一种快速高效的引入定点突变的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速高效地引入定点突变的方法，该方法以整合型质粒YIplac211为载体，以其携带的URA3基因为筛选标记，通过正向重复序列的两次同源重组，实现了定点突变的引入。本发明在引入定点突变的同时并未有外源基因的残留，保证了菌株的安全性。此外，本发明也可运用于除酵母以外的其他工业菌株。
【专利说明】一种快速高效的引入定点突变的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地说是一种快速高效地引入定点突变的方法。
【背景技术】
[0002]随着分子生物学技术渗透到生物学的各个领域，生物工作者越来越注重基因的功能研究，有目的的改变编码特定氨基酸的碱基，获得突变体蛋白，研究蛋白质结构与功能的关系。定点突变技术应运而生成为了基因工程操作的重要手段，同时广泛应用于医学领域。目前，定点突变技术常用的方法主要有三种:(I)寡核苷酸引物介导的突变，(2)PCR介导的突变，如重叠延伸PCR法，大引物法等，(3)盒式突变。基于以上方法的原理，市场上出现了用于定点突变的试剂盒，可以实现一个甚至多个位点的突变。但都在一定程度上存在操作稍繁琐、转化效率不高、花费昂贵的问题。
[0003]质粒为研究定点突变技术提供很好的载体，但有时仅仅游离表达是不够的，如含有外源基因的自主复制载体不能稳定存在，克服这一缺点的方法之一就是将目的基因整合到基因组上。为了实现这个目的，我们使用很多标记基因，如铜抗性、氨苄抗性等，和一些报告基因，如氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、绿色荧光蛋白基因(gfp)等。这些外源基因的引入使得人们对生物的安全性及转基因食品的安全性产生了质疑。
[0004]基于以上考虑，我们需要一种快速高效的将定点突变引入工程菌基因组且不依赖于抗生素等标记基因的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种快速高效的定点突变的引入方法，利用盒式突变与PCR介导的突变相结合的方法获得携带定点突变的质粒载体，通过两步正向序列的同源重组成功地将定点突变引入到工业菌株，而没有残留任何外源碱基。
[0006]为实现上述目的，本发明提出以下技术方案:一种快速高效引入定点突变的方法，其特征在于，主要包括以下几个步骤:
[0007]( I)根据突变碱基的位置，设计包含酶切位点的正向、反向引物，PCR扩增含有定点突变的片段^fPCR产物与YIplac211质粒同时酶切，用T4聚合酶连接；将连接体系导入DH5a感受态细胞，获得重组质粒，酶切验证，测序鉴定；
[0008](2)获得工业菌株的尿嘧啶营养缺陷型:设计正向、反向引物，从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W303_la扩增突变基因ura3 (乳清昔5_憐酸脱竣酶基因)，用醋酸锂转化法导入出发菌株，获得其尿嘧啶营养缺陷菌株；
[0009](3)在突变片段上选择一个合适单一酶切位点将(I)中重组质粒线性化；运用醋酸锂转化法，将其导入步骤(2)获得的营养缺陷型菌株，通过正向重复序列的第一次重组，将质粒序列整合到了基因组上，在不含尿嘧啶的完全合成培养基上筛选阳性转化子同时菌落PCR加以验证；
[0010](4)将(3)得到的阳性转化子，涂布在含5-氟乳清酸的完全合成培养基上，基因组发生第二次重组，将质粒弹出，可得到野生型菌株和定点突变的菌株；
[0011](5)通过测序得以最终确定携带定点突变的菌株；
[0012](6)用(2)中引物扩增正常的URA3基因，将其导入(5)获得的菌株，回复其营养缺陷。
[0013]有益效果:
[0014]本发明提供了一种以URA3为遗传标记通过正向重复序列两次基因重组将定点突变引入到工业菌株基因组。以URA3为遗传标记避免了传统方法中抗性基因的使用，避免了抗生素基因在不同物种间传播扩散的可能。正向两次同源重组曾应用于基因的无痕敲除系统，本发明将之应用于定点突变引入到工程菌基因组，拓展其应用范围，提供了一种将定点突变从质粒载体转移至基因组的方法，进而实现了在基因组上完成相关定点突变的研究。
[0015]定点突变的验证的难点在于基因组改变较少，很难验证，本发明通过运用两次基因重组的方法，使这一难题迎刃而解。同源重组位于基因组的特定部位，可设计特异性引物通过PCR加以验证，可操作性强，可验证性强。因此，本发明可广泛应用于基因工程领域和医学领域，推动定点突变的相关研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为重组质粒YIplac211_PM的电泳验证图；
[0017]图2 为实施例菌株 BY14aAura3、BY14aAura3-PM、BY14a_PM 的表型验证图；
[0018]图3为线性化质粒YIplac 211_PM与酵母基因组两次正向序列同源重组的流程示意图；
[0019]图4为转化子BY14aAura3-YIplac211_PM的电泳验证图及所用验证引物定位图；
[0020]图5为第二次同源重组的转化子BY14a Aura3_PM的测序结果比对图。
【具体实施方式】
[0021]下面通过具体的实施方案叙述本发明的方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0022]实施例1:一种快速高效引入点突变的方法
[0023]先前实验表明，酵母菌株fill (比利时植物微生物研究所Johan M.Thevelein教授馈赠)具有明显的高温耐受性，且该优良性状是由该酵母的CYR I基因C端1682位氨基酸突变引起的。本实施例将该位置的定点突变通过本发明方法引入到工业酵母BY14a (购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址:北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，100015,保藏编号 CICC31616,酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae)中。
[0024]酵母基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自Solarbio公司，所用到限制性内切酶及感受态细胞DH5 a均购自Takara公司。
[0025]本实施例中所述不含尿嘧啶的完全培养基组成如下:[0026]YNB 6.7g/L,葡萄糖 20g/L, Ura Minus Media Dropout powder (不含尿嘧唳的培养基粉末)0.83g/L，腺嘌呤50mg/L，组氨酸100mg/L，亮氨酸100mg/L，色氨酸100mg/L，液体培养基PH5.6，固体培养基添加2%的琼脂粉，pH6.5。
[0027]本实施例中所述添加5-氟乳清酸的完全培养基组成如下:
[0028]制备IOOmL的5_氟乳清酸的完全培养基，其中含:YNB1.4g，葡萄糖4g，Ura MinusMedia Dropout powder0.17g, 5-FOA0.2g,尿喃P定 20mg,腺嘌呤 IOmg,亮氨酸 40mg,组氨酸30mg,色氨酸20mg,蒸懼水定容到100mL。
[0029]45°C下连续搅拌至各组分全部溶解，过滤除菌。将另外的IOOmL灭过菌的3.5%(m/v)的琼脂粉溶液与其混合，缓慢摇匀，倒入适当数量的无菌培养皿，冷却成型。
[0030]根据Genebank中酵母基因组数据和整合质粒序列，设计本实施例中用到的引物。
[0031]表1.本实施例中用到的引物
【权利要求】
1.一种快速高效引入定点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)根据突变碱基的位置，设计包含酶切位点的正向、反向引物，PCR扩增含有定点突变的片段^fPCR产物与YIplac211质粒同时酶切，用T4聚合酶连接；将连接体系导入DH5a感受态细胞，获得重组质粒，酶切验证，测序鉴定； (2)获得工业菌株的尿嘧啶营养缺陷型:设计正向、反向引物，从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W303_la扩增突变基因ura3,用醋酸锂转化法导入出发菌株，获得其尿嘧啶营养缺陷菌株； (3)在突变片段上选择一个合适单一酶切位点将(I)中重组质粒线性化；运用醋酸锂转化法，将其导入步骤(2)获得的营养缺陷型菌株，通过正向重复序列的第一次重组，将质粒序列整合到了基因组上，在不含尿嘧啶的完全合成培养基上筛选阳性转化子同时菌落PCR加以验证； (4)将(3)得到的阳性转化子，涂布在含5-氟乳清酸的完全合成培养基上，基因组发生第二次重组，将质粒弹出，可得到野生型菌株和定点突变的菌株； (5)通过测序得以最终确定携带定点突变的菌株； (6)用(2)中引物扩增正常的URA3基因，将其导入(5)获得的菌株，回复其营养缺陷。
2.根据权利要求1所述的快速高效引入定点突变的方法，其特征在于，步骤(3)所述不含尿嘧啶的完全合成培养基组成如下:YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，Ura Minus MediaDropout powder0.83g/L,腺嘌呤 50mg/L,组氨酸 lOOmg/L,亮氨酸 lOOmg/L,色氨酸 IOOmg/L,液体培养基pH5.6，固体培养基 添加2%的琼脂粉，pH6.5。
3.根据权利要求1所述的快速高效引入定点突变的方法，其特征在于，步骤(4)所述含5-氟乳清酸的完全培养基制备方法如下:YNB1.4g,葡萄糖4g, Ura Minus Media Dropoutpowder0.17g, 5-FOA0.2g,尿嘧唳20mg,腺嘌呤IOmg,亮氨酸40mg,组氨酸30mg,色氨酸20mg,蒸馏水定容到lOOmL，45°C下连续搅拌至各组分全部溶解，过滤除菌，将另外的IOOmL灭过菌的3.5% (m/v)的琼脂粉溶液与其混合，缓慢摇匀，倒入无菌培养皿，冷却成型。
【文档编号】C12N1/21GK103589748SQ201310580830
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】肖冬光, 刘广新, 董建, 张翠英 申请人:天津科技大学