一个育性调控基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一个育性调控基因及其应用，属于植物育种领域。具体地，本发明涉及纯合隐性核雄性不育水稻植株的育性恢复及其用途。进一步本发明涉及构建水稻雄性不育系、保持系的方法、载体构建及转基因材料性状，更具体地，本发明涉及一种构建体，一种水稻细胞、组织或器官，一种构建水稻雄性不育系的方法，一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法，一种制备水稻种子的方法，一种转基因材料，一种用于制备杂交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。
【专利说明】—个育性调控基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物育种领域。具体地，本发明涉及纯合隐性核雄性不育水稻植株的育性恢复及其用途。进一步本发明涉及构建水稻雄性不育系、保持系的方法、载体构建及转基因材料性状，更具体地，本发明涉及一种构建体，一种水稻细胞、组织或器官，一种构建水稻雄性不育系的方法，一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法，一种制备水稻种子的方法，一种转基因材料，一种用于制备杂交水稻的方法，以及水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。
【背景技术】
[0002]水稻杂交育种中常用的是“三系”和“两系”杂交。“三系”杂交需要有特定的恢复系和保持系，育种程序和生产环节复杂，选育新不育系及新组合的周期长、效率低，种质资源的利用率低于5%。另外，三系杂交稻优势较弱，不育细胞质较单一，存在某种毁灭性病虫害暴发的潜在危险。“两系”杂交水稻由于不受恢复系、保持系之间关系的制约，亲本的遗传多样性得到明显改善，选育出高产杂交稻组合的速度明显加快，促进了超级杂交稻的研究和生产。但目前“两系”杂交中采用的不育系多为“光温敏”不育系，其育性受环境中的温度和光照影响。这些环境因素的不稳定会直接影响杂交种子的纯度和产量，加大制种风险，严重时会给种业企业和农民造成重大经济损失，限制“两系”杂交稻的大面积推广。而且利用目前技术所能培育的两系杂交稻不育系十分有限，例如粳稻品种中几乎没有很好的两系杂交组合，限制了品种资源的充分利用。因而，培育不受环境影响且可自主繁殖的稳定不育系，已成为解决“两系”杂交技术瓶颈的突破点。围绕如何提高不育系的稳定性及打破杂交品种资源利用的局限性，并进一步解决现有制种技术复杂且成本高等技术瓶颈问题，一种新的杂交育种技术得到关注。该技术利用隐性核基因控制的雄性不育系和转基因技术，将育性恢复基因、花粉失活基因、种子颜色标记基因连锁，同时转入到纯合隐性核雄性不育植株(不育系)中，育性恢复基因的功能使转基因植株恢复育性；但到花粉发育后期，花粉失活基因使含有转基因的花粉失活，从而只有不携带转基因的花粉可以保留活性。该转基因植株自交后产生两类种子:不携带外源基因的不育系种子，可用于杂交种子生产；携带外源基因的可育种子，用于不育系的保持，即保持系；两类种子的分离比为1:1，利用颜色标记基因使可育的种子显现出颜色，从而可以方便地使用种子色选仪将可育种子(保持系)与不育种子(不育系一)分开。
[0003] 这种新型的杂交育种技术具有以下显著的优越性:(1)该技术创制的不育系育性稳定，不受环境影响，消除了环境因素对杂交育种的制约和生产上的潜在风险。(2)所利用的隐性核不育基因适用于绝大多数品种，而且理论上所有水稻品种都可作为杂交的父本，从而使杂种优势的资源利用率大幅提高。(3)终止携带外源基因的花粉的受精过程，防止外源基因漂移到其它植物中；(4)所产生的不育系不含外源基因，消除人们对转基因作物的顾虑。(5)自交结实提高了不育系自身繁殖效率，利用颜色标记基因方便地将不育种子和可育种子分开，保证了不育种子的纯度。[0004]在该技术中，花粉失活基因是最关键的环节之一，所选用的失活基因在花粉中表达的时间、水平及花粉失活效率都直接关系到该技术的成功与否。目前已有的该技术载体构建中，多采用细菌来源barnase基因或玉米来源的amylase基因等作为花粉失活基因，这些基因对于水稻来讲，都是外源的。因此，开发水稻内源的可以被用作花粉失活的功能基因，对于消除公众生物安全顾虑、打破国外技术堡垒、获得更优化的具有自主知识产权的新型杂交水稻育种技术，具有重要意义。
[0005]水稻OsYUCCAI基因编码一个类黄素单加氧酶(f lavinmonooxygenase-1 ikeenzyme, FMO)家族成员，是吲哚乙酸(IAA，植物体内最主要的生长素类激素)生物合成过程中的关键酶，催化将色胺(tryptamine, TAM)转化成羟基色胺(N-hydroxytryptamine,NHT)，是依赖于色氨酸的IAA合成途径中的限速酶。该基因在拟南芥中的同源基因被称为YUCCA1，已经分离的拟南芥yuccal显性突变体表现出顶端优势增强，下胚轴和叶柄伸长、子叶着生偏上及叶片细长等形态特征，研究发现yuccal显性突变体中YUCCAl基因表达升高，使得游离状态的IAA含量也相应升高，直接导致了以上的突变体表型(A role for flavinmonooxygenase-1ike enzymes in auxinbiosynthesis, Zhao etal.，2001，Science291:306-309)。进一步，在拟南芥中也证明了 YUCCAl基因依赖的生长素合成途径，在花器官的发育过程中起到调控作用，组成型过表达YUCCAl基因导致生长素的积累，而单独突变yuccal基因并没有造成可见表型，只有多个YUCCA同源基因被同时突变时，才使植株由于生长素的合成减少，而出现花器官、维管束及其它组织发育异常的表型(Auxin biosynthesis by the YUCCA flavinmonooxygenases controlsthe formationof floral organs and vascular tissuesin Arabidopsis, Cheng etal.，2006，Genes and Development20:1790-1799)。在水稻中，有报道表明 OsYUCCAl 基因在植株中并非组成型表达，而是离散表达在植株的叶尖、根尖、幼原基、维管束的实质细胞及花器官等中(Auxin biosynthesis by the YUCCAlgenes in rice, Yamamoto etal.，2007, Plant Physiologyl43:1362-1371)。在本发明中，发明人利用花粉特异性启动子驱动OsYUCCAl基因在 水稻花粉中特异表达，惊奇地实现了致使水稻花粉失活的效果，推测是由于OsYUCCAl基因在花粉中过表达导致花粉发育过程中生长素的异常积累造成的。进一步利用OsYUCCAl、水稻育性基因(Ms26，)及种子荧光标记基因(RFP)构建新型育性调控载体，并转化入相应的水稻雄性不育植株中，得到了相应的保持系，对该保持系结实的种子进行分析，结果实现了携带外源基因的红色荧光种子与不携带外源基因的非红色荧光种子的1:1分离，两类种子可以分别被用作保持系与不育系，进行不育系的繁殖和杂交种子的生产。
[0006]根据以上的结果，我们认为OsYUCCAl作为水稻内源基因，特异地在成熟花粉中过量表达，可以实现花粉失活的效果，将该基因构建到新型育性调控载体中，可使携带外源基因的花粉失活，终止携带外源基因的花粉的授精过程，防止外源基因通过花粉漂移到其它植物中，外源基因只通过雌配子体进行遗传，进一步实现了水稻保持系和不育系的创制。由于该基因是水稻内源控制IAA生物合成途径的关键酶类，且为水稻内源基因，从生物安全角度考虑，将更有利于消除公众对转基因概念的潜在疑虑。
【发明内容】
[0007]本发明旨在至少在一定程度上解决上述水稻杂交育种技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有能够有效构建新型稳定的水稻雄性不育系和充分利用水稻种质资源，用于杂交育种、提高杂交种纯度的手段。
[0008]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:发明人以纯合隐性核雄性不育水稻突变体为转化受体材料，通过将紧密连锁的3个目标基因转化至不育受体植株中。其中，育性恢复基因可使转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。例如，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性不育ms26 / ms26突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至不育系:育性恢复基因0sCYP704B2 (对应野生型MS26基因)可使转化受体育性恢复，花粉失活基因OsYUCCAl可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，荧光色选基因用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种 ，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。
[0009]由此，在本发明的一个实施例，本发明提出了一个基因，根据本发明的实施例，该基因在水稻成熟花粉中特异过表达时，可以导致水稻花粉的失活。该设计使得所有含有此基因的转基因花粉失活，不能授精还能严格防止基因漂移等生物安全问题，失活的花粉不能与周围其它植株或杂草授粉，因而转基因不能通过花粉漂移到环境中。
[0010]由此，在本发明的一个实施例，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括:第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码水稻雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活基因。利用该构建体，能够有效地将水稻雄性不育恢复基因和花粉失活基因引入到纯合隐性核雄性不育水稻突变体植株中，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交的母本。由此，可以有效地用于水稻杂交。
[0011]由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第二方面，本发明提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该水稻细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。
[0012]在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将前面所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育雄性配子；培育所述第二水稻植株，以便获得不含外源基因的种子，从而构建水稻雄性不育系。通过引入外源基因，可以使得第二水稻植株能够进行自体受精，从而得到携带外源基因的种子和不携带外源基因的种子。其中，不携带外源基因的种子可以作为水稻雄性不育系。从而，可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交的亲本。由此，可以有效地用于水稻杂交。
[0013]在本发明的第四方面，本发明提出了一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中。
[0014]在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:将前面所述的构建体引入到雄性不育水稻植株中；以及将所述水稻植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。
[0015]在本发明的第六方面，本发明提出了一种转基因植株。根据本发明的实施例，所述转基因植株是通过将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中获得的。
[0016]在本发明的第七方面，本发明提出了一种用于制备杂交水稻的方法。根据本发明的实施例，该方法采用新型水稻雄性不育系，该新型水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。
[0017]在本发明的第八方面，本发明提出了水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。根据本发明的实施例，所述水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。
[0018]在本发明的又一方面，本发明还提出了一种创制不同类型水稻雄性不育系的方法，其是利用分子标记和杂交创制新型水稻不育系。根据本发明的实施例，该方法包括:采用水稻ms26雄性不育植株作为母本，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因；将所述母本与轮回亲本进行回交转育，以便获得具有所述轮回亲本性状的水稻雄性不育系，其中，所述轮回亲本不具有Ms26基因的纯合隐性等位基因。由此，利用本发明的方法，可以在ms26纯合隐性雄性水稻不育系的基础上，开发更多的不同遗传背景的不育系。根据本发明的实施例，利用常规回交育种方法，所有不同类型的水稻都可以创制成相应的智能不育系 ，使杂种优势资源利用率达到95%以上。
[0019]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0021]图1为根据本发明一个实施例的植物表达载体YUCCAl的结构示意图；
[0022]图2为根据本发明一个实施例的植物表达载体pZN2的结构示意图；
[0023]图3为根据本发明一个实施例的植物表达载体pZN2的构建示意图；
[0024]图4显示了根据本发明一个实施例，水稻核隐性不育ms26 / ms26突变体为转化受体材料，通过转基因所得到的转化体通过自交得到不育系的示意图，其中ms/ms指水稻核隐性不育纯合突变体；
[0025]图5显示了根据本发明一个实施例的荧光种子和非荧光种子的分离比例(pZN2转基因植株);
[0026]图6显示根据本发明一个实施例，通过分子辅助筛选(MAS)的方法来进行通过回交转育构建不育系的流程示意图；
[0027]发明详细描述
[0028]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0029]本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。
[0030]除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。
[0031]术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0032]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:发明人以水稻核隐性不育突变体为转化受体材料，通过将紧密连锁的3个目标基因转化至不育系，其中，育性恢复基因可使转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。例如，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性不育ms26 / ms26突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至不育系:育性恢复基因0sCYP704B2 (Ms26)可使转化受体育性恢复，花粉失活基因OsYUCCAl可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，荧光色选基因用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。
[0033]由此，在本发明的一个实施例，本发明提出了一个基因，根据本发明的实施例，该基因特异性地在水稻花粉中过表达，可以导致水稻花粉的发育异常，并进一步导致花粉失活，失去授精能力。在本发明的一个实施例中，所述水稻花粉失活基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述核苷酸编码如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白质。即，可以采用的水稻花粉失活基因为OsYUCCAl，由此，可以将其在花粉中过表达作为水稻花粉的失活基因。OsYUCCAl基因在花药中特异性高表达时，会导致植株的花粉活力下降，失去授精能力，而雌性育性正常。
[0034]由此，在本发明的一个实施例，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括:第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码水稻雄性不育恢复基因；以及第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活基因。利用该构建体，能够有效地将水稻雄性不育恢复基因和花粉失活基因引入到水稻植株例如水稻纯合隐性雄性不育植株中，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交之中的亲本。由此，可以有效地用于水稻杂交。
[0035]在本文中，构建体的形式不受特别限制，根据本发明的具体示例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体(有时也称为表达载体、遗传载体或载体)呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。根据本发明的实施例，可以采用Ti载体，例如可以采用将第一和第二表达盒设置在表达载体PZN2的T-DNA之左右边界之间。由此，可以通过农杆菌介导的转化方法将第一和第二表达盒转化至受体植株，例如水稻ms26隐性核雄性不育突变体中。由此，可以获得不含除草剂抗性标记基因和抗生素抗性标记基因的水稻转化株系。如此获得的转化株系有如下特点:(I)转化位点在各世代始终处于杂合状态，因此有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)，所以外源基因仅通过雌配子传递至下一代，不会通过花粉漂移到环境中；(2)转化体自交可结实，所结可育种子与不育种子的比例为1:1，可育株(带有外源基因)用作保持系，可以通过自交方便地、源源不断地生产不育系和保持系，不育株(不含转基因成分)在生产上用作杂交制种的亲本；(3)因为不育株不含转基因，因此用其生产的杂交种子不含转基因，用此杂交种生产的水稻商品粮食更不含转基因，从而消除了转基因生物安全的隐患。该新型杂交育种体系为充分利用水稻杂种优势提供了切实可行的技术新突破。
[0036]在本发明中所使 用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的载体，优选核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
[0037]根据本发明的实施例，水稻雄性不育恢复基因的类型并不受特别限制，包括但不限于 MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、Ms26、DPW、MADS3、AID1、MS2等育性相关基因。在本发明的一个实施例中，所述水稻雄性不育恢复基因编码具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白质。即，可以采用的水稻雄性不育恢复基因为0sCYP704B2，由此，可以将其作为水稻受体ms26纯合突变体(完全雄性不育)的野生型育性恢复基因。0sCYP704B2基因编码的蛋白均在花药发育的阶段发挥重要的作用，基因突变后都会导致植株雄性不育，而雌性育性正常。
[0038]根据本发明的具体实施例，在本发明的一个实施例中，所述水稻雄性不育恢复基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。其中SEQ ID NO:4与野生型的0sCYP704B2基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)相比，SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列引入了三个单核苷酸突变，但不改变其编码的氨基酸序列，这三个单核苷酸突变在0sCYP704B2基因编码区上的位置及具体突变分别为:238位核苷酸A突变为C ;240位的核苷酸G突变为C ;243位的核苷酸G突变为C。发明人惊奇地发现，利用该SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列能够便于在各种分子鉴定中区别外源基因与内源基因，并且能够更有效地使水稻mS26/mS26不育受体植株的育性得到恢复。
[0039]在本发明的一个实施例中，所述第一表达盒还可以进一步包括:第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地相连，所述第一启动子为雄配子特异性启动子；以及第一终止子，所述第一终止子与所述第一核酸分子可操作地相连。根据本发明的实施例，第一启动子和第一终止子的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，对于0sCYP704B2，可以采用0sCYP704B2的内源启动子、ORF区及终止区的序列，均为野生水稻基因组序列。在本发明的一个实施例中，所述第一启动子具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第一终止子具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，利用该启动子和终止子的组合，能够进一步显著地提高表达相应蛋白的效率，进而能够提高利用构建体构建不育系的效率，并且能够更有效地使水稻ms26/ms26不育受体植株的育性得到恢复。根据本发明的实施例，花粉失活基因的类型并不受特别限制。根据本发明的实施例，所述花粉失活基因编码具有如SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的蛋白质。由此，可以编码OsYUCCAl所编码的类黄素单加氧酶。类黄素单加氧酶是吲哚乙酸(IAA,植物体内最主要的生长素类激素)生物合成过程中的关键酶，催化将色胺(tryptamine, ΤΑΜ)转化成羟基色胺(N-hydroxy tryptamine, NHT)。根据本发明的实施例，所述花粉失活基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，与野生型的OsYUCCAl基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)相比，本发明中的OsYUCCAl基因的核苷酸序列SEQID NO:1引入了三个单核苷酸突变，但不改变其编码的氨基酸序列，这三个单核苷酸突变在OsYUCCAl基因编码区上的位置及具体突变分别为:33位核苷酸G突变为A ；36位的核苷酸G突变为C ;42位的核苷酸C突变为G。发明人惊奇地发现，利用该SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列能够便于在各种分子鉴定中区别外源基因与内源基因，并且能够更有效地在水稻中发挥花粉失活功能。由此，可以进一步提高表达相应蛋白的效率。根据本发明的实施例，第二表达盒进一步包括:第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地相连，所述第二启动子为花粉特异性启动子；以及第二终止子，所述第二终止子与所述第二核酸分子可操作地相连。由此，可以更有效的提高相应基因的表达效率。该设计使得所有含有此基因的转基因花粉失活，不能授精还能严格防止基因漂移等生物安全问题，失活的花粉不能与周围其它植株或杂草授粉，因而转基因不能通过花粉漂移到环境中。
[0040]另外，根据本 发明的实施例，构建体还可以进一步包括:第三表达盒，所述第三表达盒包含第三核酸分子，所述第三核酸分子编码筛选基因，所述筛选基因为发光基因。由此，便于通过筛选基因的表达来确定植物及其部分是否含有构建体所引入的基因。
[0041]根据本发明的实施例，可以采用选自红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙Pi基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因的至少一种作为筛选基因。在本发明的一个实施例中，可以采用红色荧光蛋白作为筛选基因。红色荧光蛋白基因(RFP)，来源于礁珊瑚(Discosoma sp.)，是表达框内唯一非粮食作物来源的基因序列。红色突光蛋白最大吸收波长为558nm,最大发射波长为583nm。将RFP编码的氨基酸序列通过与过敏原及毒蛋白序列比对显示，相似性极低，无毒性及致敏性。RFP常用作遗传转化的筛选基因，从未发生过转基因生物安全事件。在本发明的一个实施例中，所述筛选基因具有如SEQ ID NO:12所述的核苷酸序列。由此，可以更加有效地表达红色荧光蛋白，增强RFP基因在水稻中的表达。SEQ IDNO: 12所述的核苷酸序列与野生型RFP基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示)相比，具有两个单核苷酸突变，命名为RFP (r)。这两个单核苷酸突变分别为:由第21位碱基C转换为G、由第315位碱基G转换为C。发明人惊奇地发现，这两个单核苷酸的突变可以更加有效地表达红色荧光蛋白，增强红色荧光蛋白基因在水稻中的表达。
[0042]在本发明的一个实施例中，所述第三表达盒进一步包括:第三启动子，所述第三启动子与所述第三核酸分子可操作地相连，所述第三启动子为愈伤组织和/或种子、种皮、胚和胚乳等特异性的启动子；第三终止子，所述第三终止子与所述第三核酸分子可操作地相连。在本发明的一个实施例中，所述第三启动子包括一个35S增强子和LTP2启动子，其中35s增强子具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列，LTP2具有如SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第三终止子具有如SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列。由此,根据本发明的一个实施例，RFP(r)的开放读码框连接于来自大麦且为愈伤组织和种子(种皮)特异性启动子LTP2和来自马铃薯的终止子PIN II之间，在LTP2启动子前还有一个来自烟草花叶病毒的35S增强子序列，重组成RFP (r)基因表达盒(35S::LTP2::RFP(r):: PINII)。含有该表达框的水稻愈伤及种子在荧光激发下呈现非常容易辨认的红色，因此该表达框在本发明中用于遗传转化的筛选标记和用于辨认和分选保持系和不育系种子。
[0043]由此，根据本发明的实施例，可以利用根据本发明的实施例的构建体，以非转基因隐性核雄性不育水稻(mS26/mS26)作为转化的受体，进行遗传转化，得到整合含有以下紧密连锁的三个外源基因RFP(r)，Ms26，OsYUCCAl的水稻保持系，Ms26即0sCYP704B2育性基因。外源基因的插入与内源雄性不育位点(mS26/mS26)是非连锁的，因此得到的转基因水稻保持系含有独立的纯合的ms26隐性不育位点及杂合的外源基因(包括Ms26基因)整合位点。
[0044]由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第二方面，本发明提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该水稻细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。在本发明的一个实施例中，所述水稻细胞、组织或器官来自水稻纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。由此，本发明的水稻细胞、组织或器官，可以有效地用于构建雄性不育株。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该水稻细胞、组织或器官，不再赘述。 [0045]由此，在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，参考图4，该方法包括:将前面所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育雄性配子，并且第二水稻植株中的外源基因处于杂合状态，因此第二水稻植株中有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)。第二水稻植株即转化体自交受精，得到两类种子:携带外源基因的红色荧光种子与不携带外源基因的非红色荧光种子，两者各占50%。这两类种子可以分别被用作保持系与不育系，进行不育系的繁殖和杂交种子的生产。
[0046]根据本发明的实施例，第一水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。另外，根据本发明的实施例，可以通过荧光检测进行分拣的步骤，即通过检测水稻种子是否携带发光基因，例如是否发出荧光来进行分拣，区分其是否携带外源基因，如图5所示。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0047]在本发明的第四方面，本发明提出了一种恢复水稻不育植株雄性育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0048]在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:将前面所述的构建体引入到水稻植株中；以及将所述水稻植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。在本发明的一个实施例中，所述水稻植株为水稻纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。
[0049]在本发明的第六方面，本发明提出了一种转基因材料。根据本发明的实施例，所述转基因材料是通过将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中获得的。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因。在本发明的一个实施例中，通过农杆菌介导法引入所述构建体。
[0050]在本发明的第七方面，本发明提出了一种用于制备杂交水稻的方法。根据本发明的实施例，该方法采用水稻雄性不育系，该水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。由此，可以进一步利用本发明的水稻雄性不育系进行水稻杂交，提高水稻杂交的效率。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0051]在本发明的第八方面，本发明提出了水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。根据本发明的实施例，所述水稻雄性不育系是通过前面构建水稻雄性不育系的方法构建的。由此，可以进一步利用本发明的水稻雄性不育系进行水稻杂交，可以大大提高培育优良杂交水稻新组合的概率。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该用途，不再赘述。 [0052]在本发明的又一方面，本发明还提出了一种构建水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，该方法包括采用水稻纯合隐性雄性不育植株作为母本，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因；将母本与轮回亲本进行回交转育，以便获得具有所述轮回亲本性状的水稻雄性不育系，其中，所述轮回亲本不具有Ms26基因的纯合隐性等位基因。由此，利用本发明的方法，可以在MS26纯合隐性雄性水稻不育系的基础上，发展更多的不同遗传背景的不育系。根据本发明的实施例，利用常规回交育种方法，所有不同类型的水稻都可以创制成相应的智能不育系(即可以源源不断地生产相应的不育系)，而且理论上所有水稻品种都可作为杂交的父本，使杂种优势资源利用率达到95%以上。
[0053]根据本发明的实施例，可以作为轮回亲本的品系不受特别限制，根据具体的实施例，轮回亲本可以具有选自配合力强、株型好、抗病、抗虫和高产的至少一种性状。由此，可以获得具有这些性状的雄性水稻不育系。根据本发明的实施例，轮回亲本可以为选自天丰、华 268、华恢 624、华 211、华恢 3411、华恢 451、华恢 2855、R608、华恢 374、华恢 3501、H451、R608、华占、黄华占、H268、H819、沪闽粳等的至少一种。
[0054]根据本发明的具体实施例，参考图6，可以通过分子辅助筛选(MAS)的方法来进行通过回交转育构建不育系。具体地，如图6所示，根据本发明的实施例，将所述母本与轮回亲本进行至少3次回交。另外，在进行回交的过程中，可以通过分子标记辅助进行前景选择和背景选择。
[0055]进一步，根据本发明的实施例，上述构建水稻雄性不育系的方法可以包括下列步骤:
[0056]首先，将ms26突变体(MS26纯合隐性雄性水稻不育系)与轮回亲本进行杂交，得到杂交Fl ；[0057]接下来，将Fl与轮回亲本进行回交，得到BClFl ；
[0058]接下来，将BClFl与轮回亲本进行回交，得到BC2F1 ；
[0059]接着，将BC2F1进行自交，得到BC2F2 ；
[0060]接着，将BC2F2与轮回亲本进行回交，以便得到BC3F1 ；
[0061]最后，将BC3F1进行自交，得到新构建的不育系BC3F2。
[0062]根据本发明的实施例，可以通过分子标记，对回交和自交产物进行前景选择和背景选择。例如，可以对Fl代不需要进行选择，对BClFl进行前景和背景选择，选择ms26的杂合体J#B2C2F1进行前景和背景选择，选择ms26的杂合体；对B2C2F1进行前景选择和背景选择，得到ms26的杂合体J#BC3F1进行前景和背景选择，得到ms26的杂合体；最后，对BC3F2进行前景选择和背景选择，以便得到ms26纯合体。如图6右侧两栏所示，通过MAS选择后轮回亲本的血缘可以达到99.5%。
[0063]根据本发明的实施例，用于回交转育的水稻纯合隐性雄性不育植株可以是通过前面所述的构建不育系的方法构建获得的。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。
[0064]需要说明的是，根据本发明实施例的构建体及其用途是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。【具体实施方式】述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
[0065]下面根据具体的实施例对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式解释为对本发明的限制。另外，除非特别说明，在下面的实施例中所涉及的方法为常规方法，所涉及的材料和制剂也为市售可得的。
[0066]下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
[0067]若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0068]实施例1:在水稻花粉中特异性高表达OsYUCCAl基因的表型分析
[0069]通过装配下述DNA元件，构建图1所示的被称为YUCCAl的表达载体，具体构建步骤如下:从玉米基因组中扩增PG47启动子(SEQ ID NO:9，扩增引物:F1，R1)，从水稻cDNA中扩增OsYUCCAl基因(SEQ ID NO:1，扩增引物:F2，R2)，扩增人工合成的IN2-1终止子(SEQ ID NO:17，扩增引物:F3，R3)，三者连接T载体测序验证后，分别用Hind III+Not I，AsiSI+Not I，AsiSI+Bgl II 酶切，同时连接进入BamH I+Hind III 酶切完全的pCAMBIA1300载体中，得到pYUCCAl的表达载体。，得到YUCCAl的表达载体。
[0070]其中，所用弓丨物序列为:
[0071]Fi: ττ '^agcttI gcatgcctgcaggtcgactctagaggatctgcaccggacactgtctggtgg (seq
ID N0:21)，方框内为HindIII酶切位点。
[0072]Rl:AT ^CGGCCGC[ TATGACGTGATCGATGCTTTATTCGCSEQ ID NO: 22)，方框内为 NotI 酶切位点，
[0073] F2:TT |gcggccgc[ ATGGACAACAAGCCGGCGCAAGAACGCCGCGAAACCTGGGTGCCG (SEQ IDN0:23)，方框内为NotI酶切位点。
[0074]R2: TC:^CGATCGC[ TCATCTCGAGATATATATCACTAGTAG (SEQ ID NO: 24)，方框内为 AsisI酶切位点
[0075]F3:GA |GCGATCGCl< GATCTGACAAAGCAGCATTAGTCCG (SEQ ID NO: 25)，方框内为 AsiSI酶切位点
[0076]R3:GT ^GATCT|l CGTGGAGATATAGGGGAAAGAGAAC (SEQ ID NO: 26)，方框内为 BglII 酶切位点。
[0077]利用热激法将质粒YUCCAl转入农杆菌AGLO菌株，利用农杆菌介导法对水稻武运粳7号野生型受体材料进行遗传转化，得到25株该载体相应的转基因植株材料。移栽到田间后，观察转基因植株与非转基因对照的表型，两类植株之间没有观察到明显的形态上的不同。
[0078]在花粉成熟期，取武运粳7号野生型受体材料和转基因材料的花药进行活性染色。采用的方法为:在水稻开花晚期，从转基因水稻植株及武运粳7号野生型受体对照植株各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取I个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1%的I2-1K溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数。结果显示转基因水稻植株及武运粳7号野生型受体对照植株的可育率均在95%~100%之间，说明过表达OsYUCCAl的花粉在花粉成熟期利用I2-1K染色正常，没有染色败育现象出现。
[0079]进一步，在 花药散粉的当天上午，采集武运粳7号野生型受体材料和转基因材料的花药进行了体外花粉萌发和花粉管伸长能力的测定。从武运粳7号野生型植株和转基因植株各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取I个花药，用解剖针剖开花药后，将成熟的花粉均匀分散到花粉液体培养基中(成分为:20%蔗糖，10%PEG4000, 3mMCaC12,40mg/L硼酸，3mg/L维生素BI)，置于28°C度保温箱中保温30分钟后，统计各个植株花药中花粉萌发和花粉管伸长的花粉占总花粉数目的比例。初步结果显示，转基因水稻植株的花粉体外萌发及花粉管伸长的比率比武运粳7号野生型受体对照植株的花粉体外萌发及花粉管伸长的比率显著下降(下降~50%)，，推测是由于转基因的水稻植株中含有转基因的花粉(50%)因过量表达OsYUCCAl基因，导致其活性降低。
[0080]以上结果表明，在水稻花粉中特异过表达OsYUCCAl基因，可以使水稻花粉萌发或花粉管伸长活性降低，也即失去了授精能力，因此，该基因可以作为花粉失活基因，用于后续的新型育性调控载体的构建的关键基因元件之一。
[0081 ] 实施例2:pZN2载体构建
[0082]通过装配下述DNA元件,构建图2所示的被称为pZN2的表达载体,具体构建步骤如图3所示:
[0083]第一步:先从玉米基因组中扩增PG47启动子(SEQ ID NO:9，扩增引物:F1，R1)，从水稻cDNA中扩增OsYUCCAl基因(SEQ ID NO:1，扩增引物:F2, R2)，分别用Hind III+Not
I,BamHI+Not I酶切，同时连接进入BamHI+Hind III酶切完全的pCAMBIA1300载体中，得到中间载体I。
[0084]第二步:PCR扩增人工合成的PINI1-RFP-LTP2序列(SEQ ID NO:10，扩增引物为:F3, R3)，连接T载体测序验证后，用Nael+AscI酶切并连接入Nael+AscI完全酶切的中间载体1，得到中间载体2。
[0085]第三步:从水稻基因组DNA中扩增CYPl (SEQ ID NO:19，扩增引物为:F4，R4);从人工合成的CYP2-1N2-1扩增CYP2-1N2-1(SEQ ID N0:15，扩增引物为:F5，R5)，所得到的两个片段，连接T-载体测序验证正确后，再分别用Ascl+Sall和Sall+AsiS I双酶切，同时连接进入用AsiSI+AscI双酶切的中间载体2，即得到中间载体3。
[0086]第四步:PCR扩增人工合成的35S增强子(35S enhancer)序列(SEQ ID N0:16，扩增引物为:F6，R6)，连接T-载体测序验证正确后，再用Asc I酶切开连接进入Asc I酶切开的中间载体3，验证正确后得到载体pZN2。
[0087]其中，所用弓丨物序列为:
[0088]fi:gc [aagcttg丨(catgcctgcaggtcgactctagaggatctgcaccggacactgtctggtgg (seq
ID N0:27)，方框内为Hind III酶 切位点。
[0089]Rl:AT |GCGGCCGC[r TATGACGTGATCGATGCTTTATTCG (SEQ ID NO: 28)，方框内为 Not I
酶切位点。F2:τα.1gcggccg^atggacaacaagccggcgcaagaaccseq id no:29)，方框内为 Not ι
酶切位点。R2:AA l|G6ATC4 A ^GCGCGCC^ GAATCCT ^CGATCGC[r TCATCTCGAGATATATATCACTAGTAGT(SEQ ID NO:30)，方框内分别依次为BamHI，Asc I和AsiS I酶切位点。
[0090]F3:TA ^GCGCGCC^ AACCGTCTCTTCGTGAGAATAACCG (SEQ ID NO: 31 )，方框内为 Asc I
酶切位点.R3:CTT jGCCGG(ji CGCATTCGCAAAACACACCTAGAC (SEQ ID NO: 32)，方框内为限制性内切酶Nae I酶切位点；
[0091]F4: TCGAAGGACCGCACCGTGACC:丨GTCGACp ATG (SEQ ID NO: 33)，方框内为 Sal I 酶切位点。
[0092]R4:CG lGGCGCGC(jr TCGCGATTGGTCGAACACGAGGTAGGCGTG (SEQ ID NO: 34)，方框内为Asc I酶切位点。
[0093]F5:GA ^CGATCGC|( GATCTGACAAAGCAGCATTAGTCCG(SEQ ID NO: 35)，方框内为 AsiS I酶切位点。R5:CAT IgtcgX^ Ggtcacggtgcggtccttcga (SEQ ID N0:36)，方框内为 Sal I 酶切位点。
[0094]F6:ττ'Iggcgc^atcacatcaatccacttgctttga (seq id no:37)，方框内为 Asc i酶切位点；
[0095]R6:GA @GCGCGCC|i CGTCAACATGGTGGAGCACGACAC (SEQ ID NO: 38 )，方框内为 Asc I酶切位点
[0096]实施例3:保持系的获得、扩繁及不育系的生产及原理
[0097]通过设计并验证，本发明提供了一种构建水稻保持系，并进一步生产雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，参考图4，该方法包括:[0098]第一步:将实施例2所述的构建体(含有育性恢复基因、花粉失活基因和色选基因表达框)通过遗传转化引入到水稻纯合隐性雄性不育植株ms/ms (ms26/ms26或其它核雄性不育突变体)中，获得携带外源基因的TO代水稻植株，并且TO代转基因植株的外源基因处于杂合状态；该植株产生的花粉中有一半不含外源基因，另一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)，TO代植株的育性得到恢复；
[0099]第二步，培育第一步所得到的TO代转基因植株，使其自交后结实，获得的Tl代种子根据遗传背景可分为两类，其中50%的种子为ms/ms (ms26/ms26或其它核雄性不育突变体)纯合隐性和外源基因杂合背景(可直接作为保持系)，还有50%的种子为ms/ms (ms26/ms26或其它核雄性不育突变体)纯合隐性且不含有外源基因(即为不育系种子);通过种子荧光色选可以将两类种子分离开来；
[0100]第三步，培育第二步的保持系种子为植株(背景为mS26/mS26或其它核雄性不育突变体纯合隐性和外源基因杂合)，这些来源的保持系产生的花粉一半含有外源基因，另外一半不含外源基因，保持系产生的种子中一半即50%含有外源基因且为红色荧光种子(背景为ms26/ms26或其它核雄性不育突变体纯合隐性突变位点和外源基因杂合)，可以进一步作为保持系；另一半50%不含有外源基因且为正常颜色的非荧光种子(背景为mS26/mS26或其它核雄性不育突变体纯合隐性突变位点和不含有转基因成分)，即为不育系。这两类种子可以通过色选仪分选出来，含有荧光的种子作为保持系，可以继续自交扩繁得到等量保持系和不育系的种子，而不含外源转基因的非荧光种子被作为不育系进行杂交育种或制种(图 4)。
[0101]实施例4:水稻转化
[0102]利用热激法将质粒pZN2转入农杆菌AGLO菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行遗传转化，利用载体中的RFP(r)基因编码的红色荧光蛋白作为筛选标记，通过3-4轮的愈伤荧光筛选切割后，分化得到两个载体相应的转基因植株材料。具体的转化受体材料为水稻ms26完全雄性不育纯合突变体，关于水稻ms26完全雄性不育纯合突变体材料的具体描述见中国专利 CN200910309083.1(以及 The Plant Cell Vol.22:173-190，2010 年 I 月)，该材料目前公众是可以获取的，通过将这两篇文献参照并入本文。
[0103]需要说明的是，也可以通过常规的基因敲除的方法，将水稻ms26基因全部敲除后，得到水稻ms26完全雄性不育纯合突变体。
[0104]实施例5:转基因植株的花粉育性检测
[0105]对实施例2中的构建体遗传转化所得到的转基因植株材料进行分析发现，转基因植株和非转基因对照植株之间没有观察到明显的形态上的不同。
[0106]对pZN2构建体转化ms26突变体得到的转基因植株材料，同时进行了花粉可染率及花粉萌发和花粉管伸长活力检测，同时对两个对照材料包括受体品系对应的野生型非转基因水稻品种武运粳7号(可育，下面简称为CKl)和转基因水稻对应的非转基因水稻品系武运粳7号ms26突变体(不育，下面简称为CK2)，进行花粉可染率及花粉萌发和花粉管伸长活力检测。
[0107]测定花粉可染率采用的方法为:在水稻开花晚期，从转基因水稻植株、及其对照CKl及CK2小区各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取I个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1%的I2-1K溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数。在CKl正常可育和CK2正常不育的前提下，分析转基因水稻植株(保持系)的花粉可染率。结果显示可育对照(CKl)的可育率在96%~100%之间，不育对照(CK2)可育率为0，而多个随机抽取的转基因(保持系)植株中，花粉染色比例也在95-98%之间，说明转化PZN2载体的转基因水稻植株中过表达OsYUCCAl的花粉在花粉成熟期I2-1K染色正常，没有染色败育出现。
[0108]测定花粉萌发和花粉管伸长活力采用的方法为:在花粉成熟期，从转基因水稻植株、及对照CKl及CK2小区各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取I个花药，进行花粉体外萌发和花粉管伸长能力的测定(采用的具体方法同实施例1 )。初步结果显示，转基因水稻植株的花粉体外萌发及花粉管伸长的比率比武运粳7号野生型受体对照(CKl)植株的花粉体外萌发及花粉管伸长的比率显著下降(下降~50%)，推测是由于转基因的水稻植株中含有转基因的花粉(50%)因过量表达OsYUCCAl基因，导致其活性降低。这些结果表明本发明中所提供的OsYUCCAl基因过表达框在整个新型不育表达载体中工作正常，可以实现致使花粉失活的目的，作为整体表达良好。
[0109]实施例6:转基因植株的荧光种子与非荧光种子分离比例
[0110]随机选取实施例2中所得到的载体(pZN2)的24个TO代植株单株，对其上所结Tl代荧光与非荧光种子的分离比例进行了调查，结果表明转基因植株上所结种子均符合1:1分离比(图5)，表明本发明中所提供的表达载体各元件作为整体表达良好。即所构建的保持系(荧光种子)可以产生等量的携带外源基因的花粉和不携带外源基因的花粉，自交授粉结实后获得两类分别携带和不携带外源基因的种子，其中，携带外源基因的荧光种子作为保持系，可以通过自交源源不断地继续生产不育系和保持系，而不携带外源基因的非荧光正常种子培育的植株可以作为不育系用作杂交育种的亲本。
[0111]由上述实施例 5和实施例6可以看出，本发明实现了其稳定创制水稻雄性不育系和保持系的发明目的。
[0112]实施例7:回交转育创制不育系
[0113]在已有水稻种质资源中选择性状优良的，如配合力强、抗病、抗虫和高产等优良农艺性状的水稻材料作为父本(轮回亲本，在实施例中，采用天丰，华268，华恢624，华211，华恢 3411，华恢 451，华恢 2855，R608，华恢 374、华恢 3501、H451、R608、华占、黄华占、H268、H819、沪闽粳等作为轮回亲本)，将不育基因和以通过上述方法获得的转基因事件作为母本，两者通过回交转育将轮回亲本制作成具有优良性状的新型不育系(图6)，创制了一批新型不育系和大大扩展了品种资源的杂交利用率，尤其是可以改变粳稻中几乎没有很好的两系杂交组合的现状，可扩展杂交粳稻种植面积，扩大了杂种优势利用范围，提高品种资源的利用效率。
[0114]工业实用性
[0115]本发明的构建体，能够有效地应用于水稻雄性不育系和保持系的构建，进而获得的育性稳定的水稻雄性不育系和保持系能够高效地应用于杂交种子的生产，从而能够获得安全、优质的杂交水稻种子。
[0116]尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。[0117] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或 多个实施例或示例中以合适的方式结合。
【权利要求】
1.一个花粉活性调控基因，其特征在于，所述花粉活性调控基因的编码区核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 2 所示。
2.权利要求1所述的花粉活性调控基因，其中所述的编码区核苷酸序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
3.—种表达盒，其特征在于，所述表达盒中含有一个花粉活性调控基因，所述花粉活性调控基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
4.一种构建体，其特征在于，所述构建体含有一个花粉活性调控基因，所述花粉活性调控基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
5.权利要求4所述的构建体，其中所述的花粉活性调控基因由一个花粉特异性表达的启动子驱动表达，所述花粉特异性表达的启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
6.权利要求5所述的构建体，其中所述的花粉活性调控基因还连有一个终止子，所述终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示。
7.权利要求4所述的构建体，其中所述的构建体还包含一个雄性不育恢复基因，所述雄性不育恢复基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
8.权利要求4或7所述的构建体，其中所述的构建体还含有一个筛选标记基因，所述筛选标记基因选自红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙/77基因和草丁膦乙酰转移酶编码基因的至少一种。
9.权利要求8所述的构建体，其中所述的红色荧光基因的核苷酸序列如SEQID NO:12所示。
10.权利要求9所述的构建体，其中所述的红色荧光基因连有一个启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
11.权利要求10所述的构建体，其中所述的启动子的5’端还连有一个增强子序列，所述增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
12.权利要求10所述的构建体，其中所述的红色荧光基因还连有一个终止子，所述终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
13.一种恢复雄性不育植株育性的方法，所述方法包括:将权利要求4-12之任一项所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的水稻纯合隐性雄性不育是由于育性恢复基因SEQ ID N0:4的生物学功能缺失所导致。
15.一种构建水稻雄性不育系的方法，其特征在于，包括: a)将权利要求4-12之任一项所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育雄性配子； b)培育所述第二水稻植株，以便获得不表达外源基因的种子，从而获得水稻雄性不育系O
16.权利要求15所述的方法，其中所述的水稻纯合隐性雄性不育是由于育性恢复基因SEQ ID N0:4的生物学功能缺失所导致。
17.一种用于制备杂交水稻的方法，其采用水稻雄性不育系，其特征在于，所述水稻雄性不育系是通过权利要求15所述的方法构建的。
18.水稻雄性不育系在制备杂交水稻中的用途，其特征在于，所述水稻雄性不育系是通过权利要求15述的方法构建的。
19.一种构建水稻雄性不育系的方法,其特征在于,包括: a)采用水稻纯合隐性雄性不育植株作为母本，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含Ms26基因的纯合隐性等位基因； b)将所述母本与轮回亲本进行回交转育，以便获得具有所述轮回亲本性状的水稻雄性不育系，其中，所述轮回亲本不具有Ms26基因的纯合隐性等位基因。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述轮回亲本具有选自配合力强、抗病、抗虫和高产的至少一种性状。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述轮回亲本为选自天丰、华268、华恢624、华 211、华恢 3411、华恢 451、华恢 2855、R608、华恢 374、华恢 3501、H451、R608、华占、黄华占、H268、H819、沪闽粳的至少一种。
22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，将所述母本与轮回亲本进行至少3次回交。
23.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述水稻纯合隐性雄性不育植株是通过权利要求15所述的方 法构建的。
【文档编号】C12N15/53GK104004775SQ201310581181
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年2月26日
【发明者】王海洋, 唐晓艳, 周君莉, 陈竹锋 申请人:未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司, 深圳兴旺生物种业有限公司, 兴旺投资有限公司