专利名称：突变的青霉素扩环酶以及用其制备7－adca的方法
技术领域：
本发明涉及对青霉素G具有高底物特异性的突变的青霉素扩环酶(expandase)，表达该突变的扩环酶的重组细胞，以及用该突变的扩环酶制备7-氨基去乙酸基头孢菌素酸(7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，7-ACDA)的方法。
已报道一种天然酶，去乙酸基头孢菌素C合酶(deacetoxycephalosporain C synthase，DAOCS，或扩环酶)可能负责扩环反应的催化。链霉菌属(如带小棒链霉菌、生二素链霉菌、教酒链霉菌)可以产生扩环酶。如EP-A-0341892所述，扩环酶可以从带小棒链霉菌获得，而且已经被克隆。对扩环酶的化学和功能性质已经进行了很好的研究，见EP-A-0366354。遗憾的是，天然扩环酶对青霉素G的底物特异性低于对正常底物青霉素N的(Rollins，M.J.等，Can.J.Microbiol.341196-1202(1998)和Crawford，L.等，Bio/Technology，1358-62(1995))。青霉素G可以从商业途径便宜地获得。相反，青霉素N较贵，而且不易获得。另外，即使将青霉素N扩环，其侧链也不能被容易地除去。因此，工业制备中仍然使用7-ADCA的化学合成，而不是酶促合成。
有许多申请涉及通过扩环酶生成7-ADCA。USP 5,731,165描述了通过对青霉素G的酶促扩环活性，用表达扩环酶的产黄青霉菌转化体菌株，制备和回收7-ADCA的方法。USP 5,559,005公开了用具有扩环酶活性的，能够接受己二酰-6-氨基-青霉烷酸(己二酰-6-APA)作为底物的转化的产黄青霉菌菌株，制备7-氨基-头孢菌素酸(7-ACA)或7-ADCA的生物方法。然而，因为在体外，己二酰-6-APA和青霉素G都是天然扩环酶的不良底物，因此当在体内应用时，其不太可能具有高扩环效率。
最近，Chih H.S.等(Biochemical and BiophysicalResearch Communications，287507-513(2001))公开了一种突变的DAOCS，其包括N304L的氨基酸置换。USP5,919,680描述了一种扩环酶，其具有改变的来自天然扩环酶的氨基酸序列，导致改变的底物特异性。在该专利中，提到了几个氨基酸位点，通过改变一个或多个所提到的氨基酸而产生的突变的扩环酶在青霉素G和青霉素N的混和物中显示更高的青霉素G与青霉素N的活性比，但是其具有低于野生型扩环酶的对青霉素G和青霉素N的单独的活性。因此，仍需要开发对青霉素G具有更高底物特异性和酶促活性的突变的青霉素扩环酶。
本发明的一个目的是提供突变的青霉素扩环酶，其包括在一个或多个残基位点的氨基酸置换，所述残基位点相应于野生型扩环酶的残基位点，其选自甲硫氨酸73、丝氨酸79、缬氨酸275、亮氨酸277、半胱氨酸281、甘氨酸300、天冬酰胺304和异亮氨酸305，条件是在天冬酰胺304的残基位点的氨基酸置换不是N304L。具体地说，本发明提供突变的青霉素扩环酶，其包括一个或多个选自M73T、S79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L和I305M的特定氨基酸置换，其中氨基酸置换的残基位点相应于野生型的残基位点。
本发明的另一目的是提供编码突变的青霉素扩环酶的分离的核酸分子。
本发明的另一目的是提供包含本发明的核酸分子和经操作而连接于其的调节序列的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含本发明的核酸分子的重组细胞。
在另一方面，本发明提供产生突变的青霉素扩环酶的方法。在本发明的一个实施方案中，该方法包括表达本发明的核酸分子，并回收突变的青霉素扩环酶。在本发明的另一实施方案中，该方法包括培养本发明的重组细胞以表达突变的青霉素扩环酶，并从细胞培养物中回收突变的青霉素扩环酶。
在另一方面，本发明提供制备7-ADCA的方法，所述方法包括用突变的青霉素扩环酶处理青霉素G以制备苯乙酰-7-ADCA，接着将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。
在再一方面，本发明提供制备7-ADCA的方法，所述方法包括以下步骤(a)在适于产生青霉素G和表达突变的青霉素扩环酶的条件下，培养用本发明的核酸分子转化的产青霉素G细胞，以使青霉素G被突变的扩环酶扩环，并制备苯乙酰-7-ADCA；(b)将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。
从以下的具体实施方式
和
将完全理解本发明。
图1是本发明的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1至9分别是分子量标准参照物和突变型YS5、YS8、YS11、YS12、YS16、YS49、YS53和YS59的纯化的DAOCS。各DAOCS加样量为5μg。
图2是本发明的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1和2分别代表分子量标准参照物和YS67突变型的纯化的DAOCS。DAOCS的加样量是5μg。
图3是本发明的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1是分子量标准参照物。泳道2至5代表与本发明无关的样品。泳道6和7分别代表SC29和SC39突变型的纯化的DAOCS。DAOCS的加样量是5μg。
图4是本发明的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1代表分子量标准参照物。泳道2至5代表与本发明无关的样品。泳道6至9分别代表YS98、YS108、YS115和YS125的纯化的DAOCS。DAOCS的加样量是5μg。
本文中所使用的术语“野生型青霉素扩环酶”指从链霉菌属获得的天然青霉素扩环酶。优选地，该野生型扩环酶从带小棒链霉菌获得。天然青霉素扩环酶及其相应的基因(cefE基因)已在已有技术(例如EP-A-0366354和EP-A-0341892)中很好地表征和描述。本领域技术人员可以从已有技术容易地获得野生型青霉素扩环酶的核酸序列及相应的氨基酸序列。
本发明的突变的青霉素扩环酶包括其功能等价物。如本文中所用，突变的青霉素扩环酶的“功能等价物”可能包含位于除上述位点之外的位点的其它氨基酸突变(例如缺失、添加或置换)，其中所述其它氨基酸突变导致沉默改变，因此基本上不影响突变的青霉素扩环酶的功能(例如酶活性)。另外，在突变的青霉素扩环酶“功能等价物”中，特定的氨基酸置换(即选自M73T、S79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L和I305M的)可以与类似特征的导致沉默改变的其它氨基酸置换交换。例如，具有“S79D”氨基酸置换的突变的青霉素扩环酶是具有“S79E”氨基酸置换的突变的青霉素扩环酶的功能等价物，因为氨基酸D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)都被归类为酸性氨基酸且性质相似。
在另一方面，本发明提供编码本发明的突变的青霉素扩环酶的分离的核酸分子。本发明的分离的核酸分子通过使编码野生型青霉素扩环酶的核酸突变而获得。常规突变诱发技术在本领域是公知的，如用γ-射线或紫外线照射，或用诱变剂处理，诱变剂如羟胺和乙基甲烷(ethylmethane)，或定点诱变。本领域技术人员能够选择适宜的突变技术而获得突变的核酸分子。突变的核酸分子可以被进一步克隆并根据它们的生物活性被选择。用来获得本发明的分离的核酸分子的更详细的技术，包括诱变、克隆和生物活性筛选，将在以下实施例中描述。
根据本发明，可以将分离的核酸分子插入载体以形成重组载体。本文所用的术语“载体”指核酸分子，其能够以表达或复制所感兴趣的核酸片段为目的而携带并转移该核酸片段进入宿主细胞。具体地说，载体指质粒、粘粒、噬菌体或病毒。通常，所感兴趣的核酸片段经操作而被连接到调节序列上，以使例如当引入宿主细胞时，该核酸片段可以在调节序列的控制下被表达。调节序列可以包括，例如启动子序列(例如巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子和T7启动子)、复制起点和其它调节序列(例如SD序列和终止序列)。优选地，所感兴趣的核酸片段可以连接于另一核酸片段，以产生融合多肽(例如组氨酸标记的融合多肽)，以利于随后的纯化过程。鉴定和选择调节序列的方法是本领域技术人员公知的，并且在文献中有广泛描述。本领域技术人员根据本说明书和公知技术，可以容易地构建该重组载体。
可以将本发明的重组载体引入宿主细胞，以产生突变的青霉素扩环酶。因此，用重组载体转化的重组细胞在本发明的范围内。这种重组细胞可以是原核细胞(例如细菌)或真核细胞(例如真菌、动物和植物细胞)。特别地，本发明的重组细胞是产青霉素G细胞，优选是产黄青霉菌细胞，如下文所述，该细胞可以用于在体内产生7-ADCA。许多转化技术，如氯化钙处理、钙-PEG过程、电穿孔、DEAE-糊精介导的转染、脂转染和微注射在很多文献中有详述。本领域技术人员可以根据宿主细胞及要引入宿主细胞的载体的性质选择合适的技术。
本发明还提供产生突变的青霉素扩环酶的方法。可以在适于表达突变的青霉素扩环酶的条件下培养上述重组细胞，然后回收并纯化所表达的扩环酶。本领域技术人员将会理解，回收和纯化方法在很多参考文献中有广泛描述，并且不限于，例如，各种色谱技术(例如HPLC或亲和柱)。
上面所提到的基因工程方法如DNA诱变、克隆、载体构建、转化、蛋白质表达，以及纯化可以由本领域技术人员完成，其可以参见，例如，Molecular CloingA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Frisch和T.Maniatis编著，(1989)。
本发明还涉及制备7-ADCA的方法，所述方法包括用本发明的突变的青霉素扩环酶处理青霉素G以制备苯乙酰-7-ADCA，以及将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。特别地，如上所述表达并回收突变的扩环酶，然后加入底物青霉素G。将混合物在适于该突变的扩环酶的酶活性的条件下保温(例如在30℃的温度下)，以使通过突变的酶进行扩环反应，将底物青霉素G转化为苯乙酰-7-ADCA。优选地，例如，可以通过简单溶剂萃取而纯化苯乙酰-7-ADCA，然后用适宜的酶(例如青霉素酰胺酶，如EP-A-0453047所述)处理，以除去苯乙酰侧链，并获得期望的7-ADCA。另一方面，可以将底物青霉素G直接加入表达本发明的突变的扩环酶的重组细胞的细胞培养物中。然后，所表达的扩环酶和青霉素G反应，并将其转化为苯乙酰-7-ADCA，接着将苯乙酰-7-ADCA去酰化以产生期望的7-ADCA。
已经发现用扩环酶编码基因转化的产青霉素G细胞(例如产黄青霉菌)能够在体内产生苯乙酰-7-ADCA。因此，本发明的另一方面提供用产青霉素G细胞制备7-ADCA的方法，所述方法包括以下步骤(a)在适于产生青霉素G和表达本发明的突变的扩环酶的条件下培养用本发明的重组载体转化的产青霉素G细胞，以使青霉素G被突变的扩环酶扩环，并产生苯乙酰-7-ADCA；(b)将苯乙酰-7-ADCA去酰化以产生7-ADCA。本文所用的术语“产青霉素G细胞”指能够在一般条件下自然地产生青霉素G的细胞，而不用任何基因工程技术(例如转化)。优选地，产青霉素G细胞是产黄青霉菌细胞。可以任选地通过过滤和萃取步骤纯化来自步骤(a)的苯乙酰-7-ADCA。详细的过程，如这种细胞的转化和发酵，以及所产生的苯乙酰-7-ADCA的纯化已经在已有技术中描述，如US 5,919,680和EP 5,731,165，这两篇文献引入本文作参考。
还开发了用于分离青霉素G和头孢菌素G的方法，用于生物测定筛选。将硅胶板60 F254用作固相，而液相是氯仿∶丙酮∶醋酸＝6∶5∶0.5(体积比)的混合物。将C14标记的青霉素G用于用20μg细胞提取物(用Bio-Rad Bradford试剂盒，以BSA为标准定量)进行的标准测定中，加入乙醇后，混合物不经离心而直接施加于TLC板上。实施例3 定点诱变从带小棒链霉菌PCR克隆野生型扩环酶基因(即cefE)，并将其插入pET30a NdeI-Hind III位点，所得到的质粒被命名为pYS16。将Quick Change Mutagenesis Kit用于产生pYS16的定点突变型。使用Swiss-Pdb Viewer(V3.7b2)程序，通过选择活性中心周围10内的残基，基于DAOCS的晶体结构(ValegardK.等，Nature，394805-809(1998))选择突变位点。将各位点首先转变为Ala残基，然后转变为带正电残基，疏水残基和含硫残基。根据制造商的说明书设计引物。通过对含有基因的质粒进行DNA测序而确认所得的突变型，并制备细胞粗提物，进行DAOCS活性测定。实施例4 DAOCS活性测定BL21(DE3)转化体于30℃下，在5ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中生长过夜。将该培养物用于接种100ml同样的培养基，并在30℃生长1小时。然后加入0.1mM IPTG，以在30℃间接诱导DAOCS 4小时。收集细胞，用缓冲液A(50mMMops/pH7.5，1mM PMSF，1mM DTT和0.5μg/ml亮抑酶肽)洗涤，超声(VCX750；Sonics & Materials，美国)溶解，在15000xg离心15分钟。将该上清液用作细胞提取物。
对青霉素G，将20μl细胞提取物加入到标准200μl测试反应液中，该溶液含有50mM Mops/pH 7.5，4mM抗坏血酸、1mMFeSO4、4mMα-戊酮二酸和7mM青霉素G，并在30℃保温20分钟。通过加入200μl乙醇终止反应，接着在15000xg离心5分钟。通过HPLC分析上清液中头孢菌素G的浓度，进样40μl。流动相为含有19％乙腈的25mM磷酸钾/pH 6.5，流速为1ml/min。在215nm处检测，头孢菌素G的保留时间是8.5分钟，青霉素G的保留时间是12.5分钟，通过LC-MS确认DAOCS反应中保留时间为8.5分钟的产物的分子量为370。得到定点突变型如YS49(L277K)、YS8(I305L)、YS11(I305M)和Y12(N304K)，它们对青霉素G比现有菌株YS16具有更高的扩环活性。上述突变的氨基酸的不同组合也是通过定点诱变构建的。实施例5 DAOCS纯化将突变体的细胞提取物(2ml)加入用缓冲液B(50mMMops/pH 7.5，1mM DTT，0.4mM pefabloc SC，0.5μg/ml亮抑酶肽)平衡的HiTrap Q柱(5ml)上。然后用20ml缓冲液B洗柱，接着用25ml含120mM NaCl的缓冲液B进一步冲洗，DAOCS被20ml含150mM NaCl的缓冲液B洗脱下来。合并含DAOCS的部分(10ml)，用UFl5装置(NMWL 5K；Millipore)浓缩，并加载到Hiload Superdex 75(16/60)柱上，该柱经缓冲液B以1ml/min的流速预平衡。通过SDS-PAGE检测，这样纯化出的DAOCS的纯度高于90％，见图1和图2，立即将其于-80℃保存于1mM DTT和2mg/ml BSA中。实施例6 纯化的DAOCS的动力学测定按照动力学测定(Kinetic assay)进行标准青霉素G测定，但使用20μg纯化的DAOCS，并且α-戊酮二酸的浓度降低为1mM。通过Hans-Woolf Plot从平行三份试验得到动力学参数。对于用青霉素N作为主要底物的测定，将总体积为240μl的反应液在30℃保温10分钟，该反应液含有50mM Mepes/pH 7.5，0.4mM抗坏血酸，0.1mM FeSO4，0.1mM α-戊酮二酸，0.1mM青霉素N和0.5μg纯化的DAOCS，然后加入等体积的10mM EDTA/pH7.5，该混合物用UFl5装置(NMWL 5K；Millipore)超滤。滤液通过HPLC分析，用25mM磷酸钾/pH 6.5作为流动相。DAOC和青霉素N的保留时间分别为12分钟和13.5分钟。动力学参数的结果列于表1，其中参数的定义和计算在Lehninger等，Principles of Biochemistry，2.sup.nd Ed.WorthPublishers，纽约(1993)，其引入本文作参考。表1青霉素N和青霉素G的动力学参数菌株 Km(mM) Kcat(S-1) Kcat/Km(M-1S-1)青霉素NYS16(野生型) 0.014±0.006 0.307±0.03822000YS5(V275I) 0.012±0.003 0.252±0.02020000YS8(I305L) 0.006±0.002 0.284±0.03044000YS11(I305M)0.012±0.001 0.310±0.00426000YS12(N304K)0.004±0.001 0.366±0.02392000YS125(N304L) 0.018±0.004 0.415±0.06323000YS49(L277K)0.011±0.005 0.220±0.04220000YS53(C281Y)0.006±0.001 0.273±0.01447000YS59(S79E) 0.009±0.003 0.178±0.01920000YS115(M73T)0.006±0.003 0.239±0.00940000YS67(V275I&I305M) 0.013±0.005 0.316±0.03224000青霉素GYS16(野生型) 2.58±0.22 0.0302±0.0007 12YS5(V275I) 1.68±0.20 0.0335±0.0008 20YS8(I305L) 0.66±0.07 0.0506±0.0010 77YS11(I305M)0.75±0.04 0.0968±0.0013 129YS12(N304K)0.22±0.03 0.0376±0.0002 171YS125(N304L) 0.55±0.12 0.0268±0.0004 49YS49(L277K)0.72±0.02 0.0343±0.0005 48YS53(C281Y)0.68±0.34 0.0496±0.022 73YS59(S79E) 0.75±0.02 0.0210±0.0002 28YS115(M73T)0.74±0.16 0.0418±0.0014 56YS67(V275I&I305M) 0.25±0.08 0.0972±0.025 389
如表1所示，从kcat/Km(M-1S-1)参数可以看出，所有突变型对青霉素G的扩环活性均比野生型扩环酶高2至32倍。相比而言，除了突变型YS12以外，这些突变型没有导致得自青霉素N的动力学参数的显著变化，YS12的扩环活性比野生型YS16高4倍。比较本发明的YS12(N304K)和Chih H.S.等(见上)的YS125(N304L)，YS125对青霉素G的扩环活性比野生型扩环酶高4倍，而YS12对青霉素G的扩环活性比野生型高14倍。
各突变型的相对活性见表2，其根据Chih H.S.等(见上)计算，将野生型DAOCS的活性作为100％。用1mM青霉素G进行测定，其它条件同标准测定。表2与野生型相比，纯化的组合的突变型的相对活性DAOCS菌株 突变位点相对活性(％)YS16 --- 100YS67 275I，305M 500YS74 275I，304K，305L300YS81 275I，281Y，305M1290YS88 79E，275I，281Y 430YS94 281Y，304K，305M650YS96 79E，275I，305M 1110YS100 79E，275I，305L 470YS76 79E，275I，281Y，305L 250YS108 300V410SC29 275I，281Y，300V620SC39 73T，281Y 610
权利要求
1.突变的青霉素扩环酶，其包括在一个或多个残基位点的氨基酸置换，所述残基位点相应于野生型扩环酶的残基位点，其选自甲硫氨酸73、丝氨酸79、缬氨酸275、亮氨酸277、半胱氨酸281、甘氨酸300、天冬酰胺304和异亮氨酸305，条件是在天冬酰胺304的残基位点的氨基酸置换不是N304L。
2.权利要求1的突变的青霉素扩环酶，其中野生型扩环酶从带小棒链霉菌获得。
3.权利要求1的突变的青霉素扩环酶，其包括在一个或多个残基位点的选自M73T、S79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L和I305M的氨基酸置换。
4.编码权利要求1的突变的青霉素扩环酶的分离的核酸分子。
5.包含权利要求4的分离的核酸分子和调节序列的重组载体。
6.用权利要求4的核酸分子转化的重组细胞。
7.权利要求6的重组细胞，其是产青霉素G细胞。
8.权利要求7的重组细胞，其是产黄青霉菌细胞。
9.产生突变的青霉素扩环酶的方法，所述方法包括表达权利要求4的核酸分子，以及回收突变的青霉素扩环酶的步骤。
10.产生突变的青霉素扩环酶的方法，所述方法包括培养权利要求6的重组细胞以表达突变的青霉素扩环酶，以及从细胞培养物回收突变的青霉素扩环酶的步骤。
11.制备7-氨基去乙酸基头孢菌素酸(7-ADCA)的方法，所述方法包括用权利要求1的突变的青霉素扩环酶处理青霉素G以制备苯乙酰-7-ADCA，以及将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA的步骤。
12.制备7-ADCA的方法，所述方法包括以下步骤(a)在适于产生青霉素G和表达突变的青霉素扩环酶的条件下，培养用权利要求4的核酸分子转化的产青霉素G细胞，以使青霉素G被突变的扩环酶扩环，并制备苯乙酰-7-ADCA；(b)将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。
13.权利要求12的方法，其中产青霉素G细胞是产黄青霉菌细胞。
14.权利要求12的方法，其中通过过滤和萃取步骤回收步骤(a)制备的苯乙酰-7-ADCA。
全文摘要
本发明提供对青霉素G具有更高活性的突变的扩环酶(expandase)，用于制备苯乙酰－7－氨基去乙酸基头孢菌素酸(phenylacetyl－7－aminodeacetoxy cephalosporani cacid，7－ADCA)，该突变的扩环酶具有一个或多个选自M73T、S79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L和I305M的氨基酸置换。
文档编号C12N15/52GK1448506SQ02108779
公开日2003年10月15日 申请日期2002年4月1日 优先权日2002年4月1日
发明者杨运博, 魏佳俐, 蔡英杰, 许志行 申请人:骏翰生化股份有限公司