和Smal双酶切，并和步骤(5)获得的产物连接，转化大肠杆菌，经在大肠杆菌中扩增后的重组载体验证正确后命名为pHX-Sl。(7)歩骤(6)获得的重组载体pHX-SXI转化酿酒酵母H158，重组菌株命名为H158-Sl。(8)将步骤(1)，(3)，(4)中获得的产物等量连接混合物作为模板，用引物3和引物8扩增，回收2000bp处的片段，用历mira和5Vnal双酶切。(9)质粒YEp24用历milII和Smal双酶切，并和步骤(8)获得的产物连接，转化大肠杆菌，经在大肠杆菌中扩增后的重组载体验证正确后命名为pHX-SXI。(10)步骤(9)获得的重组载体pHX-SXI转化酿酒酵母H158，重组菌株命名为H158-SXI。(11)按照实施例1中步骤(11)所使用的方法制备H158-SXI和H158-S1的粗酶液并测定XI酶活，两种XI在酿酒酵母中都有活性表达，H158-SXI中的XI酶活为0.11，H158-S1中的XI的酶活为0.039，经过改造的进化酶Sl的活性是野生型SXI的2.8倍。10序列表<110〉山东大学<120>—种木糖异构酶及其编码基因与应用〈歸2〈170>PatentlnVersion3.3〈210〉1〈211〉1329<212〉腿〈213〉纤维堆囊菌(5braAg7'鹏c6^"7os〃/z^〈400〉1atgaccgtcgtg3ttgg犯acaaagggtacttccccggtgtcggcaagatcctctacgag60gggcccgagtccgscaaccccgtcgccttc卿tggtacgacg卿gccgcgtcgtcgcc120ggcaagcccatg犯gg3CC3cttc朋gttcgccgtgtgttactggcacaccttctgtggt180cgtgggcacgaccccttcggtccggggacgatcaacttaccctgggacga240ccactgacccgcgctcgcatg鄉gcggscgcgaacttcgagttcatcaccaagctgggc300gcgacgcactactgtttccactggtggagg郷gCg3C3gccgcgccgag360acgtcgcgccgccttcagggcatcgtcgggtacgccaagcagaagca^gcgcagtcgggc420gtcaagctgctgtgggtcacggcg犯cttgttctccaaxxcgcgctacatgaacggcgcc480tccacgaacccggatttctccgaggtggcctacgccggcgcccagctgaaggacgccctc540gacgccaccatcgcgctgaacggtg卿actacgtgttctggggcggccgCg3gg3tt￡LC■atgagcctgctgaacacggacatgaagcgcg卿tggagcacttcgcgcgcttcttgacc6603tggcgcgcgactacgcgcgcgcccggggcttX犯gggg3ccttcttcatcgsgcccaag720ccgatggagccgtcg朋gcaccagtacgacttcggcgccgagaccgtgatcgggttcctg780cgccagcacggcctgganggacttcaagctcaacctggagacgaaccacgcgacgctc840gctggccacacc已tggagc已cgagatgcaggtggccgcggacgccggcatgctcggcagc■atcgacgcgaacctcggcgactaccagaatgCgtgggaC￡Lccgatcagttcccctacaac960atcaacgagacggtggagatgatgctcatcctcctccgcagcggc郷ttccagggtggc1020ggcgtcaacttcgacgcga^gcgccgccgcaactcgacggacctgatxgacaccttccac1080ggCC3C3tCggCggC3tgg3cgtgttxgcccgcgcgctcatcatcgccggCg3CCtg3tC1140cgcaagtcgccgctcgagtcgatgcgcaaggctcattacgcgtcgttcgacggcggc卿1200ggcgcggagttcgagc鄉ggaagctcacgctggagcagctggccg卿tcggcgacgcc1260ggcggcggtcaagctcacgagcggtcagcaagagctgtcgtcaatcgg1320tggatccgg1329〈210〉2<211>443〈212〉PRT〈213〉纤维堆囊菌(5bra/7g/咖ce"〃/os"/z^〈400〉2脂VIGNKGYFPGVGKILYEGPESDNPVAFKWYDESRVVAGKPMKDHFKFAVCYWHTFCG60RGHDPFGPGTINLPTOEGKDPLTRARMKADANFEFITKLGATHYCFHDIDLVEEGDSRAE120TS國GIVGYAKQKQAQSGVKLLWVT認LFSNPRYMNGASTNPDFSEVAYAGAQLKDAL180DATIALNGENYVFWGGREDYMSLLNTDMKREMEHFARFLTMARDYARARGFKGTFFIEPK240PMEPSKHQYDFGAETVIGFLRQHGLDKDFKLNLETNHATLAGHTMEHEMQVAADAGMLGS300ID緒LGDYQNAWDTDQFPYNINETVE丽LILLRSGRFQGGGVNFDAKRRRNSTDLIDTFH360GHIGGMDVFARALIIAGDLIRKSPLESMRKAHYASFDGGKGAEFEQGKLTLEQLAEIGDA420GGEVKLTSGQQELYENIVNRWIR443〈210〉3〈211〉28〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉3ATCGAGATCTATGACCGTCGTGATTGGA28〈210〉4〈211〉28<212〉DNA<213〉人工合成<400>4TTCGGAGCTCTTACCGGATCCACCGATT28〈210>5〈211〉24<212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉5GATCCCCGGGCGGGCCCCTGCGTG24<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>权利要求1、一种编码木糖异构酶的DNA序列，其特征在于，它是在纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)157-2中的木糖异构酶基因xylA的53位由C突变为T；219位由C突变为A；243位由G突变为A；265位由A突变为G；437位由G突变为T；503位由T突变为A；596位由G突变为A；635位由A突变为T；755位由A突变为G；914位由G突变为T；930位由C突变为T；1006位由G突变为A；1175位由G突变为A；1255位由A突变为G。2、如权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，基因序列如下atgaccgtcgtgattggaaacaaagggtacttccccggtgtcggcaagatcctctacgag60gggcccgagtCCg3C皿CCCcgtcgccttc鄉tggt已cgacg卿gccgcgtcgtcgcc120ggcaagcccatgaagg已cc已cttcaagttcgccgtgtgttactggcacaccttctgtggt180cgtgggcacgaccccttcggtCCgggg2LCgcctgggacga240ccactgacccgcgctcgcatgsaggcgg3cgcgaacttcgagttcatcaccaagctgggc300gcgacgcactactgtttccacgacatxgacctggtggaggagggcgacagccgcgccgag360acgtcgcgccgccttcagggcatcgtcgggtacgcc犯gcag已agcaagcgcagtcgggc420gtcaagctgctgtgggtcacggcg,ttgttctccaacccgcgctacatgaacggcgcc■tccacgaacccggatttctccgaggtggcctacgccggcgcccagctgaaggac.gccctx540gacgccaccatcgcgctgaaCggtg卿3Ctacgtgttctggggcggccgcgaggsttac600atgagcctgctgascacggacatg犯gcgcg卿tgg已gcacttxgcgcgcttcttgacc660atggcgcgcgactacgcgcgcgcccggggcttC卿ggg3ccttcttcatcgsigccc朋g720ccgatggagccgtcgaagcaccagtacgacttcggcgccg3gaccgtgatcgggttcctg780cgccagcacggcctggacaaggacttc犯gctcaacctggagacgaaccacgcgacgctc840gctggccacaccatggagcacgagatgcaggtggccgcggacgccggcatgctcggcagc■atcgacgcgaacctcggcgactaccagaatgcgtgggac已ccgatcagttCCCCt3C33C960atcaacgag已cggtgg卿tgatgctcatcctcctccgc已gcggcaggttccagggtggc1020ggcgtcaacttcgacgcg犯gcgccgccgcaactcgacggacctgatcgacaccttccac1080ggccacatcggcggcatggacgtgttcgcccgcgcgctcatcatxgccggcgacctgatc1140cgcaagtcgccgctcgagtcgatgcgcaaggctcattacgcgtcgttcgacggcggc鄉1200ggcgcggagttcgagcagggg犯gctcacgctggagc观ctggccg卿tcggcgacgcc1260ggcggcg郷tcaagctcacg观cggtc站caagagctgtacgag朋catcgtcaatcgg1320tggatccgg1329。3、一种由权利要求1所述的DNA序列编码的木糖异构酶，它是在纤维堆囊菌(5br朋《i"fflceWWas)157-2中的木糖异构酶基因xy"编码的多肽(GenebankACC99633)的突变酶，与突变前比较，有十二个位点的氨基酸残基发生了变化，它包括18位由P突变为L、73位由F突变为L、89位由T突变为A、146位由G突变为V、168位由V突变为E、199位由G突变为D、212位由K突变为M、252位由D突变为G、305位由R突变为L、336位由G突变为R、392位由R突变为H以及419位由N突变为D。4、如权利要求3所述的木糖异构酶，其特征在于，氨基酸序列如下:MTVVIGNKGYFPGVGKILYEGPESDNPVAFKWYDESRVVAGKPMKDHFKFAVCYWHTFCG60RGHDPFGPGTINLPWDEGKDPLT證MKADANFEFITKLGATHYCFHDIDLVEEGDSRAE120TSRRLQGIVGYAKQKQAQSGVKLLWVTANLFSNPRY丽GASTNPDFSEVAYAGAQLKDAL180DATIALNGENYVFWGGREDYMSLLNTDMKREMEHFARFLTMARDYARARGFKGTFFIEPK240PMEPSKHQYDFGAETVIGFLRQHGLDKDFKLNLETNHATLAGHTMEHEMQVAADAGMLGS300IDANLGDYQNAWDTDQFPYNINETVEMMLILLRSGRFQGGGV腦AKRRRNSTDLIDTFH360GHIGGMDVFARALIIAGDLIRKSPLESMRKAHYASFDGGKGAEFEQGKLTLEQLAEIGDA420GGEVKLTSGQQELYENIVNRWIR443。5、一种含有权利要求l所述的DNA片段的基因载体。6、一种含有权利要求5所述的基因载体的重组细胞。7、权利要求l、3、5和6所述的DNA序列、木糖异构酶、基因载体和转化细胞在化工、食品、医药领域的应用。全文摘要本发明涉及一种木糖异构酶及其编码基因与应用，属酶基因工程
技术领域：
。一种编码木糖异构酶的DNA序列，它是在纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)157-2中的木糖异构酶基因xylA(GenebankEU643621)的部分位点突变获得。以及该DNA序列所编码的酶及在化工、食品、医药领域的应用。本木糖异构酶比传统木糖异构酶在酿酒酵母中的活性提高了2.8倍。文档编号C12N1/19GK101323858SQ20081013856公开日2008年12月17日申请日期2008年7月24日优先权日2008年7月24日发明者煜沈,鲍晓明申请人:河南天冠企业集团有限公司;山东大学