一种青霉素g酰化酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种通过基因定点突变方法获得的合 成性能提高的青霉素 G酰化酶突变体、及其在生产β_内酰胺类抗生素中的用途。
【背景技术】
[0002] 青霉素 G酰化酶(Penicillin G Acylase，E.C.3.5.1.11，简称PGA)是制备半合成 内酰胺类抗生素中的重要用酶，该酶主要用于水解青霉素 G和头孢菌素 G，生成相应的化 合物母核比如6-氨基青霉烧酸(6_細：[110?611；[(3；[11;[11；[03(^(1，6-4?4)和7-氨基-3-去乙酰氧 基头抱烧酉爱（7-Amin0-deacetoxy-cephalosporanic-acid，7-ADCA) (Abian et al., Biotechnol Prog，2003，19(6)，1639-42，2003);还可用于催化母核6-APA、7-ADCA或其他母 核与各种D-氨基酸侧链反应生成新的半合成β-内酰胺抗生素(半合成青霉素和头孢霉素） (Bruggink et al.l998；Yang and Wei 2003；Youshko et al.2004；Gabor et al.2005)0
[0003] 酶法合成β-内酰胺抗生素的研究开始于上世纪60年代。相对于化学法(Wegman et al·，Advanced Synthesis&Catalysis, 343(6-7) ,559-576,2001)，由于其具有不使用有机 溶剂、反应条件温和、以及环保等优点，酶法合成β-内酰胺抗生素逐渐成为β-内酰胺抗生素 工业研究中的一个热点（Giordano，Ribeiro，and Giordano，Bio techno logy Advances，24 (1)，27-41，2006)。理论上，β-内酰胺类抗生素的酶法合成可通过下述两种途径实现 (Kasche.Enzyme and Microbial Technology,8(1)，4_16，1986)，即1)热力学控制，即逆转 水解反应;和2)动力学控制，即酰基转移。动力学控制的催化机制涉及酶和酰基供体反应， 形成酰基酶中间体，当中间体遇到内酰胺母核即可发生耦合，形成半合成内酰胺抗生 素;而水作为竞争性亲核性试剂，引起反应物和产物的水解，当产物合成速率与产物水解速 率相当时，该合成产物量达到最大值。
[0004]目前，通过动力学控制途径，利用青霉素酰化酶催化供体酰基转移到β-内酰胺类 抗生素母核来生产半合成β-内酰胺类抗生素的酶法工艺已日益成为化学合成法的有效替 代（Bruggink et al·1998;Wegman et al·2001)。
[0005] 与传统的化学合成法相比，β-内酰胺抗生素的酶法合成面临的主要问题是：在合 成抗生素的同时又发生两个副反应，即1)水解活化的酰基供体和2)水解生成的抗生素，从 而导致酰基供体和生成的抗生素的减少，进而造成了母核转化率偏低，即合成产物/水解产 物(S/Η)的比值偏低，而且酶自身的特性对S/Η值的影响依然是最重要的(Alkema et al.， Eur.J.BiOChem，270(18)，3675-83,2003)。利用蛋白质工程来改善青霉素 G酰化酶的合成性 能已有报道(Alkema et al,Protein Eng. ,13(12),857-63,2000)。在大肠杆菌来源的青霉 素 G酰化酶中，aR 145、aF146和即24这三种氨基酸位于酰化酶与青霉素 G结合的口袋位置， 对酶的合成性能具有关键的作用（Alkema et al.，Protein Engineering Design& Selection,17(5),473-480,2004)。
[0006] 利用有理设计和定向进化结合的方法，青霉素 G酰化酶PAS2把aR160、aF161和i3F24 这三个氨基酸筛选到在氨苄青霉素和头孢氨苄合成时性能大大提高的工程菌中（Gabor， E.M.and D.B.Janssen，Protein Eng Des 361，2004，17(7)，571_9)，上述报道都提高了青 霉素 G酰化酶的合成性能。
【发明内容】
[0007] 为了得到合成性能、尤其是S/Η值进一步提高的青霉素 G酰化酶，本发明利用基因 工程技术来对微生物来源的野生型青霉素 G酰化酶进行改造，构建高合成性能的青霉素 G酰 化酶突变体，从而进行内酰胺类抗生素的工业化生产。
[0008] 为此，本发明通过定点突变的方法对野生型青霉素 G酰化酶进行改造和筛选，获得 了高合成性能的突变体。
[0009] 因此，本发明的第一个目的在于提供一种青霉素 G酰化酶。
[0010] 本发明的第二个目的在于提供编码上述青霉素 G酰化酶的基因。
[0011] 本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。
[0012] 本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。
[0013] 本发明的第五个目的在于提供上述酶或微生物在生产β-内酰胺类抗生素中的用 途。
[0014] 为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0015] -种青霉素 G酰化酶，其氨基酸序列为：
[0016] SEQ ID Ν0:3,其为SEQ ID NO: 1第44位的D替换为L的突变体，其氨基酸序列为：
[0017] MKQQWLSAALLAASSCLPAMAAQPVAPAAGQTSEAVAARPQTALGKVTIRRDAYGMPHVYADTVYGIFYGYGYAVAQ DRLFQMEMARRSTQGRVAEVLGASMVGFDKSIRANFSPERIQRQLAALPAADRQVLDGYAAGMNAWLARVRAQPGQL MPKEFNDLGFAPADWTAYDVAMIFVGTMANRFSDANSEIDNLALLTALKDRHGAADAMRIFNQLRWLTDSRAPTTVP AEAGSYQPPVFQPDGADPLAYALPRYDGTPPMLERVVRDPATRGVVDGAPATLRAQLAAQYAQSGQPGIAGFPTTSN MWIVGRDHAKDARSILLNGPQFGffffNPAYTYGIGLHGAGFDVVGNTPFAYPSILFGHNAHVTWGSTAGFGDDVDIFA EKLDPADRTRYFHDGQWKTLEKRTDLILVKDAAPVTLDVYRSVHGLIVKFDDAQHVAYAKARAWEGYELQSLMAWTR KTQSANWEQWKAQAARHALTINWYYADDRGNIGYAHTGFYPRRRPGHDPRLPVPGTGEMDWLGLLPFSTNPQVYNPR QGFIANWNNQPMRGYPSTDLFAIVWGQADRYAEIETRLKAMTANGGKVSAQQMWDLIRTTSYADVNRRHFLPFLQRA VQGLPADDPRVRLVAGLAAWDGMMTSERQPGYFDNAGPAVMDAWLRAMLRRTLADEMPADFFKWYSATGYPTPQAPA TGSLNLTTGVKVLFNALAGPEAGVPQRYDFFNGARADDVILAALDDALAALRQAYGQDPAAWKIPAPPMVFAPKNFL GVPQADAKAVLCYRATQNRGTENNMTVFDGKSVRAVDVVAPGQSGFVAPDGTPSPHTRDQFDLYNTFGSKRVWFTAD EVRRNATSEETLRYPR；
[0018] SEQ ID N0:4,其为SEQ ID NO: 1第130位的R替换为Μ的突变体，其氨基酸序列为：
[0019] MKQQWLSAALLAASSCLPAMAAQPVAPAAGQTSEAVAARPQTADGKVTIRRDAYGMPHVYADTVYGIFYGYGYAVAQ DRLFQMEMARRSTQGRVAEVLGASMVGFDKSIRANFSPERIQRQLAALPAADMQVLDGYAAGMNAWLARVRAQPGQL MPKEFNDLGFAPADWTAYDVAMIFVGTMANRFSDANSEIDNLALLTALKDRHGAADAMRIFNQLRWLTDSRAPTTVP AEAGSYQPPVFQPDGADPLAYALPRYDGTPPMLERVVRDPATRGVVDGAPATLRAQLAAQYAQSGQPGIAGFPTTSN MWIVGRDHAKDARSILLNGPQFGffffNPAYTYGIGLHGAGFDVVGNTPFAYPSILFGHNAHVTWGSTAGFGDDVDIFA EKLDPADRTRYFHDGQWKTLEKRTDLILVKDAAPVTLDVYRSVHGLIVKFDDAQHVAYAKARAWEGYELQSLMAWTR KTQSANWEQWKAQAARHALTINWYYADDRGNIGYAHTGFYPRRRPGHDPRLPVPGTGEMDWLGLLPFSTNPQVYNPR QGFIANWNNQPMRGYPSTDLFAIVWGQADRYAEIETRLKAMTANGGKVSAQQMWDLIRTTSYADVNRRHFLPFLQRA VQGLPADDPRVRLVAGLAAWDGMMTSERQPGYFDNAGPAVMDAWLRAMLRRTLADEMPADFFKWYSATGYPTPQAPA TGSLNLTTGVKVLFNALAGPEAGVPQRYDFFNGARADDVILAALDDALAALRQAYGQDPAAWKIPAPPMVFAPKNFL GVPQADAKAVLCYRATQNRGTENNMTVFDGKSVRAVDVVAPGQSGFVAPDGTPSPHTRDQFDLYNTFGSKRVWFTAD EVRRNATSEETLRYPRMKQQWLSAALLAASSCLPAMAAQPVAPAAGQTSEAVAARPQTADGKVTIRRDAYGMPHVYA DTVYGIFYGYGYAVAQDRLFQMEMARRSTQGRVAEVLGASMVGFDKSIRANFSPERIQRQLAALPAADMQVLDGYAA GMNAWLARVRAQPGQLMPKEFNDLGFAPADWTAYDVAMIFVGTMANRFSDANSEIDNLALLTALKDRHGAADAMRIF NQLRWLTDSRAPTTVPAEAGSYQPPVFQPDGADPLAYALPRYDGTPPMLERVVRDPATRGVVDGAPATLRAQLAAQY AQSGQPGIAGFPTTSNMffIVGRDHAKDARSILLNGPQFGffffNPAYTYGIGLHGAGFDVVGNTPFAYPSILFGHNAHV TWGSTAGFGDDVDIFAEKLDPADRTRYFHDGQWKTLEKRTDLILVKDAAPVTLDVYRSVHGLIVKFDDAQHVAYAKA RAWEGYELQSLMAWTRKTQSANWEQffKAQAARHALTINWYYADDRGNIGYAHTGFYPRRRPGHDPRLPVPGTGEMDff LGLLPFSTNPQVYNPRQGFIANWNNQPMRGYPSTDLFAIVWGQADRYAEIETRLKAMTANGGKVSAQQMWDLIRTTS YADVNRRHFLPFLQRAVQGLPADDPRVRLVAGLAAWDGMMTSERQPGYFDNAGPAVMDAWLRAMLRRTLADEMPADF FKWYSATGYPTPQAPATGSLNLTTGVKVLFNALAGPEAGVPQRYDFFNGARADDVILAALDDALAALRQAYGQDPAA WKIPAPPMVFAPKNFLGVPQADAKAVLCYRATQNRGTENNMTVFDGKSVRAVDVVAPGQSGFVAPDGTPSPHTRDQF DLYNTFGSKRVWFTADEVRRNATSEETLRYPR；
[0020] SEQ ID NO:5,其为SEQ ID NO: 1第186位的F替换为A的突变体，其氨基酸序列为：
[0021] MKQQWLSAALLAASSCLPAMAAQPVAPAAGQTSEAVAARPQTADGKVTIRRDAYGMPHVYADTVYGIFYGYGYAVAQ DRLFQMEMARRSTQGRVAEVLGASMVGFDKSIRANFSPERIQRQL