通过大肠杆菌属细菌生产l－氨基酸的方法

专利名称：通过大肠杆菌属细菌生产l－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体地涉及通过发酵生产L-氨基酸的方法且更具体的涉及获自大肠杆菌的基因。这些基因对于提高L-氨基酸生产能力是有用的，例如L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-精氨酸。
已经公开了很多提高L-氨基酸生产能力的技术，例如通过重组DNA转化微生物(参见例如US4,278,765)。这些技术的基础是提高在氨基酸生物合成中的酶活性和/或使被L-氨基酸产物反馈抑制的酶脱敏(参见例如，日本专利申请No56-18596(1981)，WO95/16042或美国专利No.5,661,012和6,040,160)。
在另一方面，提高的氨基酸分泌可以增强L-氨基酸生产菌株的生产能力，拥有增强表达L-赖氨酸分泌基因(lysE基因)的大肠杆菌属细菌菌株已被公开(WO 9723597A2)。另外，编码适合于L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸或四氢噻唑衍生物的分泌蛋白的编码基因也已经公开(美国专利No.5,972,663)。
现在，一些编码能提高L-氨基酸生产的推定的膜蛋白的大肠杆菌基因被公开。rhtB基因的额外的拷贝使细菌具有优选的对L-高丝氨酸的抗性并提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生产(欧洲专利申请EP994190A2)。此外，rhtC基因的额外的拷贝使细菌具有优选的对L-高丝氨酸和L-苏氨酸的抗性并提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸和L-亮氨酸的生产(欧洲专利申请EP1013765A1)。此外，yahN，yeaS，yfiK和yggA基因的额外的拷贝提高L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生产(欧洲专利申请EP1016710A2)。尽管，大肠杆菌K-12菌株的全长基因组序列已经描述(Blattner F.R.，Plunkett G.，Bloch C.A.et al.，Science，227，1453-1474，1997；ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.gz)，但其中的很多ORFs，它们的功能尚不清楚。
此目的是通过识别编码蛋白质的基因而达到的，这些基因并不参预目标L-氨基酸的生物合成途径中但能提高其产量。一个例子是这种蛋白质是一种具有L-氨基酸分泌活性的膜蛋白。在大肠杆菌全长基因组序列分析的基础上，拥有4或更多个推定的跨膜片段(TMS)的蛋白质被选择。努力筛选的结果，本发明人从中识别了几个基因，它们是b2682，b2683，b1242和b3434，并进行了全面的研究。基因b2682和b2683已被认为是被推定的CDS，它可以编码功能未知的蛋白质(分别为GENE BANK登记号AE000353 U00096序列的核苷酸数92到829和819到1154)。基因b2683也认为是ygaH。基因b1242已被认为是推定的CDS，它可以编码功能未知的蛋白质(GENE BANK登记号AE000222U00096序列的核苷酸数8432到9079)。基因b1242也认为是ychE。基因b3434已被认为是推定的CDS，它可以编码功能未知的蛋白质(GENE BANK登记号AE000420 U00096序列的核苷酸数1463到2056)。基因b3434也认为是yhgN。
本发明人还发现通过提高b2682，b2683，b1242或b3434基因编码的蛋白质的活性，菌株的L-氨基酸生产能力也被提高，因此，本发明已经完成。
本发明如下1)一种L-氨基酸生产细菌，该细菌属于大肠杆菌属(Escherichia)，该细菌经过修饰以致于该细菌的L-氨基酸生产可以通过提高以下A)或B)，和C)或D)定义的蛋白质在细菌细胞中的活性来提高A)一种包含序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白质；B)一种包含在序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性；C)一种包含序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白质；D)一种包含在序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性；。
(在下文中，如上述A)或B)和C)或D)定义的蛋白质被称为“本发明第一实施方案的的蛋白质”，能提高上述蛋白质活性的大肠杆菌属细菌被称为“本发明第一实施方案的细菌”)2)根据上述的细菌，A)或B)和C)或D)定义的蛋白质的活性可以通过将编码A)或B)和C)或D)定义的蛋白质的基因转化进细菌，或通过改变细菌染色体DNA上的表达调控序列而提高。
3)根据上述的细菌，其中的转化是使用多拷贝载体进行的。
4)一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养上述细菌并从培养基中收集产生并积累的L-氨基酸。
5)根据上述方法，所述的L-氨基酸是L-苏氨酸。
6)根据上述方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高苏氨酸操纵子的表达。
7)根据上述方法，所述的L-氨基酸是L-缬氨酸。
8)根据上述方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高ilv操纵子的表达。
9)根据上述方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。
10)根据上述方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高脯氨酸生物合成基因的表达。
11)根据上述方法，所述的L-氨基酸是L-亮氨酸。
12)根据上述方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高leu操纵子的表达。
13)根据上述方法，所述的L-氨基酸是L-甲硫氨酸。
14)根据上述方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高met操纵子的表达。
15)一种L-氨基酸生产细菌，该细菌属于大肠杆菌属，该细菌经过修饰以致于该细菌的L-氨基酸生产可以通过提高以下E)或F)定义的蛋白质在细菌细胞中的活性来提高E)一种包含序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白质；
F)一种包含在序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性；(在下文中，如上述E)或F)定义的蛋白质有时被称做“本发明第二实施方案的蛋白质”，能提高上述蛋白质活性的大肠杆菌属细菌是指“本发明第二实施方案的细菌”)16)根据上述的细菌，E)或F)定义的蛋白质的活性可以通过将编码E)或F)定义的蛋白质的基因转化进细菌，或通过改变细菌染色体DNA上的表达调控序列而提高。
17)根据上述的细菌，转化是使用多拷贝载体进行的。
18)一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养上述细菌并从培养基中收集产生并积累的L-氨基酸。
19)根据上述方法，所述的L-氨基酸是L-苏氨酸。
20)根据上述方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高苏氨酸操纵子的表达。
21)根据上述方法，所述的L-氨基酸是L-缬氨酸。
22)根据上述方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高ilv操纵子的表达。
23)一种L-氨基酸生产细菌，该细菌属于大肠杆菌属，该细菌经过修饰以致于该细菌的L-氨基酸生产可以通过提高以下G)或H)定义的蛋白质在细菌细胞中的活性来提高G)一种包含序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列的蛋白质；H)一种包含在序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性，例如；DL-O-甲基丝氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-β-羟基-正缬氨酸，对S-(2-氨乙基)半胱氨酸敏感性增加；(在下文中，如上述G)或H)定义的蛋白质有时被称做“本发明第三实施方案的蛋白质”，能提高E)或F)蛋白质活性的大肠杆菌属细菌是指“本发明第三实施方案的细菌”)
24)根据上述的细菌，G)或H)定义的蛋白质的活性可以通过将编码(G)或(H)定义的蛋白质的基因转化进细菌，或通过改变细菌染色体DNA上的表达调控序列来提高。
25)根据上述的细菌，其中的转化是使用多拷贝载体进行的。
26)一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养上述细菌并从培养基中收集产生并积累的L-氨基酸。
27)根据上述方法，所述的L-氨基酸是L-精氨酸。
28)根据上述方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以增强精氨酸调节子的表达。
29)根据上述方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。
30)根据上述方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以增强脯氨酸生物合成基因的表达。
生产L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本发明提高了的蛋白质活性的L-苏氨酸生产细菌生产L-苏氨酸。一种生产L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本发明提高的蛋白质活性的L-缬氨酸生产细菌生产L-缬氨酸。此外，生产L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本发明提高的蛋白质活性的L-脯氨酸生产细菌来生产L-脯氨酸。此外，生产L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本发明提高的蛋白质活性的L-亮氨酸生产细菌生产L-亮氨酸。生产L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本发明提高的蛋白质活性的L-甲硫氨酸生产细菌生产L-甲硫氨酸。
进一步的，生产L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的本发明提高的蛋白质活性的L-苏氨酸生产细菌生产L-苏氨酸。一种生产L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的本发明提高的蛋白质活性的L-缬氨酸生产细菌生产L-缬氨酸。
更进一步的，生产L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO15所示氨基酸序列的本发明提高的蛋白质活性的L-精氨酸生产细菌生产L-精氨酸。此外，生产L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO15所示氨基酸序列的本发明提高的蛋白质活性的L-脯氨酸生产细菌生产L-脯氨酸。
下面将详细解释本发明本发明的细菌是一种L-氨基酸生产细菌，该细菌属于大肠杆菌属，该细菌经过修饰以致于该细菌的L-氨基酸生产可以通过提高本发明的蛋白质在细菌细胞中的活性来提高。
来本发明中“L-氨基酸生产细菌”是指细菌在培养基上培养时有能力在培养基中积累L-氨基酸的细菌，这种L-氨基酸生产能力可以是细菌的野生菌株具有的特性也可以是通过培育而获得或提高的。
本发明的细菌是一种L-氨基酸生产细菌，该细菌属于大肠杆菌属，该细菌具有提高的蛋白质活性，它可以提高目标L-氨基酸的生产能力，具体的，本发明的细菌是一种L-氨基酸生产细菌，该细菌属于大肠杆菌属，该细菌具有提高的至少一种或两种的蛋白质活性。
术语“提高的蛋白质活性”，是指每个细胞的活性要高于未经修饰的菌株，例如，一种野生型大肠杆菌属细菌。例如，将提到一个每个细胞的蛋白质分子数增加的例子，每个蛋白质分子特定活性增加的一个例子等等。进一步，一种野生型大肠杆菌属细菌被用做对照，例如，野生型大肠杆菌菌株将被提到。
具体的，本发明第一实施方案的细菌载有在细菌的染色体DNA或质粒上至少有b2682和b2683两个基因优选二者超表达的DNA，且具有增强的生产L-氨基酸的能力，例如，L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸和L-甲硫氨酸。本发明的第二实施方案的细菌在细菌的染色体DNA或质粒上载有DNA，该DNA上有b1242基因过量表达，并提高生产L-氨基酸的能力，例如，L-苏氨酸和/或L-缬氨酸。本发明的第三实施方案的细菌停泊在细菌的染色体DNA或质粒上超表达b3434基因的DNA，并具有增强的生产L-氨基酸的能力，例如，L-精氨酸和/或L-脯氨酸。
本发明第一实施方案的蛋白质包括以下A)或B)和C)或D)定义的蛋白质中的任一个A)一种包含序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白质；B)一种包含在序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性；
C)一种包含序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白质；D)一种包含在序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性；。
“几个”氨基酸的数目根据位点或蛋白质三级结构中氨基酸残基的类型而不同。分别来讲，对蛋白质(A)来讲是可以是2-24，优选是2-12，更优选是2-5，对蛋白质(C)来讲是可以2-11，优选是2-7，更优选为2-5。
本发明第二实施方案的蛋白质包括以下E)或F)定义的蛋白质中的任一个E)一种包含序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白质；F)一种包含在序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性；“几个”氨基酸的数目根据位点或蛋白质三级结构中氨基酸残基的类型而不同。对蛋白质(E)来讲是可以是2-22，优选是2-11，更优选是2-5。
本发明第三实施方案的蛋白质包括以下G)或H)定义的蛋白质中的任一个G)一种包含序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列的蛋白质；H)一种包含在序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性，例如；DL-o-甲基丝氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-b-羟基-去甲缬氨酸，对S-(2-氨乙基)半胱氨酸敏感性增加；“几个”氨基酸的数目根据位点或蛋白质三级结构中氨基酸残基的类型而不同。对蛋白质(G)来讲是可以是2-20，优选是2-10，更优选是2-5。
增加的对L-氨基酸和/或其类似物的抗性意味着具有在未修饰的菌株，或野生菌株，或本细菌的亲本菌株不能生长的，含有L-氨基酸和/或其类似物最低浓度的培养基上生长的能力。或者意味着有比未修饰的菌株，或野生菌株，或本细菌的亲本菌株在含有L-氨基酸和/或其类似物的培养基上生长更快的能力。
更具体的，大肠杆菌菌株在37℃含有合适条件的L-氨基酸和/或其类似物琼脂培养基上培养，如果大肠杆菌菌株形成了一个比37℃，大肠杆菌菌株在固体Adams培养基上经过2-4天培养后形成的未修饰菌株或野生型菌株大的菌落，则可以说大肠杆菌菌株已经增加了对L-氨基酸和/或其类似物的抗性。术语“合适的条件”是指温度、pH、供气或基本营养或其它的选择。
L-氨基酸类似物通过3，4-二氢脯氨酸，DL-硫代异亮氨酸，DL-o-甲基丝氨酸，4-氮杂亮氨酸，正亮氨酸，L-o-氟代苯丙氨酸和DL-o-氟代苯丙氨酸，高丝氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-β-羟基-正缬氨酸来例证。
上面提及到L-氨基酸或它们的类似物存在的条件下，未修饰的菌株或野生型菌株不能生长时的浓度，依据使用的化合物的结构不同进行变化是值得注意的(从DL-硫代异亮氨酸的0.5μg/ml到DL-o-甲基丝氨酸的9600μg/ml)。例如，假设是3，4-二氢脯氨酸，一般浓度是7-70μg/ml，优选是20-25μg/ml；假设是DL-硫代异亮氨酸，一般浓度是0.5-5μg/ml，优选是0.9-1.1μg/ml；假设是DL-o-甲基丝氨酸，一般浓度是1100-9600μg/ml，优选是3000-3500μg/ml；假设是4-氮杂亮氨酸，一般浓度是15-150μg/ml，优选是40-50μg/ml；假设是正亮氨酸，一般浓度是150-1500μg/ml，优选是450-550μg/ml；假设是L-o-氟代苯丙氨酸，一般浓度是0.6-6μg/ml，优选是1.5-2μg/ml；假设是DL-o-氟代苯丙氨酸，一般浓度是2-20μg/ml，优选是5-7μg/ml；假设是高丝氨酸，一般浓度是330-3300μg/ml，优选是900-1100μg/ml；假设是6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸，一般浓度是5-50μg/ml，优选是12-18μg/ml；假设是DL-β-羟基-正缬氨酸，一般浓度是25-250μg/ml，优选是70-90μg/ml。
对L-氨基酸或它们的类似物敏感意味着细菌有比它的未经修饰菌株或野生菌株在含有最低浓度的L-氨基酸或它们的类似物的培养基上拥有更长增殖期的能力。或者是，对L-氨基酸或它们的类似物敏感意味着细菌在它的未经修饰菌株或野生菌株能生长的，含有最低浓度的L-氨基酸或它们的类似物的培养基上不能生长。这种L-氨基酸类似物是通过S-(2-氨乙基)半胱氨酸来例证的。上面提及的浓度假设是对于S-(2-氨乙基)半胱氨酸，一般浓度是0.2-2.0μg/ml，优选是0.5-1.0μg/ml。
本发明的细菌也包括通过将编码A)或B)，和C)或D)，或E)或F)，或G)或H)蛋白的DNA转入细菌或通过改变细菌染色体DNA上的表达调控序列而将本发明所述的蛋白质的活性提高的菌株。所述的在本发明中对细菌进行修饰的DNA编码推定的膜蛋白质。进一步，该DNA编码具有4个或更多个跨膜节段的蛋白质。这样的DNA可以编码具有L-氨基酸分泌活性的蛋白质。更进一步，该DNA通过b2683，b2683，b1242和b3434基因表示。必须要注意的是b2682基因的编码区728-738和b2683基因的编码区1-11是部分重叠的。这两个基因可以通过例如使用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2公开的核苷酸作为引物进行PCR而获得，为一个PCR产物。基因b1242可以通过例如使用SEQ ID NO9和SEQ ID NO10公开的核苷酸作为引物进行PCR而获得。基因b3434可以通过例如使用SEQ ID NO13和SEQ ID NO14公开的核苷酸作为引物进行PCR而获得。
对大肠杆菌全基因组序列分析可以筛选出编码具有4个或更多个推定的TMS蛋白质的基因。已知功能的蛋白质和转运蛋白在Paulsen I.T.，Sliwinski M.I.，Saier M.H.的文章中描述(J.Mol.Biol.，1998，227，537)Linton K.J和HigginsC.F.(Molecular Microbiology，1998，28(1)，5)也对它进行了排除筛选，在其余的基因筛选的结果中，几个编码推定膜输出蛋白的基因关闭了。发现b2682和b2682基因超表达，或b1242或b3434基因超表达提高了L-氨基酸生产菌的L-氨基酸生成。
本发明的DNA包括编码在蛋白质A)或C)的序列上的一个或更多个位置上的缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，只要它们没有失去蛋白质的活性。“几个”氨基酸的数目根据位点或蛋白质三级结构中氨基酸残基的类型而不同。分别来讲，对蛋白质(A)来讲是可以是2-24，优选的是2-12，更优选是2-5，对蛋白质(C)来讲是可以2-11，优选的是2-7，更优选是2-5。
进一步，本发明的DNA包括编码在蛋白质A)的序列上的一个或更多个位置上的缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，只要它们没有失去蛋白质的活性。“几个”氨基酸的数目根据位点或蛋白质三级结构中氨基酸残基的类型而不同。对蛋白质(E)来讲是可以是2-22，优选的是2-11，更优选是2-5。更进一步，本发明的DNA包括编码在蛋白质E)的序列上的一个或更多个位置上的缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，只要它们没有失去蛋白质的活性。“几个”氨基酸的数目根据位点或蛋白质三级结构中氨基酸残基的类型而不同。对蛋白质(G)来讲是可以是2-20，优选的是2-10，更优选是2-5。
编码与A)，C)，E)或G)定义的蛋白质在实质上相同的蛋白质的DNA可以通过例如对编码A)，C)，E)或G)定义的蛋白质核苷酸序列进行定向位点诱变而获得，所以一个或更多氨基酸残基会被缺失、置换、插入、增加。这种修饰的DNA可以通过常规的试剂处理和条件生成突变的方法获得。这种处理包括使用羟胺处理编码本发明蛋白质的DNA或用紫外线辐射或例如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸处理细菌含的DNA。
本发明的DNA包括在不同菌株中和在大肠杆菌属细菌天然多样的菌株中分离的突变体。编码这些突变体的DNA可以通过分离DNA而获得，它们可以与基因b2862，b2863，b1242或b3434杂交，或在严谨条件下部分杂交，并且它们编码的蛋白质可以提高L-氨基酸的生产，术语“严谨条件”是指可以形成所谓的特异的杂交时，而非特异的杂交没有形成时的条件。例如，严谨条件包括DNA有高度同源性时的杂交条件，例如DNAs相互之间拥有70％同源性时。或者，严谨条件可以通过构成Southern杂交清洗时的普通条件来例证，例如，60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选的是0.1×SSC，0.1％SDS。使用编码突变体的，并能与基因b2862，b2863，b1242或b3434杂交的DNA作为探针，含有部分SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列的DNA也可以作为探针。这样的探针可以通过使用基于SEQ ID NO3、5、11、15而生产的寡聚核苷酸作为引物，使用含有SEQ ID NO3、5、11、15的核苷酸的DNA片段作为模板进行PCR而制备。当长度约为300bp的DNA片段被用做探针时，杂交的冲洗条件为，例如，50℃，2×SSC和0.1％SDS。
用编码蛋白质的DNA转化细菌意味着将DNA传入细菌细胞，例如通过传统的方法来提高本发明的蛋白质的表达并提高细菌细胞中该蛋白质的活性。
提高基因表达的技术包括增加基因拷贝数。在大肠杆菌属细菌中传入一个含有基因的载体能起到增加该基因拷贝数的功能。为此目的，最好使用多拷贝载体。多拷贝载体是通过pBr322，pMW119，pUC19，pET22b或其它相似的载体来例证的。
此外，也可以通过例如同源重组或相似方法来在细菌染色体上引入基因的多拷贝，而达到提高基因表达的目的。
为了提高了两个或多个基因的表达，基因可以一起位于同一个质粒上，也可以位于不同的质粒上。一个基因位于染色体上，而另一个位于质粒上也是可以的。
在另一方面，可以通过改变基因的表达调控序列而提高基因表达。改变基因的表达调控序列包括在基因原有的表达调控序列例如启动子中引入突变，而使基因表达提高(WO00/18935)，也可以将本发明的DNA置于强启动子的控制下。例如lac启动子，trp启动子，trc启动子，λ噬菌体中被认为是强启动子的PL启动子，强启动子可以与多拷贝基因联合使用。
本发明所述的细菌可以通过向本身能产生L-氨基酸的细菌中引入上述DNA而获得。也可以通过赋予已经含有DNA的细菌这种产生L-氨基酸能力而获得所述的细菌。已经被提高了本发明所述蛋白质活性的亲本菌株，L-苏氨酸产生菌株属于大肠杆菌属，例如，菌株VL2054(VKPM B-8067)，VNIIGenetika472T23(美国专利NO5,631,157)，VKPMB-3996(美国专利NO5,175,107和NO5,976,843)，KCCM-10132(WO009660A1)，KCCM-10133(WO009661A1)或类似的菌株可以使用。已经被提高了本发明所述蛋白质活性的亲本菌株，L-缬氨酸产生菌株属于大肠杆菌属，例如，菌株H-81(VKPM B-8066)，NRRLB-12287和NRRL B-12288(美国专利NO4,391,907)，VKPM B-4411(美国专利NO5,658,766)，VKPM B-7707(欧洲专利申请EP1016710A2)或类似的菌株可以使用。此外，已经被提高了本发明所述蛋白质活性的亲本菌株，L-脯氨酸产生菌株属于大肠杆菌属，例如，菌株NRRL B-12403和NRRL B-12404(GB2075056)，VKPM B-8012(俄罗斯专利申请NO2000124295)，专利DE3127361中描述的突变质粒，Bloom F.R.et al描述的突变质粒(The 15th Miamiwinter symposium，1983，p.34)或类似的菌株可以使用。已经被提高了本发明所述蛋白质活性的亲本菌株，L-亮氨酸产生菌株属于大肠杆菌属，例如，菌株H-9070(FERM BP-4704)和H-9072(FERM BP-4706)(US5744331)，VKPM B-7368和VKPM B-7388(RU2140450)，W1485atpA401/pMWdAR6，W1485lip2/pMWdAR6和AJ12631/pMWdAR6(EP0872547)或类似的菌株可以使用。已经被提高了本发明所述蛋白质活性的亲本菌株，L-甲硫氨酸产生菌株属于大肠杆菌属，例如，菌株AJ11539(NRRL B-12399)，AJ11540(NRRLB-12400)，AJ11541(NRRLB-12401)AJ11542(NRRLB-12402)(GB2075055)，或类似的菌株可以使用。
进一步，已经被提高了本发明所述蛋白质活性的亲本菌株，L-精氨酸产生菌株属于大肠杆菌属，例如，菌株AJ11531和AJ11538(JP56106598A2)，AJ11593(FERM P-5616)和AJ11594(FERM P-5617)(日本专利公开NO575693)或类似的菌株可以使用。
本发明所述的细菌可以进一步提高包括在L-氨基酸生物合成中一个或更多个基因的表达。对于L-苏氨酸产生菌株，这种基因是通过苏氨酸操纵子来例证的，它最好包含一个编码被L-苏氨酸反馈抑制的门冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶基因(日本专利公开NO.1-29559)。对于L-缬氨酸产生菌株，这种基因是通过ilv操纵子，不很好表达苏氨酸脱氨基氢酶，其弱化作用被抑制的ilvGMEDA操纵子来例证的(日本专利公开NO.8-47397)。对于L-脯氨酸产生菌株，这种基因是通过L-脯氨酸生物合成基因来例证的，它优选用被L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酸激酶基因proB表示(DE3127361)。对于L-亮氨酸产生菌株，这种基因是通过亮氨酸操纵子，也就是leu操纵子来例证的，它最好包含一个编码被L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶基因(俄罗斯专利公开99114325)。对于L-甲硫氨酸产生菌株，这种基因是通过甲硫氨酸调节子来例证的。甲硫氨酸调节子含有编码抑制氨基酸生物合成的活性减低的蛋白质的突变基因。这种基因是通过编码从大肠杆菌中得到的L-甲硫氨酸生物合成相关抑制蛋白，在抑制甲硫氨酸生物合成的活性上减低的变异型基因metJ来例证的(JP2000-157267A2)。进一步，这一基因为精氨酸调节子例证，其优选包含其L-精氨酸反馈抑制被脱敏的N-乙酰基谷氨酸合成酶基因(Rajagopal B.S.等Apple.Environ.Microbiol.1998，U.64.No.5，P1805-1811)。
本发明所述的生产L-苏氨酸的方法包括在培养基上培养本发明第一实施方案的细菌，在培养基中产生和积累L-苏氨酸，从培养基中收集L-苏氨酸的步骤。本发明所述的生产L-缬氨酸的方法包括在培养基上培养本发明所述的细菌，在培养基中产生和积累L-缬氨酸，从培养基中收集L-缬氨酸的步骤。此外，本发明所述的生产L-脯氨酸的方法包括在培养基上培养本发明所述的细菌，在培养基中产生和积累L-脯氨酸，从培养基中收集L-脯氨酸的步骤。本发明所述的生产L-亮氨酸的方法包括在培养基上培养本发明所述的细菌，在培养基中产生和积累L-亮氨酸，从培养基中收集L-亮氨酸的步骤。本发明所述的生产L-甲硫氨酸的方法包括在培养基上培养本发明所述的细菌，在培养基中产生和积累L-甲硫氨酸，从培养基中收集L-甲硫氨酸的步骤。
本发明所述的生产L-苏氨酸的方法包括在培养基上培养本发明第二实施方案的细菌，在培养基中产生和积累L-苏氨酸，从培养基中收集L-苏氨酸的步骤。本发明所述的生产L-缬氨酸的方法包括在培养基上培养本发明所述的细菌，在培养基中产生和积累L-缬氨酸，从培养基中收集L-缬氨酸的步骤。
本发明所述的生产L-精氨酸的方法包括在培养基上培养本发明第三实施方案的细菌，在培养基中产生和积累L-精氨酸，从培养基中收集L-精氨酸的步骤。本发明所述的生产L-脯氨酸的方法包括在培养基上培养本发明所述的细菌，在培养基中产生和积累L-脯氨酸，从培养基中收集L-脯氨酸的步骤。
本发明所述的在培养基及相似物中培养、分离纯化L-氨基酸，在使用微生物进行氨基酸生产时，可以使用与传统发酵方法中相同的方法进行。用来培养的培养基可以时合成培养基也可以是天然培养基，只要培养基包括碳源、氮源和矿物质，如果必要，还可以包括微生物生长需要的合适数目的营养物质。碳源可以包括各种碳水化合物，例如葡萄糖和蔗糖，和各种有机酸。取决于所用微生物的同化方式，包括乙醇和甘油的醇也可以使用。至于氮源，各种胺盐，例如氨和硫酸胺，包括例如胺的其他氮，天然氮源例如蛋白胨，大豆水解物和微生物发酵的消化物都可以使用。
培养最好在例如振荡培养，有氧搅拌培养等有氧条件下进行，温度在20-40℃，最好在30-38℃。培养时的pH值一般在5-9，最好在6.5-7.2。pH值可以用氨水，碳酸钙，各种酸，各种碱和缓冲液进行调节。通常，在液体培养基中培养1-5天导致目的氨基酸在培养基中积累。
在培养后，可以通过离心或膜过滤的方法将培养基中的固体出去，例如细胞。然后可以通过离子交换，浓缩和结晶的方法收集和纯化目的氨基酸。
附图的简要说明

图1显示了质粒pΔlacZ的结构本发明最佳实施方式下面将通过实施例更具体的解释本发明，在下例中如未说明，氨基酸是L-构型。
实施例1将b2682，b2683，b1242和b3434基因克隆至pΔlacZ上为了克隆b2682，b2683，b1242和b3434基因使用了pΔlacZ质粒。质粒pΔlacZ衍生自质粒pET-22b(+)(Novagen，Madison。WI，USA)。用酶BglII和Xba I处理pET-22b(+)质粒，将其与质粒pMB9-lac(Fuller F.，Gene，19，43-54，1982)用相同内切酶处理带有PlacUV5启动子的PCR产物的片段连接。对于扩增PlacUV5启动子片段可以使用SEQ ID NO7和SEQ ID NO8描述的PCR引物。通过克隆质粒pJEL250的Sal I-BamH I的片段(DymakovaE.et al.，Gene，19，43-54，1982)，最后的质粒增加了lacZ基因的部分结构(237bp，没有启动子)。获得的质粒pΔlacZ的图谱在附图1中表示。
克隆大肠杆菌b2682和b2683推定阅读框(b2682和b2683基因)的起始物质是PCR片段，该片段是通过使用大肠杆菌菌株TG1的DNA作为模板而得到的，扩增片段用到的两个引物在SEQ ID NO1和2中已经描述。PCR反应在PE-2400上，以40sec.95℃，40sec.47℃40sec.72℃，30循环的条件下进行。如此，1158bp的包含了b2682和b2683基因的线形DNA片段就获得了。将该片段用Xba I和BamH I内切酶处理并插入到已经用相同的酶处理了的多拷贝载体质粒pΔlacZ上。
得到的含有PCR片段的质粒被称为pYGAZH，携带的b2682和b2683两个基因处于乳糖启动子(PlacUV5)的控制下。
类似的，克隆大肠杆菌b1242推定阅读框(b1242基因)的起始物质是PCR片段，该片段是通过使用大肠杆菌菌株TG1的DNA作为模板而得到的，扩增片段用到的两个引物在SEQ ID NO9和10中已经描述。得到的含有PCR片段的质粒被称为pYCHE，携带的b1242基因处于乳糖启动子(PlacUV5)的控制下。克隆大肠杆菌b3434推定阅读框(b3434基因)的起始物质是PCR片段，该片段是通过使用大肠杆菌菌株TG1的DNA作为模板而得到的，扩增片段用到的两个引物在SEQ ID NO13和14中已经描述。得到的含有PCR片段的质粒被称为pYHGN，携带的b1242基因处于乳糖启动子(PlacUV5)的控制下。
实施例2扩增的b2862，b2683基因对大肠杆菌菌株TG1对氨基酸及其类似物抗性的影响。
大肠杆菌菌株TG1(pYGAZH)TG1(pYCHE)，TG1(pYHGN)和含有未插入片段质粒的TG1菌株(对照菌株)在附加100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养过夜。所有菌株的过夜后的培养物用附加100μg/ml氨苄青霉素和IPTG0.5mM的新鲜LB培养基稀释25倍，在37℃有氧培养2小时。对数生长期的培养物用0.9％的NaCl溶液稀释使在附加100μg/ml氨苄青霉素和IPTG0.5mM和氨基酸或其类似物的Adams固体培养基平板上大约有1000个细胞接种。在37℃培养2-4天后，记录拥有杂种质粒的TG1菌株和对照TG1菌株之间在形成菌落的数目和菌落大小上的不同。实验结果如表1。表1

No-与对照菌株没有不同R-有更多的菌落或菌落更大S-与对照菌株相比具有更少的菌落或菌落更小实施例3用含有质粒pYGAZH的菌株生产苏氨酸苏氨酸生产菌株VL2054是通过将含有处于PlacUV5启动子控制下的b2682和b2683基因的质粒pYGAZH转入而得到的。获得的菌株被命名为VL2054(pYGAZH)。菌株VL2054是菌株VKPMB-3996的衍生物，在染色体上a)目标苏氨酸操纵子位于PR启动子的控制下。
b)野生型rhtA基因c)染色体上沉默的编码转氢酶的基因(tdh基因)和Tn5(tdhTn5，Kans)上沉默的编码卡那霉素抗性基因(kan)d)突变体ilvA442菌株VL2054已经于2001年1月30日在俄罗斯国家工业微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia 113545，Moscow，1 Dorozhny proezd，1)，保藏号为VKPMB-8067，并于2002年根据布达佩斯条约由最初的保藏转为国际保藏。
将作为对照的含有未插入部分的质粒的菌株VL2054(pΔlacZ)和菌株VL2054(pYGAZH)各取5个菌落，在20-ml的试管中悬浮于2ml最小培养基上((NH4)2SO4-11g/l；NaCl-0.4g/l；MgSO4-0.4g/l；K2HPO3-1g/l；FeSO4-10mg/l；MnSO4-10mg/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-40g/l；如果必要的话氨苄青霉素-300mg/l)，在32℃通风条件下培养过夜。每个培养物的0.2ml菌液转移到三个20ml的试管中，加入2ml加或不加IPTG的新鲜发酵培养基，在32℃转动振荡培养48或72小时。
发酵培养基成分(NH4)2SO4-22g/l；NaCl-0.8g/l；MgSO4-0.8g/l；K2HPO3-2g/l；FeSO4-20mg/l；MnSO4-20mg/l；硫胺-0.2mg/l；
酵母提取物-1g/l；CaCO3-30g/l；蔗糖-80g/l；氨苄青霉素-300mg/l，如果必要的话；IPTG-0.5mM，如果必要的话；在培养后，通过传统的方法测得菌液在540nm处光吸收值确定质粒的稳定。可以通过薄层色谱法测定培养基中苏氨酸的积累量。薄层色谱法的液相如下异丙醇-50ml，丙酮-50ml，NH4OH(30％)-12ml，水-8ml。结果见表2。正如看见的，杂合质粒pYGAZH提高了苏氨酸产生菌株VL2054的苏氨酸积累量。
表2

实施例4用含有质粒pYGAZH的菌株生产缬氨酸缬氨酸生产菌株H-81是通过将含有处于PlacUV5启动子控制下的b2682和b2683基因的质粒pYGAZH转入而得到的。获得的菌株已经于2001年1月30日在俄罗斯国家工业微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia 113545，Moscow，1Dorozhny proezd，1)，保藏号为VKPM B-8066，并于2002年根据布达佩斯条约由最初的保藏转为国际保藏。
将作为对照的含有未插入部分的质粒的菌株H-81(pΔlacZ)和菌株H-81(pYGAZH)各取5个菌落，在20-ml的试管中悬浮于2ml最小培养基上((NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-60g/l；如果必要的话氨苄青霉素-300mg/l)，在通风条件下培养过夜。每个培养物的0.2ml菌液转移到三个20ml的试管中，加入2ml加或不加IPTG的新鲜发酵培养基，在32℃转动振荡培养48或72小时。
发酵培养基成分(NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；CaCO3-20g/l；硫胺-0.1mg/l；蔗糖-60g/l；氨苄青霉素-300mg/l，如果必要的话；IPTG-0.5mM，如果必要的话；在培养后，通过传统的方法测得菌液在540nm处光吸收值确定质粒的稳定。可以通过薄层色谱法测定培养基中缬氨酸的积累量。薄层色谱法的液相如下异丙醇-80ml，乙酸乙酯-80ml，NH4OH(30％)-15ml，水-45ml。结果见表3。正如看见的，杂合质粒pYGAZH提高了缬氨酸产生菌株H-81的缬氨酸积累量。
表3

参考实施1通过ilvA缺陷型L-脯氨酸菌株生产L-脯氨酸野生型大肠杆菌K12菌株(VKPM B-7)细胞，在37℃经过诱变剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(0.1mg/ml)处理后20分钟，清洗后涂布在附加1.25mg/ml蛋白胨，10mg/mlL-脯氨酸，0.05mg/l 2，3，5-氯化三苯基四唑的低琼脂M9培养基上。在37℃经过3天培养后大多数生长出的菌落是红色。少数不能氧化L-脯氨酸的菌落为白色。其中的一个菌落被用亲本来获得对(3，4-二氢脯氨酸和氮杂环丁烷-2-羧化物)有抗性的突变体，氨基酸类似物被以2mg/ml的浓度加入到M9琼脂培养基中。
生成的突变体中的一些菌株能生产L-脯氨酸。最好的L-脯氨酸产生菌株702是用在ilvA基因被插入的氯霉素(Cm)抗性基因(Cmr)打断的菌株TG1上生长的噬菌体P1处理的。获得的Cm抗性转导体，702ilvA，变成了L-异亮氨酸缺陷型，比L-异亮氨酸营养型的亲本702具有更高的L-脯氨酸生产能力(见表4)。发酵培养基成分包括60g/l 蔗糖，25g/l 硫酸胺，2g/lK2HPO4，1g/lMgSO4，0.1mg/l硫胺，50mg/L1-异亮氨酸和25g/l白垩(pH7.2)，蔗糖和白垩单独灭菌。在试管内放入2ml培养基，接种一环被测试的微生物，在37℃振荡培养2天。
表4

菌株702和菌株702ilvA已经分别于2000年6月25日在俄罗斯国家工业微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia 113545，Moscow，1 Dorozhny proezd，l)，保藏号为VKPM B-8011和VKPM B-8012。
实施例5用含有质粒pYGAZH的菌株生产脯氨酸脯氨酸生产菌株702ilvA是通过将含有处于PlacUV5启动子控制下的b2682和b2683基因的质粒pYGAZH转入而得到的。
将菌株702ilvA，作为对照的含有未插入部分的质粒的菌株702ilvA(pΔlacZ)和菌株702ilvA(pYGAZH)各取5个菌落，在20-ml的试管中悬浮于2ml最小培养基上((NH4)2SO4-18g/l；K2HPO3-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-60g/l；异亮氨酸-50mg/l；如果必要的话氨苄青霉素-300mg/l)，在32℃通风条件下培养过夜。每个培养物的0.2ml菌液转移到三个20ml的试管中，加入2ml加或不加IPTG的新鲜发酵培养基，在32℃转动振荡培养40小时。
发酵培养基成分(NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；CaCO3-20mg/l；硫胺-0.1mg/l；蔗糖-60g/l；异亮氨酸-50mg/l；氨苄青霉素-300mg/l，如果必要的话；IPTG-0.5mM，如果必要的话；在培养后，通过传统的方法测得菌液在540nm处光吸收值确定质粒的稳定。可以通过薄层色谱法测定培养基中脯氨酸的积累量。薄层色谱法的液相如下异丙醇-80ml，NH4OH(30％)-5ml，水-25ml。结果见表5。正如看见的，杂合质粒pYGAZH提高了脯氨酸产生菌株702ilvA的脯氨酸积累量。
表5

参考实施2通过ilvE缺陷型L-亮氨酸菌株生产L-亮氨酸野生型大肠杆菌K12菌株(VKPM B-7)细胞，在37℃经过诱变剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(0.05mg/ml)处理后20分钟，用生理溶液清洗4次后后涂布在附加4.0 DL-氮杂亮氨酸的低琼脂M9培养基上。在37℃经过5天培养后，挑出生长出的菌落在L-琼脂平板上划线纯化。获得的能抵抗DL-氮杂亮氨酸的突变体中的一个菌落被用来诱导L-异亮氨酸和L-缬氨酸的双营养缺陷型。获得的菌株大多数需要L-异亮氨酸和L-缬氨酸才能生长，这表明，双营养缺陷型菌株是依赖与ilvE基因的突变才形成的。在获得的双营养缺陷型菌株中，选出了最好L-亮氨酸生产菌株505，产量为1.8g/Ll-亮氨酸。发酵培养基成分包括60g/l蔗糖，25g/l硫酸胺，2g/lK2HPO4，1g/lMgSO4，0.1mg/l硫胺，100mg/Ll-异亮氨酸，100mg/Ll-缬氨酸和25g/l白垩(pH7.2)，蔗糖和白垩单独灭菌。在试管内放入2ml培养基，接种一环被测试的微生物，在37℃振荡培养2天。
大肠杆菌菌株505已经分别于2001年5月14日在俄罗斯国家工业微生物收集中心(VKPM)保藏，(Russia 113545，Moscow，1 Dorozhny proezd，1)，保藏号为VKPM B-8011和VKPM B-8124，并于2002年根据布达佩斯条约由最初的保藏转为国际保藏。
实施例6用含有质粒pYGAZH的菌株生产亮氨酸亮氨酸生产菌株大肠杆菌505是通过将含有处于PlacUV5启动子控制下的b2682和b2683基因的质粒pYGAZH转入而得到的。
将菌株505，作为对照的含有未插入部分的质粒的菌株505(pΔlacZ)和菌株505(pYGAZH)各取20个菌落接种一环于加有附加或未附加氨苄青霉素的L-肉汤培养的20-ml的试管中，在32℃通风条件下培养过夜。每个培养物的0.1ml菌液转移到三个20ml的试管中(内径22mm)，加入2ml加或不加IPTG的新鲜发酵培养基，在32℃转动振荡培养72小时。发酵培养基成分(NH4)2SO4-15g/l；K2HPO4-1.5g/l；MgSO4X7H2O-1.0g/l；CaCO3-20g/l；(单独灭菌)硫胺-0.1mg/l；蔗糖-60g/l；(单独灭菌)异亮氨酸-0.3g/l；缬氨酸-0.3g/l；
氨苄青霉素-150mg/l，如果必要的话；IPTG-0.5mM，如果必要的话；在培养后，通过传统的方法测得菌液在540nm处光吸收值确定质粒的稳定。可以通过薄层色谱法测定培养基中亮氨酸的积累量。薄层色谱法的液相如下异丙醇-80ml，乙酸乙酯-80ml，NH4OH(30％)-25ml，水-50ml。结果见表6。正如看见的，杂合质粒pYGAZH提高了亮氨酸产生菌株505的亮氨酸积累量。
表6

参考实施3通过对正亮氨酸有抗性的L-甲硫氨酸菌株生产L-甲硫氨酸无质粒的苏氨酸和亮氨酸缺陷性菌株大肠杆菌C600被作为亲本菌株，首先，大肠杆菌C600菌株的亮氨酸突变体可以通过将在大肠杆菌K12菌株上生长的P1噬菌体的转导得到，在37℃经过诱变剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍处理后，得到了可以抵抗8g/lL-高丝氨酸的突变体菌株44。突变体菌株44是L-苏氨酸缺陷型，突变体菌株44已经在俄罗斯国家工业微生物收集中心(VKPM)保藏，保藏号为VKPM B-2175。
从菌株44中用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍诱变出的菌株对甲硫氨酸类似物，正亮氨酸具有抗性。L-肉汤培养基的过夜培养物中的细胞被离心下来，用含有50μg/mlN-甲基N-硝基-N-亚硝基胍的生理溶液(0.9％NaCl)重新悬浮，细胞在37℃，N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍中暴露30分钟后离心，用生理溶液清洗4次后后涂布在附加0.5mg/ml苏氨酸和2.5mg/ml或5mg/ml正亮氨酸的低琼脂M9培养基上。在37℃经过5天培养后，挑出生长出的菌落在L-琼脂平板上划线纯化。其中最好的L-甲硫氨酸生产菌株是菌株218。菌株218的试管培养在32℃振荡培养3天，培养基中L-甲硫氨酸达到了1g/l。作为发酵培养基的最低M9培养基包括蔗糖(4％)，硫酸胺(2.5％)，苏氨酸(0.5g/l)，CaCO3(25g/l)。蔗糖和白垩单独灭菌。
菌株218已经于2001年5月14日在俄罗斯国家工业微生物收集中心(VKPM)保藏，保藏号为VKPM B-8125，并于2002年根据布达佩斯条约由最初的保藏转为国际保藏。
进一步，通过整合来源于枯草芽孢杆菌属的pycA基因(俄罗斯专利申请99121636)将噬菌体P1介导的ppc基因缺失引入到菌株218，结果菌株218pycA失去了对正亮氨酸的抗性。所以，可以用上述方法重新给予菌株对正亮氨酸的抗性。在获得的菌株中，最好L-甲硫氨酸生产菌株大肠杆菌菌株73，在上述条件下，产量约为1.0g/lL-甲硫氨酸。
大肠杆菌菌株73已经于2001年5月14日在俄罗斯国家工业微生物收集中心(VKPM)保藏，保藏号为VKPM B-8126，并于2002年根据布达佩斯条约由最初的保藏转为国际保藏。
实施例7用含有质粒pYGAZH的菌株生产甲硫氨酸甲硫氨酸生产菌株大肠杆菌73是通过将含有处于PlacUV5启动子控制下的b2682和b2683基因的质粒pYGAZH转入而得到的。
将菌株73，作为对照的含有未插入部分的质粒的菌株73(pΔlacZ)和菌株73(pYGAZH)各取5个菌落，在20-ml的试管中悬浮于2ml最小培养基上((NH4)2SO4-18g/l；K2HPO3-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-10g/l；蔗糖-60g/l；苏氨酸-400mg/l；如果必要的话氨苄青霉素-300mg/l)，在32℃通风条件下培养过夜。每个培养物的0.2ml菌液转移到三个20ml的试管中，加入2ml加或不加IPTG的新鲜发酵培养基，在32℃转动振荡培养48小时。
发酵培养基成分(NHX)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；CaCO3-20mg/l；硫胺-0.1mg/l；
蔗糖-60g/l；苏氨酸-400mg/l；酵母提取物-10g/l；氨苄青霉素-300mg/l，如果必要的话；IPTG-0.5mM，如果必要的话；在培养后，通过传统的方法测得菌液在540nm处光吸收值确定质粒的稳定。可以通过薄层色谱法测定培养基中甲硫氨酸的积累量。薄层色谱法的液相如下异丙醇-80ml，乙酸乙酯-80ml，NH4OH(30％)-15ml，水-45ml。结果见表7。正如看见的，杂合质粒pYGAZH提高了甲硫氨酸产生菌株73的甲硫氨酸积累量。
表7

实施例8用含有质粒pYCHE的菌株生产苏氨酸苏氨酸生产菌株大肠杆菌VL2054是通过将含有处于PlacUV5启动子控制下的b1242基因的质粒pYCHE转入而得到的。得到的菌株被命名为VL2054pYCHE。
将菌株VL2054，作为对照的含有未插入部分的质粒的菌株VL2054(pΔlacZ)和菌株VL2054(pYCHE)各取5个菌落，在20-ml的试管中悬浮于2ml最小培养基上((NH4)2SO4-11g/l；NaCl-0.4g/l；MgSO4-0.4g/l；K2HPO3-1g/l；FeSO4-10mg/l；MnSO4-10mg/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-40g/l；如果必要的话氨苄青霉素-300mg/l)，在32℃通风条件下培养过夜。每个培养物的0.2ml菌液转移到三个20ml的试管中，加入2ml加或不加IPTG的新鲜发酵培养基，在32℃转动振荡培养45小时。
发酵培养基成分(NH4)2SO4-22g/l；NaCl-0.8g/l；MgSO4-0.8g/l；K2HPO3-2g/l；FeSO4-20mg/l；MnSO4-20mg/l；硫胺-0.2mg/l；酵母提取物-1g/l；CaCO3-30g/l；蔗糖-80g/l；氨苄青霉素-300mg/l，如果必要的话；IPTG-0.5mM，如果必要的话；在培养后，通过传统的方法测得菌液在540nm处光吸收值确定质粒的稳定。可以通过薄层色谱法测定培养基中苏氨酸的积累量。薄层色谱法的液相如下异丙醇-50ml，丙酮-50ml，NH4OH(30％)-12ml，水-8ml。结果见表8。正如看见的，杂合质粒pYCHE提高了苏氨酸产生菌株VL2054的苏氨酸积累量。
表8

实施例9用含有质粒pYCHE的菌株生产缬氨酸缬氨酸生产菌株H-81是通过将含有处于PlacUV5启动子控制下的b1242基因的质粒pYCHE转入而得到的。
将作为对照的含有未插入部分的质粒的菌株H-81(pΔlacZ)和菌株H-81(pYCHE)各取5个菌落，在20-ml的试管中悬浮于2ml最小培养基上((NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-60g/l；如果必要的话氨苄青霉素-300mg/l)，在通风条件下培养过夜。每个培养物的0.2ml菌液转移到三个20ml的试管中，加入2ml加或不加IPTG的新鲜发酵培养基，在32℃转动振荡培养45小时。
发酵培养基成分(NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；CaCO3-20g/l；硫胺-0.1mg/l；蔗糖-60g/l；氨苄青霉素-300mg/l，如果必要的话；IPTG-0.5mM，如果必要的话；在培养后，通过传统的方法测得菌液在540nm处光吸收值确定质粒的稳定。可以通过薄层色谱法测定培养基中缬氨酸的积累量。薄层色谱法的液相如下异丙醇-80ml，乙酸乙醇-80ml，，NH4OH(30％)-15ml，水-45ml。结果见表9。正如看见的，杂合质粒pYCHE提高了缬氨酸产生菌株H-81的缬氨酸积累量。
表9

实施例10用含有质粒pYHGN的菌株生产精氨酸精氨酸生产菌株382是通过将含有处于PlacUV5启动子控制下的b3434基因的质粒pYHGN转入而得到的。获得的菌株382已经于2000年4月10日在俄罗斯国家工业微生物收集中心(VKPM)保藏，(Russia 113545，Moscow，1Dorozhnyproezd，1)，保藏号为VKPMB-7962。
将菌株382，作为对照的含有未插入部分的质粒的菌株382(pΔlacZ)和菌株382(pYHGN)各取5个菌落，在20-ml的试管中悬浮于2ml最小培养基上((NH4)2SO4-25g/l；K2HPO4-2.0g/l；MgSO47H2O-1.0g/l；硫胺-0.2mg/l；酵母提取物-5g/l；蔗糖-60g/l；如果必要的话氨苄青霉素-300mg/l)，在通风条件下培养过夜。每个培养物的0.2ml菌液转移到三个20ml的试管中，加入2ml加或不加IPTG的新鲜发酵培养基，在32℃转动振荡培养72小时。
发酵培养基成分(NH4)2SO4-25g/l；K2HPO4-2.0g/l；MgSO47H2O-1.0g/l；硫胺-0.2mg/l；酵母提取物-5g/l；蔗糖-60g/l；CaCO3-20g/l；氨苄青霉素-100mg/l，如果必要的话；IPTG-0.5mM，如果必要的话；在培养后，通过传统的方法测得菌液在540nm处光吸收值确定质粒的稳定。可以通过薄层色谱法测定培养基中精氨酸的积累量。薄层色谱法的液相如下异丙醇-80ml，乙酸乙酯-40ml，，NH4OH(30％)-25ml，水-50ml。结果见表10。正如看见的，杂合质粒pYHGN提高了缬氨酸产生菌株382的缬氨酸积累量。
表10

实施例11用含有质粒pYHGN的菌株生产脯氨酸脯氨酸生产菌株702ilvA是通过将含有处于PlacUV5启动子控制下的b3434基因的质粒pYHGN转入而得到的。
将菌株702ilvA，作为对照的含有未插入部分的质粒的菌株702ilvA(pΔlacZ)和菌株702ilvA(pYHGN)各取5个菌落，在20-ml的试管中悬浮于2ml最小培养基上((NH4)2SO4-18g/l；K2HPO3-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-60g/l；异亮氨酸-50mg/l；如果必要的话氨苄青霉素-300mg/l)，在32℃通风条件下培养过夜。每个培养物的0.2ml菌液转移到三个20ml的试管中，加入2ml加或不加IPTG的新鲜发酵培养基，在32℃转动振荡培养40小时。
发酵培养基成分(NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；CaCO3-20mg/l；硫胺-0.1mg/l；蔗糖-60g/l；异亮氨酸-50mg/l；氨苄青霉素-300mg/l，如果必要的话；IPTG-0.5mM，如果必要的话；
在培养后，通过传统的方法测得菌液在540nm处光吸收值确定质粒的稳定。可以通过薄层色谱法测定培养基中脯氨酸的积累量。薄层色谱法的液相如下异丙醇-80ml，NH4OH(30％)-5ml，水-25ml。结果见表11。正如看见的，杂合质粒pYHGN提高了脯氨酸产生菌株702ilvA的脯氨酸积累量。
表11

序列表<110>Ajinomoto Co..Inc.<120>通过大肠杆菌属细菌生产L-氨基酸的方法<130>P-8206F<140><141>2002--<150>RU 2001103865<151>2001-02-13<150>RU 2001104998<151>2001-02-26<150>RU 2001104999<151>2001-02-26<150>RU 2001117632<151>2001-06-28<150>RU 2001117633<151>2001-06-28<160>16<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>1ggtctagaca atcgttaagc gtacac 26<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>2ccggatccga tatagtaacg acagtg 26<210>3<211>738<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<220><221>CDS<222>(1)..(735)<400>3atg gaa agc cct act cca cag cct gct cct ggt tcg gcg acc ttc atg 48Met Glu Ser Pro Thr Pro Gln Pro Ala Pro Gly Ser Ala Thr Phe Met1 5 10 15gaa gga tgc aaa gac agt tta ccg att gtt att agt tat att ccg gtg 96Glu Gly Cys Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val20 25 30gcc ttt gcg ttc ggt ctg aat gcg acc cgt ctg gga ttc tct cct ctc 144Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Ser Pro Leu35 40 45gaa agc gtt ttt ttc tcc tgc atc att tat gca ggc gcg agc cag ttc 192Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe50 55 60gtc att acc gcg atg ctg gca gcc ggg agt agt ttg tgg att gct gca 240Val Ile Thr Ala Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Ile Ala Ala65 70 75 80ctg acc gtc atg gca atg gat gtt cgc cat gtg ttg tat ggc ccg tca 288Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser85 90 95ctg cgt agc cgt att att cag cgt ctg caa aaa tcg aaa acc gcc ctg 336Leu Arg Ser Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Lys Ser Lys Thr Ala Leu100 105 110tgg gcg ttt ggc ctg acg gat gag gtt ttt gcc gcc gca acc gca aaa 384Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys115 120 125ctg gta cgc aat aat cgc cgc tgg agc gag aac tgg atg atc ggc att 432Leu Val Arg Asn Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile130 135 140gcc ttc agt tca tgg tca tcg tgg gta ttt ggt acg gta ata ggg gca 480Ala Phe Ser Ser Trp Ser Ser Trp Val Phe Gly Thr Val Ile Gly Ala145 150 155 160ttc tcc ggc agc ggc ttg ctg caa ggt tat ccc gcc gtt gaa gct gca 528Phe Ser Gly 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1.一种属于大肠杆菌属的L-氨基酸生产细菌，该细菌经过修饰以致于该细菌的L-氨基酸生产可以通过提高以下A)或B)，和C)或D)定义的蛋白质在所述细菌细胞中的活性来提高A)一种包含序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白质；B)一种包含在序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性；C)一种包含序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白质；D)一种包含在序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性；。
2.根据权利要求1的细菌，A)或B)和C)或D)定义的蛋白质的活性可以通过将编码A)或B)和C)或D)定义的蛋白质的基因转化进细菌，或通过改变细菌染色体DNA上的表达调控序列来提高。
3.根据权利要求2的细菌，其中的转化是通过多拷贝载体进行的。
4.一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养权利要求1-3的细菌并从培养基中收集产生并积累的L-氨基酸。
5.根据权利要求4的方法，所述的L-氨基酸是L-苏氨酸。
6.根据权利要求5的方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌具有苏氨酸操纵子的增强的表达。
7.根据权利要求4方法，所述的L-氨基酸是L-缬氨酸。
8.根据权利要求7方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高ilv操纵子的表达。
9.根据权利要求4方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。
10.根据权利要求9方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以增强脯氨酸生物合成基因的表达。
11.根据权利要求4方法，所述的L-氨基酸是L-亮氨酸。
12.根据权利要求11方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高leu操纵子的表达。
13.根据权利要求4方法，所述的L-氨基酸是L-甲硫氨酸。
14.根据权利要求13方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以具有met操纵子的提高的表达。
15.一种L-氨基酸生产细菌，该细菌属于大肠杆菌属，该细菌经过修饰以致于该细菌的L-氨基酸生产可以通过提高以下E)或F)定义的蛋白质在所述细菌细胞中的活性来提高E)一种包含序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白质；F)一种包含在序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性；
16.根据权利要求15的细菌，E)或F)定义的蛋白质的活性可以通过将编码E)或F)定义的蛋白质的基因转化进细菌，或通过改变细菌染色体DNA上的表达调控序列而提高。
17.根据权利要求16的细菌，其中的转化是通过多拷贝载体进行的。
18.一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养权利要求15-17的细菌并从培养基中收集产生并积累的L-氨基酸。
19.根据权利要求18方法，所述的L-氨基酸是L-苏氨酸。
20.根据权利要求19方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌具有苏氨酸操纵子的提高的表达。
21.根据权利要求18方法，所述的L-氨基酸是L-缬氨酸。
22.根据权利要求21方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌具有ilv操纵子的提高的表达。
23.一种L-氨基酸生产细菌，该细菌属于大肠杆菌属，该细菌经过修饰以致于该细菌的L-氨基酸生产可以通过以下G)或H)定义的蛋白质在细菌细胞中的活性来提高G)一种包含序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列的蛋白质；H)一种包含在序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列上缺失、置换、插入、增加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白质，它有使细菌增加对L-氨基酸和/或其类似物的抗性的活性，例如；DL-o-甲基丝氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-β-羟基-正缬氨酸，对S-(2-氨乙基)半胱氨酸敏感性增加。
24.根据权利要求23的细菌，G)或H)定义的蛋白质的活性可以通过将编码G)或H)定义的蛋白质的基因转化进细菌，或通过改变细菌染色体DNA上的表达调控序列而提高。
25.根据权利要求24的细菌，其中的转化是通过多拷贝载体进行的。
26.一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养权利要求23-25中任一细菌并从培养基中收集产生并积累的L-氨基酸。
27.根据权利要求26方法，所述的L-氨基酸是L-精氨酸。
28.根据权利要求27方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高精氨酸调节子的表达。
29.根据权利要求26的方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。
30.根据权利要求9的方法，所述的细菌已经经过修饰以至于该细菌可以提高脯氨酸生物合成基因的表达。
全文摘要
本发明提供了一种使用大肠杆菌属细菌生产L－苏氨酸,L－缬氨酸,L－脯氨酸,L－亮氨酸,L－甲硫氨酸和L－精氨酸的生产方法。所述细菌的L－氨基酸生产能力通过提高b2682和b2683基因,或b1242基因,或b3434基因编码的蛋白质的活性被提高。
文档编号C12P13/08GK1373226SQ0210808
公开日2002年10月9日 申请日期2002年2月13日 优先权日2001年2月13日
发明者E·A·塔波利纳, K·V·赖巴克, E·M·霍尔格斯, E·B·沃罗施洛瓦, M·M·古斯亚蒂纳 申请人:味之素株式会社