一种细菌木糖异构酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明从细菌中筛选出一种新的木糖异构酶基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明将包含该基因的重组质粒导入了酿酒酵母中，获得了一种新的酵母工程菌。经实验证实，将该基因在酿酒酵母中表达后，原来不具备转化木糖为木酮糖的能力的酿酒酵母获得了该转化能力。该工程菌通过发酵含有木糖的培养基可以制备乙醇和其他发酵产物。
【专利说明】一种细菌木糖异构酶基因及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种木糖异构酶基因,特别涉及来自细菌Clostridium sp.BI的木糖异构酶基因及其转化木糖为木酮糖的功能，本发明还涉及含该基因的重组质粒及工程菌株，以及该工程菌在发酵含有木糖的培养基制备乙醇和其他发酵产物的应用。
【背景技术】:
[0002]木糖异构酶能够将木糖异构化成木酮糖，利用其，可将植物的木质纤维素中的木糖作为碳源，发酵生成乙醇。
[0003]现有技术的木糖异构酶基因多来自于微生物。曾有人分别克隆表达了多种来源的木糖异构酶基因，如Escherichia coli,Bacillus subtil is, Thormotoga species, Thermusspecies等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株酿酒酵母中得到活性表达，而且在30°C左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤。
[0004]较少有从细菌中筛选出的木糖异构酶基因能够在酵母里得到良好表达活性的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是从细菌中筛选出新的木糖异构酶基因，并将该基因导入酿酒酵母，使得到的 酵母遗传工程菌获得将木糖转化为木酮糖的能力。
[0006]本发明所要解决的技术问题如下:
[0007]从细菌中筛选出一种新的木糖异构酶基因；
[0008]提供包含上述木糖异构酶及其基因的重组载体；
[0009]提供包含上述木糖异构酶基因的重组菌株；
[0010]将所得上述重组菌株应用于转化木糖生成木酮糖，进而生成乙醇。
[0011]本发明人通过筛选,发现了一种天然菌株厌氧细菌Clostridium sp.BI,从该细菌中获得了一种新的木糖异构酶，命名为XI。并得到了一种编码该酶的木糖异构酶基因xylA，实验证明，该基因具有将木糖转化成木酮糖的功能，适合于在能源、酿酒以及食品工业中使用。
[0012]虽然本发明最初是通过筛选到该细菌完成的发明，但本发明的结果是得到了基因序列。他人不依赖这种细菌，只要得知序列就可以获得一种新的木糖异构酶，能够将木糖异构化成木酮糖，利用其，可将植物的木质纤维素中的木糖作为碳源，发酵生成乙醇。
[0013]所述木糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。该xylA基因编码的木糖异构酶XI的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0014]本发明将上述木糖异构酶基因xylA插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到包含木糖异构酶基因xylA的重组质粒。所述表达载体优选为酿酒酵母多拷贝表达载体PYES2，得到重组质粒pYES2-CXI。[0015]作为本发明的一个最优选的实施方案，所述表达载体合适的限制性酶切位点之间是质粒pYES2上的Spe I和Xba I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于TPIl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒PYES2-CXI。
[0016]本发明将上述重组酵母表达质粒pYES2-CXI转化进入宿主细胞，得到可以高效表达上述木糖异构酶的重组菌株。
[0017]所述宿主细胞为酿酒酵母细胞、毕赤酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选宿主细胞为酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae),更优选的，是将重组酵母表达质粒转化酿酒酵母细胞CEN.PK113-5D，得到重组菌株C (详见实施例4)。
[0018]本发明还提供了包含上述木糖异构酶基因的重组菌株，优选为重组菌株C。重组菌株C能够高效表达上述木糖异构酶，该酶可用于发酵含有木糖的物质，将木糖转化成木酮糖，进而代谢生成乙醇和其他发酵产物。本发明还提供了一种所得木糖异构酶的应用，包括以下步骤:
[0019]1、用权利要求重组质粒转化宿主细胞，得到重组菌株C (详见实施例4)；
[0020]2、培养重组菌株C，表达重组木糖异构酶。
[0021]其中，本发明的木糖异构酶具有以下应用范围:
[0022]1、能源工业:
[0023]可以将木质素纤维素水解物中大量存在的的D-木糖转化为D-木酮糖，而D-木酮糖又可被传统的乙醇生产菌株如酿酒酵母转化成有价值的燃料。
[0024]2、食品工业
[0025]木糖异构酶可以在体外催化D-葡萄糖转化为D-果糖，因此又被称为“葡萄糖异构酶”。这后一种活性在工业中可用于生产果葡糖浆，可作为食品添加剂。果葡糖浆是一种完全可以替代蔗糖的产品，并与蔗糖一样可广泛应用在食品及饮料行业。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。实际上，用本发明发现的基因和方法，本领域技术人员可以得到其它多种具有将木糖转化为木酮糖能力的遗传工程菌株，均不能脱离本发明的精神和思路。
[0027]以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0028]试验材料和试剂
[0029]1、菌株及载体:酿酒酵母表达载体pYES2购自Invitrogen公司，酿酒酵母菌株CEN.PK113-5D (表型为:MatA ura3_52)及大肠杆菌DH5 α由所在实验室保存。
[0030]2、酶类及其它生化试剂:内切酶及连接酶购自NEB公司，其它试剂如未作具体说明都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
[0031]3、培养基:
[0032]①大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl, pH7.0)
[0033]②酵母培养基YPD (1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖，平板添加2%琼脂)
[0034]③选择培养基SC (0.67%YNB、2%葡萄糖，平板添加2%琼脂)[0035]以下实施例中所述的Clostridium sp.BI木糖异构酶基因，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0036] 实施例1Clostridium sp.BI菌株基因组总DNA的提取
[0037]①取Clostridium sp.BI菌株约0.5g,在液氮中迅速研磨成粉；
[0038]②加入4ml提取液，快速振荡混匀；
[0039]③加入等体积的4ml的氯仿:异戊醇(24:1 )，涡旋3_5min ；
[0040]④1000Orpm, 4°C, 5min ;
[0041]⑤上清用体积的氯仿:异戍醇(24:1)再抽提一次(1000Orpm, 4?离心5min)；
[0042]⑥取上清，加入2/3倍体积的-20 V预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，静置约30min ；
[0043]⑦用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗I次，吹干，重悬于500 μ I TE中；
[0044]⑧加入I μ I RNaseA (10mg/ml), 37°C处理 Ih ;
[0045]⑨用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提I次(lOOOOrpm，4°C离心 5min)；
[0046]⑩取上清，1/10V体积的3M NaAc, 2.5V体积的无水乙醇，_70°C沉淀30min以上。12000rpm，4°C离心lOmin，弃上清，沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200 μ I ρΗ8.0的ddH20中，-20°C保存备用。
[0047]实施例2Clostridium sp.BI木糖异构酶基因xylA的克隆
[0048]以实施例1提取的Clostridium sp.BI总DNA为模板，以木糖异构酶保守序列设计的引物进行PCR扩增。得到一约900bp片段，将该片段回收后与pGEM-T easy载体相连送上海生工测序。
[0049]根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物:设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spl的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22-30nt，退火温度在60-65°C。并将它们分别命名为uspl、usp2、usp3 (上游特异性引物),dspl、dsp2、dsp3 (下游特异性引物)见表1。
[0050]通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送上海生工生物公司测序，通过比对分析测序序列，证实获得的序列包含Clostridium sp.BI木糖异构酶全长基因序列，总长1296bp，序列如SEQ ID N0.2所示。
[0051]表1木糖异构酶XI TAIL-PCR特异性引物
[0052]
【权利要求】
1.一种细菌木糖异构酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.权利要求1所述基因的用途，是转化木糖生成木酮糖。
3.含权利要求1所述基因的重组质粒。
4.权利要求3所述的重组质粒，是权利要求1所述基因与在酿酒酵母中具有表达特性的质粒连接而得到的。
5.权利要求4所述的重组质粒，所述在酿酒酵母中具有表达特性的质粒是酿酒酵母多拷贝表达载体PYES2。
6.一种重组菌株，包含权利要求1所述的基因。
7.—种酵母工程菌，含有权利要求4或5所述的重组质粒。
8.权利要求7所述的酵母工程菌，其宿主细胞选自酿酒酵母细胞、毕赤酵母细胞或多型逊酵母细胞。
9.权利要求7或8所述酵母工程菌的用途，是通过发酵含有木糖的物质制备乙醇和其他发酵产物。
10.一种木糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
【文档编号】C12R1/865GK103614400SQ201310581561
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】王智, 顿宝庆, 李桂英, 路明 申请人:中国农业科学院作物科学研究所