专利名称：含有机氮的组合物及其含有该组合物的肥料的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用作肥料原料的L-谷氨酸发酵废液和含有它的肥料。
背景技术：
主要通过利用所谓的产L-谷氨酸的棒状杆菌(coryneforrm)的发酵来生产L-谷氨酸，所述棒状杆菌属于短杆菌(Brevibacterium)、棒状杆菌(Corynebacterium)或细杆菌(Microbacterium)的属或其突变株(氨基酸发酵，Gakkai Shuppan Center，pp.195-215，1986)。作为通过使用其它菌株进行发酵来生产L-谷氨酸的方法，已知使用属于芽胞杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、青霉菌属(Penicillium)等的微生物的方法(美国专利No.3220929)，使用属于假单胞菌属(Dseudomonas)、分节孢子杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、念珠菌属(Candida)等的微生物的方法(美国专利3563857)，使用属于芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、产气气杆菌属(Aerobacter aerogenes)(目前是指产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))等的微生物的方法(日本专利公布(公告)No.32-9393)，使用大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的突变株的方法(日本专利公开(公开)No.5-244970)等等。此外，本发明者提出了通过使用属于克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Enwinia)或泛菌属(Pantoea)的微生物来生产L-谷氨酸的方法(日本专利公开No.2000-106869)。
而且，已经公开了各种通过利用DNA重组技术来增强L-谷氨酸生物合成酶的活性以改善产L-谷氨酸能力的技术。例如，有报道引入来自大肠埃希氏杆菌或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的柠檬酸合酶的基因编码对增强在棒状杆菌或短杆菌中的产L-谷氨酸的能力是有效的(日本专利公布(公告)No.7-121228)。此外，日本专利申请公开No.61-268185公开了一种带有含有来自棒状杆菌的谷氨酸脱氢酶基因的重组DNA的细胞。还有，日本专利申请公开No.63-214189公开了一种通过扩增谷氨酸脱氢酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、乌头酸水合酶基因和柠檬酸合酶基因来增加产L-谷氨酸能力的技术。
关于如上所述的生产L-谷氨酸的方法，回收L-谷氨酸后的母液已用作肥料等的原料(日本专利申请公开No.50-129363，日本专利公布No.35-16965，日本专利申请公开No.52-7872)。因此，在通过发酵生产L-谷氨酸的方法中，认为不仅提高L-谷氨酸的的生产率而且获得更适合于肥料的原料的母液是理想的。
已知这样一种方法，发酵随着积聚在培养物中的L-氨基酸的结晶而进行(日本专利申请公开No.62-288)。在该方法中，通过沉淀培养物中积聚的L-氨基酸，使培养物中L-氨基酸的浓度保持在低于某一水平。具体地说，通过调节培养物的温度和pH或往培养基中添加表面活性剂，在发酵过程中使L-色氨酸、L-酪氨酸或L-亮氨酸沉淀。
尽管如上所述的实施伴随L-氨基酸的沉淀的发酵的方法是已知的，但适合于该方法的氨基酸是那些显示出相对低的水溶解性的氨基酸，已知没有将该方法应用到高水溶性的氨基酸如L-谷氨酸中的实例。此外，培养基必需具有低的pH以沉淀L-谷氨酸。然而，产L-谷氨酸的细菌例如上述的那些在酸性条件下不能生长，因此必须在中性条件下进行L-谷氨酸的发酵(美国专利No.3220929和3032474；K.C.Chao & J.W.Foster，J.Bacteriol.，77，pp.715-725(1959))。由此，不知道通过伴随沉淀的发酵生产L-谷氨酸。而且，已知大多数嗜酸菌的生长由于有机酸如醋酸、乳酸和琥珀酸而受到抑制(YasuroOshima Ed.，“Extreme Environment Microorganism Handbook”，p.231，ScienceForum；R.M.Borichewski，J.Bacteriol.，93，pp.597-599(1967)等)。因此，许多微生物在酸性条件下易受到也是有机酸的L-谷氨酸的影响，并且也没有试图寻求在酸性条件下显示出产L-谷氨酸能力的微生物的报导。
发明内容
在如上所述的情况下，本发明的目的是提供更适合于用作肥料等的原料的发酵母液，而不降低L-谷氨酸的生产率。
本发明者发现通过在pH调节至L-谷氨酸沉淀条件下的液体培养基中培养具有产L-谷氨酸能力的微生物以生产L-谷氨酸并伴随L-谷氨酸的沉淀积聚在培养基中而获得的发酵母液含有大量有机氮并且适合于用作肥料等的原料。由此他们完成了本发明。
本发明提供以下几个方面。
(1)含有有机氮的组合物，含有通过在pH调节至使L-谷氨酸沉淀条件下的液体培养基中培养具有产L-谷氨酸能力的微生物以生产L-谷氨酸并伴随L-谷氨酸的沉淀积聚，然后从培养基分离谷氨酸而获得的发酵母液。
(2)根据(1)的含有机氮的组合物，其中微生物属于肠杆菌(Enterobacter)属。
(3)根据(2)的含有机氮的组合物，其中微生物是成团泛菌(Enterobacteragglomerans)。
(4)根据(1)至(3)之一的含有机氮组合物，其中微生物在特定的pH下，在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中代谢碳源，具有在该pH下以超过液体培养基中L-谷氨酸饱和浓度的量积聚L-谷氨酸的能力。
(5)根据(4)的含有机氮的组合物，其中特定的pH是5.0或更小。
(6)根据(4)或(5)的含有机氮的组合物，其中适合于通过微生物生产L-谷氨酸的pH是这样的pH，在该pH下，在该pH的培养基中培养的过程中，L-谷氨酸在培养基中沉淀，并产生L-谷氨酸以及伴随着L-谷氨酸的沉淀而积聚。
(7)一种肥料，包括含有如(1)至(6)之一定义的含有机氮的组合物。
根据本发明，可以通过发酵有效地生产适合于肥料等的原料的发酵母液。
图1是在pTWVEK101中来自于成团泛菌的DNA片断的限制性酶切图。
图2表示从来自于成团泛菌和来自于大肠埃希氏菌的sucA基因的核苷酸序列推测获得的氨基酸序列的对比(上栏成团泛菌，下栏大肠埃希氏菌，下面同样采用)。
图3表示从来自于成团泛菌和来自于大肠埃希氏菌的sucB基因的核苷酸序列推测获得的氨基酸序列的对比。
图4表示从来自于成团泛菌和来自于大肠埃希氏菌的sucC基因的核苷酸序列推测获得的氨基酸序列的对比。
图5表示从来自于成团泛菌和来自于大肠埃希氏菌的sdhB基因的核苷酸序列推测获得的氨基酸序列的对比。
图6表示含有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒pMWCPG的构建。
图7表示含有宽宿主范围质粒RSF1010的复制起点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet的构建。
图8表示含有宽宿主范围质粒RSF1010的复制起点、抗四环素基因、gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒RSFCPG的构建。
图9表示含有gltA基因的质粒pSTVCB的构建。
下面详细描述本发明。
有机氮是指在所有的氮中除了氨的氮以外的氮。一般来说，是指包含在构成氨基酸、肽、蛋白质、核酸等的有机材料中的氮。
可以获得作为发酵母液的本发明的含有机氮的组合物，该发酵母液是通过在pH调节至使L-谷氨酸沉淀条件下的液体培养基中培养具有产L-谷氨酸能力的微生物以生产L-谷氨酸并伴随L-谷氨酸的沉淀而积聚，然后从培养基分离谷氨酸而获得的。
用于本发明的具有产L-谷氨酸能力的微生物的实例包括属于肠杆菌属的微生物。优选成团泛菌。
而且，用于本发明的具有产L-谷氨酸能力的微生物优选是能够在特定的pH下，在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中代谢碳源，和具有在上述pH下以超过液体培养基中L-谷氨酸饱和浓度的量积聚L-谷氨酸的能力的微生物(以后也称为“积聚L-谷氨酸的微生物”)。上述特定的pH优选是L-谷氨酸在培养基中沉淀的pH，该pH通常是5.0或更小。
“饱和浓度”是指当液体培养基被L-谷氨酸饱和时溶解在液体培养基中的L-谷氨酸的浓度。
当使用积聚L-谷氨酸的微生物时，适合于生产L-谷氨酸的pH优选是L-谷氨酸在培养基中沉淀的pH。通过在此pH下进行培养，产生谷氨酸并伴随其沉淀积聚在培养基中。
积聚L-谷氨酸的微生物可如下获得。在特定的pH下，将含有微生物的样品接种进含饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中，并且选择代谢碳源的菌株。尽管对特定的pH没有特别的限制，但通常约是5.0或更小，优选约4.5或更小，更优选约4.3或更小。积聚L-谷氨酸的微生物用于生产L-谷氨酸，通过伴随L-谷氨酸沉淀的发酵进行。如果pH太高，使得微生物产生足以沉淀的L-谷氨酸变得困难。因此，pH优选在上述范围。
如果含L-谷氨酸的水溶液的pH降低，L-谷氨酸的溶解度在γ-羧基的pKa附近显著下降(4.25，25℃)。溶解度在等电点(pH3.2)变得最低，使超过相当于饱和浓度数量的L-谷氨酸沉淀。虽然取决于培养基组合物，但在约30℃下L-谷氨酸在pH3.2下以10-20g/L的量，在pH4.0下以30-40g/L的量和在pH4.7下以50-60g/L的量溶解。通常不需要使pH为3.0或更小，因为当pH低于某一值时，L-谷氨酸沉淀效果达到其最高限。然而，pH可以是3.0或更小。
此外，微生物“可以代谢碳源”的表述是指它可以增殖或尽管不能增殖也能消耗碳源，即，表明它可以使碳源分解代谢，所述的碳源例如为糖或有机酸。具体地说，例如，当在pH5.0-4.0，优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，特别优选pH4.0下，在适当的温度下，例如28℃、37℃或50℃，将其在含饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中培养2-4天时，微生物增殖，该微生物可以代谢培养基中的碳源。而且，例如，如果微生物消耗碳源，尽管微生物不增殖，则当在pH-5.0-4.0，优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，特别优选pH4.0下，在适当的温度下，例如28℃、37℃或50℃，将其在含饱和浓度的L-谷氨酸的合成液体培养基中培养2-4天时，微生物就是可以代谢培养基中碳源的微生物。
可以代谢碳源的微生物包括可以在上述液体培养基中生长的微生物。
而且，微生物“可以生长”的表述是指它可以增殖或尽管不能增殖也能生产L-谷氨酸具体地说，例如，当在pH5.0-4.0，优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，特别优选pH4.0下，在适当的温度下，例如28℃、37℃或50℃，将其在含饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中培养2-4天时，微生物增殖，该微生物可以在培养基中生长。而且，例如，如果微生物使在合成液体培养基中的L-谷氨酸的数量增加，尽管微生物不增殖，则当在pH5.0-4.0，优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，特别优选pH4.0下，在适当的温度下，例如28℃、37℃或50℃，将其在含饱和浓度的L-谷氨酸的合成液体培养基中培养2-4天时，该微生物就是可以在培养基中生长的微生物。
上述选择可以在相同的条件下或在改变pH或L-谷氨酸的浓度下重复两次或更多次。对早期阶段的选择可以在含浓度低于饱和浓度的L-谷氨酸的培养基中进行，之后在含有饱和浓度的L-谷氨酸的培养基中进行后续的选择。而且，可以选择具有所需特性如优异增殖率的菌株。
积聚L-谷氨酸的微生物是除了上述特性之外，具有以超过相当于在液体培养基中的L-谷氨酸的饱和浓度的量积聚L-谷氨酸的能力。上述液体培养基的pH优选和用于筛选具有上述特性的微生物的培养基的相同或类似。通常，pH低时，微生物易受高浓度L-谷氨酸的影响。因此，鉴于L-谷氨酸的抗性，优选pH不是很低，但由于伴随其沉淀生产L-谷氨酸，优选低pH。为了满足这些条件，pH可以在3-5的范围，优选4-5，更优选4-4.7，进一步优选4-4.5，特别优选4.0-4.3。
作为积聚L-谷氨酸的微生物或其繁殖材料可以列举，例如，属于肠杆菌属、克雷伯杆菌属、沙雷氏菌属、泛菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏杆菌属、棒杆菌属、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、芽孢杆菌属、酵母属等的微生物。其中，优选属于肠杆菌属的微生物。下面，将主要解释本发明属于肠杆菌属的微生物。然而，微生物不限于那些属于肠杆菌属的微生物，也可以类似地使用那些属于其它属的微生物。
作为属于肠杆菌属的微生物可以具体地提到成团泛菌，优选成团泛菌AJ13355菌株。该菌株从日本Shizuoka Iwata-shi的土壤中分离，作为可以在低pH下的含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株。
下面显示AJ13355的生理特性(1)革兰氏染色-(2)抗氧特性兼性厌氧(3)过氧化氢酶+(4)氧化酶-(5)硝酸还原能力-(6)Voges-Proskauer试验+(7)甲基红试验-(8)脲酶-(9)吲哚的产生+(10)游动性游动的(11)在TSI培养基中H2S的产生活性弱(12)β-半乳糖苷酶+(13)同化糖的特性阿拉伯糖+蔗糖+乳糖+木糖+山梨醇+肌醇+海藻糖+麦芽糖+葡萄糖+福寿草醇-棉子糖+水杨苷-蜜二糖+(14)甘油糖同化特性+(15)有机酸同化特性柠檬酸+酒石酸-葡糖酸+醋酸+丙二酸-(16)精氨酸脱水酶-(17)鸟氨酸脱羧酶-(18)赖氨酸脱羧酶-(19)苯丙氨酸脱氨基酶-(20)色素形成黄色(21)明胶液化能力+(22)生长pH可以在pH4下生长，在pH4.5-7生长好(23)生长温度在25℃、30℃、37℃下生长好，在42℃下可以生长，在45℃下不能生长基于这些细菌学特性，确定AJ13355为成团泛菌。
成团泛菌于1998年2月19日保藏在国际贸易和工业部，工业科学和技术局，国立生物科学和人类技术研究所(现在为国际专利生物体保藏中心，国立先进工业科学和技术研究所)，接收到的保藏号为FERM P-16644。然后在布达佩斯条约的规定下于1999年1月11日转为国际保藏，接收到的保藏号为FERM BP-6614。
积聚L-谷氨酸的微生物可以是本来具有产L-谷氨酸能力的微生物或具有通过采用诱变处理、重组DNA技术等培育而赋予或增强的产L-谷氨酸能力的微生物。
通过例如增强催化L-谷氨酸的生物合成反应的酶的活性来赋予或增强产L-谷氨酸的能力。也可以通过降低或消除催化反应的酶的活性来增强产L-谷氨酸的能力，该反应从L-谷氨酸的生物合成路径分出来并产生除了L-谷氨酸之的化合物。
作为催化生物合成L-谷氨酸的反应的酶的实例，可以举出谷氨酸脱氢酶(下面也称为“GDH”)、谷氨酸合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶(下面也称为“CS”)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(下面也称为“PEPC”)、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、烯醇化酶、磷酸甘油变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖磷酸异构酶等。在这些酶当中，优选CS、PEPC和GDH的一种、两种或三种。而且，优选所有这三种酶CS、PEPC和GDH的活性在积聚L-谷氨酸的微生物中被增强。特别地，优选谷氨酸棒杆菌的CS，因为它不会受到α-氧代戊二酸、L-谷氨酸和NADH的抑制。
为了增强CS、PEPC或GDH的活性，例如，可以将CS、PEPC或GDH的编码基因克隆在适当的质粒上，用获得的质粒转化宿主微生物。在转化的菌株细胞中的CS、PEPC或GDH的编码基因的拷贝数(下面分别缩写为“gltA基因”、“ppc基因”和“gdhA基因”)增加，导致CS、PEPC或GDH的活性的增加。
将克隆的gltA、ppc和gdhA基因单独或它们任意两种或三种的混合引入上述起始亲株中。当引入两种或三种基因时，两种或三种基因可以克隆在一种质粒上并引入宿主中，或分别在两种或三种可共存的质粒上克隆并引入宿主中。
编码同种但来自不同微生物的酶的两种或更多种基因可以引入到相同的宿主中。
对上述质粒没有特别的限制，只要它们在属于例如肠杆菌属等的微生物的细胞中自主复制。然而，可以列举的是pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pACYC177、pACYC184等。除这些之外，也可以使用噬菌体DNA的载体。
可以通过例如D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology，68，326(1979))、其中通过用氯化钙处理细胞来增加DNA的受体细菌细胞的渗透率方法(Mandel M.和Higa A，J.Mol.Biol.，53，159(1970))、电穿孔(MillerJ.H.，“A Short Course in Bacterial Genetics”，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，U.S.A.，1992)等进行转化。
也可以通过使多拷贝的gltA基因、ppc基因或gdhA基因出现于是宿主的上述起始亲株的染色体DNA上来增加CS、PEPC或GDH的活性。为了在属于肠杆菌属等的微生物的染色体DNA上引入多拷贝的gltA基因、ppc基因或gdhA基因，可以使用在染色体DNA上的多拷贝基因的序列，例如出现在转座因子的末端上的重复DNA和反向重复序列。或者，通过利用转移含有gltA基因、ppc基因或gdhA基因的转座子，将多拷贝基因引入到染色体DNA上。结果，增加了转化的菌株细胞中的gltA基因、ppc基因或gdhA基因的拷贝数，由此增加了CS、PEPC或GDH的活性。
作为用作拷贝数增加了的gltA基因、ppc基因或gdhA基因的来源的生物体，可以使用任何生物体，只要它具有CS、PEPC或GDH的活性。尤其是，优选是原核生物的细菌，例如那些属于肠杆菌属、克雷伯杆菌属、欧文氏菌属、泛菌属、沙雷氏菌属、埃希氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属或芽孢杆菌属的那些细菌。作为具体的实例，可以列举大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等。可以从上述微生物的染色体DNA获得glt基因、ppc基因和gdhA基因。
通过使用缺乏CS、PEPC或GDH活性的突变菌株从上述微生物的染色体DNA分离补充其辅源营养的DNA片段来获得gltA基因、ppc基因和gdhA基因。而且，既然已经说明了埃希氏菌属和棒杆属细菌这些基因的核苷酸序列(Biochemistry，22，pp.5243-5249，(1983)；J.Biochem.，95，pp.909-916，(1984)；Gene，27，pp.193-199，(1984)；Microbiology，140，pp.1817-1828，(1994)；Mol.Gen.Genet.，218，pp.330-339，(1992)；MolecularMicrobiology，6，pp317-326(1992))，它们也可以通过PCR利用基于每个核苷酸序列合成的引物和作为模板的染色体DNA的引物来获得。
除了上述基因的扩增之外，也可以通过增强gltA基因、ppc基因或gdhA基因的表达，增加CS、PEPC或GDH的活性。例如通过用另一个较强的启动子代替gltA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子来增强表达。例如，λ噬菌体的lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、PR启动子和PL启动子等是已知的强启动子。启动子被取代的gltA基因、ppc基因和gdhA基因被克隆在质粒上并被引入宿主微生物中或通过使用重复DNA、反向重复序列、转座子等引入到宿主微生物的染色体DNA上。
也可以通过另一个较强的启动子代替染色体上的gltA基因、ppc基因或gdhA基因(参见WO87/03006和日本专利申请公开No.61-268183)，或在每个基因的编码序列的上游插入较强的启动子(参见Gene，29，pp.231-241(1984))来增加CS、PEPC或GDH的活性。具体地说，可以在启动子被较强的启动子取代的gltA基因、ppc基因或gdhA基因或含有部分基因的DNA和在染色体上相应的基因之间进行同源重组。
催化从L-谷氨酸的生物合成路径分支出来并产生除L-谷氨酸之外的化合物的反应的酶包括α-酮戊二酸脱氢酶(下面也称为“αKGDH”)、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等等。在这些酶当中，优选αKGDH。
为了降低或消除上述在属于肠杆菌属等的微生物中的酶的活性，可以将降低或消除酶的细胞内活性的突变引入上述酶的基因中，通过通常的诱变处理方法或基因工程方法进行。
诱变处理方法的实例包括，例如利用X-射线或紫外线的辐射的方法、利用用诱变剂如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍进行处理的方法等等。引入突变的基因的位点可以是在编码酶蛋白质的编码区域或调节表达例如启动子的区域。
基因工程方法的实例包括，例如，利用基因重组、转导、细胞融合等等的方法。例如，将抗药基因插入克隆的靶基因以制备已丧失其功能的基因(缺损基因)。随后，将该缺损基因引入宿主微生物的细胞，通过利用同源重组(基因破坏)，用上述缺损基因代替染色体上的靶基因。
目标酶的胞内活性的减少或缺乏以及活性的减少程度可以通过测量从选择株获得的细胞提取物或其纯化部分的酶活性并且将其与野生株的活性进行比较来确认。例如，可以通过Reed等人的方法测量αKGDH活性(Reed L.J.和Mukherjee B.B.，Methods in Enzymology，13，pp.55-61(1969))。
取决于靶酶，可以基于突变株的表型来选择靶突变菌株。例如，其中αKGDH活性被消除或减少的突变株不能增殖或在需氧培养条件下，在含有葡萄糖的基本培养基中或含有乙酸或L-谷氨酸作为专有碳源的基本培养基中显示出显著减少了的增殖率。然而，即使在相同的条件下，通过往含葡萄糖的基本培养基中添加琥珀酸或赖氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸，可以实现正常的增殖。通过利用这些现象作为指示物，可以选择具有减少的αKGDH活性或缺乏活性的突变株。
通过利用同源重组制备谷氨酸棒杆菌的αKGDH基因缺陷菌株的方法在WO95/34672中有详细描述。类似的方法可以适用于其它微生物。
而且，诸如克隆基因和DNA的消化以及连接技术在Molecular Cloning，2ndEdition，Cold Spring Harbor Press(1989)等中有详细描述。
作为如上所述获得的缺乏αKGDH活性或具有减少的αKGDH活性的突变株的实例，可以列举出成团泛菌AJ13356。成团泛菌AJ13356于1998年2月19日保藏在国际贸易和工业部，工业科学和技术局，国立生物科学和人类技术研究所(现在为国际专利生物体保藏中心，国立先进工业科学和技术研究所)，收到保藏号为FERM P-16645。然后在布达佩斯条约的规定下于1999年1月11日转为国际保藏，收到保藏号为FERM BP-6615。由于αKGDH-E1亚单位基因(sucA)的破坏，成团泛菌AJ13356缺乏αKGDH活性。
当在含有糖的培养基中培养是用于本发明的微生物的一个实例的成团泛菌时，胞外分泌粘液，有时候导致低的操作效率。因此，当使用具有这样的分泌粘液特性的成团泛菌时，优选使用比野生株分泌粘液少的突变株。诱变处理的实例包括，例如，利用X-射线或紫外线的辐射的方法、利用用诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍进行处理的方法等等。通过在含有糖的培养基中例如含有5g/L葡萄糖的LB培养基平板中接种诱变的细菌细胞，将平板倾斜45度对其进行培养并且选择没有流出粘液的菌落来选择具有减少的分泌粘液的突变株。
在本发明中，可以以任意顺序来实现赋予或增强产L-谷氨酸能力以及赋予其它所需的特性如如上所述的较少粘液分泌的突变。
通过在液体培养基中培养具有产L-谷氨酸能力的微生物，该培养基被调节至使L-谷氨酸沉淀的pH条件下，可以生产谷氨酸并伴随其在培养基中的沉淀而被积聚。
优选通过在液体培养基中培养积聚L-谷氨酸的微生物，该培养基被调节至使L-谷氨酸沉淀的pH条件下，可以生产谷氨酸并伴随其在培养基中的沉淀而被积聚。而且，可以在中性pH下开始培养，当完成培养时，pH达到使L-谷氨酸沉淀的条件。
“使L-谷氨酸沉淀的条件”在本文中是指当上述微生物产生和积聚L-谷氨酸时，使L-谷氨酸沉淀的条件。例如，当微生物是肠杆菌属细菌时，通常是3-5。
开始时，在适合其生长的pH下培养微生物，然后在使L-谷氨酸沉淀的条件下培养。例如，当培养基含有在使L-谷氨酸沉淀的条件下微生物不能同化的糖源或在使L-谷氨酸沉淀的条件下抑制微生物生长的有机酸时，可以在微生物同化糖源或微生物的生长不受有机酸抑制的条件下培养微生物，以使微生物消耗糖源或有机酸，然后在使L-谷氨酸沉淀的条件下培养。
在本发明的一个优选实施方案中，在培养过程中，当培养基中L-谷氨酸的浓度比自发结晶发生时的浓度低时，进行使培养基中产生L-谷氨酸晶体的操作。
本文所使用的术语“自发结晶”是指由于通过具有产L-谷氨酸能力的微生物积聚L-谷氨酸，培养基中L-谷氨酸的浓度超过饱和浓度，L-谷氨酸自发沉淀在培养基中。
使培养基中产生L-谷氨酸晶体的操作是指通过该操作人为产生晶体的操作。操作的实例包括添加晶体至培养基中，通过在培养过程中降低培养基的pH强制沉淀，在该培养基中，一定量的L-谷氨酸在培养开始时已经溶解。
培养基中产生的晶体的量通常是0.01-10g/L。要产生晶体的时间优选当在培养基中L-谷氨酸的积聚量增加至约饱和浓度时(例如，在pH4.5下，25g/L)。通过本领域技术人员公知的方法来确定在培养基中产生的晶体的量和L-谷氨酸的浓度。通过使培养基静置并且通过滗析从培养基分离晶体来确定L-谷氨酸晶体的产生量。培养基中L-谷氨酸的浓度是指溶解的L-谷氨酸的浓度。当晶体在培养基中沉淀时，浓度是通过离心(或过滤)分离固体而获得的澄清溶液的浓度。
产生L-谷氨酸晶体的操作优选添加L-谷氨酸晶体。
对于L-谷氨酸晶体，有α-型和β-型晶体(H.Takahashi，T.Takenishi，N.Nagashima，Bull.Chem.Soc.Japan，35，923(1962)；J.D.Bernal，Z.Krist.，78，363(1931)；S.Hirokawa，Acta Cryst.，B，637(1955))。当旨在获得α-型晶体时，要加的晶体优选是α-型的。
优选的晶体的量随诸如晶体的晶体形式而改变。如果晶体是α-型的，通常是0.2g/L或更多。如果比该浓度大，可以获得具有好的再现性的α-型晶体。由于它们的形状，和β-型晶体相比，处理α-型晶体更容易。
作为用于培养的培养基，可以使用通常的含有碳源、氮源、矿物盐和有机微量营养物如所需的氨基酸和维生素的营养培养基，只要调节pH以便满足预定的条件。可以使用合成培养基或天然培养基。用于培养基的碳源和氮源可以是任何一种，只要它们能够被菌株所利用而进行培养。
作为碳源，可以使用糖例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜。此外，可以单独使用有机酸如乙酸和柠檬酸或和另外的碳源的混合物。
作为氮源，使用氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵以及硝酸盐。
作为有机微量营养物，使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、那些含有这些物质的营养物如胨、酪蛋氨基酸、酵母浸膏和大豆蛋白分解产物。当使用需要氨基酸等以代谢或生长的生长素自养微生物的突变株时，必需补充所需的营养物。
作为矿物盐，使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等等。
通常在培养温度为20-42℃和pH3-5，优选4-5，更优选4-4.7，特别优选4-4.5的条件下，在通气下进行培养。从约10小时至约4天培养后，通常积聚大量的L-谷氨酸。超过饱和浓度的一部分积聚的L-谷氨酸在培养基中沉淀。
完成培养后，可以通过离心、过滤等收集在培养物中沉淀的L-谷氨酸。也可以通过已知的方法收集溶解在培养基中的L-谷氨酸。例如，通过浓缩培养液以对其进行结晶或通过离子交换色谱等来分离L-谷氨酸。也可以结晶溶解在培养基中的L-谷氨酸，然后收集在培养液中沉淀的L-谷氨酸和结晶的L-谷氨酸。
通过分离L-谷氨酸获得的发酵母液可以用作含有机氮的组合物。
在本发明的含有机氮的组合物中，有机氮的含量相对于总氮量高。有机氮质量百分数相对于总氮量优选为35％或更多。
此外，根据本发明，由于在低pH下产生L-谷氨酸，所使用的控制培养基pH的氨的量小，用于结晶L-谷氨酸的酸的量因此也小，结果发酵母液中的阴离子的量减少。一般来说，由此使用的酸是无机酸如盐酸和硫酸。例如，如果硫酸用于结晶L-谷氨酸，则在发酵母液中硫酸根基团的量小。硫酸根基团的质量百分数相对于总氮优选为500％或更小。对于肥料，优选阴离子如硫酸根基团的量小。因此，本发明的含有机氮的组合物适合于肥料的原料。
本发明的含有机氮的组合物可以是作为发酵母液的液体，或通过中和和干燥制成中性干燥的颗粒(参见日本专利申请公开No.52-7872)。
可以使用常规的发酵母液作为原料类似地进行包括本发明的含有机氮的组合物的肥料的生产。在生产过程中，可以添加另外的肥料组分。由于本发明的肥料使用本发明的含有机氮的组合物作为原料，肥料具有高含量的有机氮(特别地，除了L-谷氨酸的氮之外的有机氮)和低含量的阴离子例如硫酸根基团。
具体实施方式
实施例下面，参照以下的实施例更具体地说明本发明。在实施例中，氨基酸是L-氨基酸，除非另外说明。
参考实施例1<1>筛选具有在酸性环境中抗L-谷氨酸的微生物如下进行具有在酸性环境中抗L-谷氨酸的微生物的筛选。将包括土壤、水果、植物体、河水等的从自然界获得的大约500个样品的每1克悬浮在5mL消毒水中，将其200μL涂敷在20mL用HCl调节至pH4.0的固体培养基上。培养基的组成如下3g/L葡萄糖，1g/L硫酸铵，0.2g/L硫酸镁七水合物，0.5g/L磷酸二氢钾，0.2g/L氯化钠，0.1g/L氯化钙二水合物，0.01g/L硫酸亚铁七水合物，0.01g/L硫酸锰四水合物，0.72mg/L硫酸锌二水合物，0.64mg/L硫酸铜五水合物，0.72mg/L氯化钴六水合物，0.4mg/L硼酸，1.2mg/L钼酸钠二水合物，50μg/L生物素，50μg/L泛酸钙，50μg/L叶酸，50μg/L肌醇，50μg/L烟酸，50μg/L对-氨基苯甲酸，50μg/L盐酸吡哆辛，50μg/L核黄酸，50μg/L盐酸硫胺，50μg/L放线菌酮和20μg/L琼脂。
在28℃、37℃或50℃下培养用上述样品涂敷的培养基2-4天并获得378个形成菌落的菌株。
随后，将如上所述获得的每个菌株接种在长16.5cm和直径为14mm的含有3mL含饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基(用HCl调节至pH4.0)的试管中并且在摇晃下，在28℃、37℃或50℃下培养24小时至3天。然后，选择生长的菌株。上述培养基的组成如下40g/L葡萄糖，20g/L硫酸铵，0.5g/L硫酸镁七水合物，2g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，0.25g/L氯化钙二水合物，0.02g/L硫酸亚铁七水合物，0.02g/L硫酸锰四水合物，0.72mg/L硫酸锌二水合物，0.64mg/L硫酸铜五水合物，0.72mg/L氯化钴六水合物，0.4mg/L硼酸，1.2mg/L钼酸钠二水合物和2g/L酵母浸膏。
由此，成功地获得78个显示出在酸性环境中抗L-谷氨酸的微生物菌株。
<2>从在酸性环境中抗L-谷氨酸的微生物选择显示出优异生长率的菌株将如上所述获得的具有在酸性环境中抗L-谷氨酸的各种微生物接种进长16.5cm和直径为14mm的含有3mL通过往M9培养基(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，U.S.A.，1989)添加20g/L谷氨酸和2g/L葡萄糖获得的培养基(用HCl调节至pH4.0)的试管中，经过一定的时间测量培养基的浊度以选择显示出所需生长率的菌株。结果，作为显示出所需生长的菌株，从日本Shizuoka的Iwata-shi的土壤中获得AJ13355菌株。该菌株基于其上述细菌学特性被确定为成团泛菌。
<3>从成团泛菌AJ13355菌株获得粘液分泌少的菌株既然当在含有糖的培养基中培养时，成团泛菌AJ13355菌株胞外分泌粘液，则操作效率是不理想的。因此，通过紫外辐射方法(Miller，J.H.等人，“A ShortCourse in Bacterial Genetics；Laboratory Manual”，p.150，1992，Cold Spring HarborLaboratory Press，U.S.A)获得粘液分泌较少的菌株。
在离60瓦紫外灯60cm的位置，用紫外线辐射成团泛菌AJ13355菌株2分钟，并且在LB培养基中培养过夜以固定突变。稀释诱变的菌株和在含有5g/L葡萄糖和20g/L的琼脂的LB培养基中接种以便能够形成每个平板约100个菌落，并且倾斜平板约45度，在30℃下培养过夜，然后选择20个没有显示出粘液流出的菌落。
作为满足以下条件的菌株，即，即使在含有5g/L葡萄糖和20g/L琼脂的LB培养基中5次的培养后，没有出现回复体并且应该观察到相当于在LB培养基、含有5g/L葡萄糖的LB培养基和用20g/L的L-谷氨酸和2g/L葡萄糖补充的并用HCl调节至pH4.5的M9培养基(Sambrook，J.等人，“Molecular Cloning”，2nd.Edition Cold Spring Harbor Press，U.S.A.，1989)中的亲株的生长，从以上选择的菌株选择SC17菌株。
<4>从成团泛菌SC17菌株构建产谷氨酸的细菌。
(1)由成团泛菌SC17菌株制备αKGDH缺陷的菌株由成团泛菌SC17菌株制备αKGDH缺陷和具有增强的L-谷氨酸生物合成系统的菌株。
(i)克隆成团泛菌AJ13355菌株的αKGDH基因(下面称为“sucAB”)。
通过从成团泛菌AJ13355菌株的染色体DNA选择补充大肠埃希氏菌的αKGDH-E1亚单位基因缺陷(下面称为“sucA”)的菌株的不同化乙酸的特性的DNA片段来克隆成团泛菌AJ13355菌株的sucAB基因。
通过通常用于提取染色体的方法从大肠埃希氏菌分离成团泛菌AJ13355菌株的染色体DNA(Text for Bioengineering Experiments，由the Society forBioscience and Bioengineering编辑，日本，pp.97-98，Baifukan，1992)。用作载体的pTWV228(抗氨苄青霉素)是Takara Shuzo有限公司的商品。
通过使用T4连接酶来连接用EcoT221消化的AJ13355菌株的染色体DNA和用PstI消化的pTWV228，并且用于转化sucA缺陷的大肠埃希氏菌JRG465菌株(Herbert，J.等人，Mol.Gen.Genetics，105，182(1969))。从上述获得的转化体菌株选择在乙酸基本培养基中生长的菌株，从其中提取质粒并称为pTWVEK101。带有pTWVEK101的大肠埃希氏菌JRG465菌株除了恢复不同化乙酸性能的特征之外，还恢复琥珀酸或L-赖氨酸和蛋氨酸的辅源营养。这表明pTWVEK101包含成团泛菌的sucA基因。
图1表示源自pTWVEK101中的成团泛菌的DNA片段的限制酶切图谱。在图1中画阴影线部分的核苷酸序列中，发现了被认为是两个全长ORF的核苷酸序列和两个被认为是ORF的部分序列的核苷酸序列。对这些同源性研究的结果，显示出核苷酸序列部分包含琥珀酸脱氢酶铁-硫蛋白基因(sdhB)的3′端部分序列，全长sucA和αKGDH-E2亚单位基因(sucB基因)以及琥珀酰基CoA合成酶β亚单位基因(sucC基因)的5′端部分序列。从这些核苷酸序列推测得到的氨基酸序列与来自大肠埃希氏菌的氨基酸序列(Eur.J.Biochem.，141，pp.351-359(1984)；Eur.J.Biochem.，141，pp.361-374(1984)；Biochemistry，24，pp.6245-6252(1985))的对比结果显示在图2-5中。由此，氨基酸序列相互之间显示出很高的同源性。此外，发现和大肠埃希氏菌一样，sdhB-sucA-sucB-sucC基因簇构建在成团泛菌的染色体上(Eur.J.Biochem.，141，pp.351-359(1984)；Eur.J.Biochem，141，pp.361-374(1984)；Biochemistry，24，pp.6245-6252(1985))。
(ii)来自成团泛菌SC17菌株的αKGDH缺陷菌株的获得通过使用如上所述获得的成团泛菌的sucAB基因进行同源重组以获得成团泛菌的αKGDH缺陷菌株。
用SphI消化pTWVEK101以切断含sucA的片段，用Klenow片段使该片段平端化(Takara Shuzo有限公司)并使用T4DNA连接酶使该平端化的片段与pBR322连接，该pBR322用EcoRI消化和用Klenow片段使其平端化(TakaraShuzo有限公司)。获得的质粒在限制酶BglII识别位点被酶消化，该位点大约位于sucA的中心，用Klenow片段平端化，然后使用T4DNA连接酶再一次连接。认为sucA变得没有功能性，这是因为移码突变被引入通过上述步骤重新构建的质粒的sucA中。
用限制酶ApaLI消化如上所述构建的质粒，并经受琼脂糖胶电泳以回收含在其中引入移码突变的sucA的DNA片段和来自pBR322的抗四环素基因。再一次通过使用T4 DNA连接酶连接回收的DNA片段以构建破坏αKGDH基因的质粒。
通过电穿孔，如上所述获得的破坏αKGDH基因的质粒用于转化成团泛菌SC17菌株(Miller，J.H.，“A Short Course in Bacterial Genetics；Handbook”，p.279，Cold Spring Harbor Laboratory Press，U.S.A.，1992)，通过使用作为标记物的四环素抗性来获得其中在染色体上的sucA通过同源重组被一种突变型质粒代替的菌株。获得的菌株称为SC17sucA菌株。
为了证实SC17sucA菌株缺乏αKGDH活性，通过Reed等人的方法，对在LB培养基中培养至对数生长期的菌株的细胞测量酶活性(Reed，L.J.和Mukherjee，B.B.，Methods in Enzymology，13，pp.55-61，(1969))。结果，从SC17菌株检测出αKGDH活性为0.073(ΔABS/min/mg蛋白质)，而从SC17sucA菌株没有检测出αKGDH活性，由此证实了如所预期的那样，sucA被消除。
(2)增强成团泛菌SC17sucA菌株的L-谷氨酸生物合成系统随后，将来自大肠埃希氏菌的柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因和谷氨酸脱氢酶基因引入SC17sucA菌株。
(i)制备具有来自大肠埃希氏菌的gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒下面参照图6和7说明制备具有来自大肠埃希氏菌的gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒的步骤。
用HindIII和SphI消化具有来自大肠埃希氏菌的gdhA的质粒pBRGDH(日本专利申请公开No.7-203980)，通过T4 DNA聚合酶处理使两者的未端平端化，然后纯化和回收具有gdhA基因的DNA片段。单独地，用XbaI消化具有来自大肠埃希氏菌的gltA基因和ppc基因的质粒pMWCP(WO97/08294)，然后用T4 DNA聚合酶使两者的未端平端化。将其与上述纯化的具有gdhA基因的DNA片段混合并用T4连接酶连接以获得质粒pMWCPG，其相当于进一步含有gdhA基因的pMWCP(图6)。
同时，用NotI消化质粒pVIC40(日本质专利申请公开No.8-047397)，该质粒具有宽宿主范围质粒RSF1010的复制起点，用T4 DNA聚合酶处理并用PstI消化。用EcoT14I消化pBR322，用T4 DNA聚合酶处理并用PstI消化。混合这两个产物并使用T4连接酶连接以获得具有RSF1010复制起点和抗四环素的基因的质粒RSF-Tet(图7)。
随后，用EcoRI和PstI消化pMWCPG，纯化并回收具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的DNA片段。用EcoRI和PstI类似地消化RSF-Tet，纯化并回收具有RSF1010的复制起点的DNA片段。混合这两个产物并使用T4连接酶连接以获得质粒RSFCPG，其相当于含gltA基因、ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet(图8)。基于补充来自大肠埃希氏菌的gltA基因、ppc基因或gdhA基因缺陷菌株的辅源营养和测量每个酶的活性，证实了获得的质粒RSFCPG表达了gltA基因、ppc基因和gdhA基因。
(ii)制备具有来自谷氨酸棒杆菌的gltA基因的质粒如下构建具有来自谷氨酸棒杆菌的gltA基因的质粒。通过使用基于谷氨酸棒杆菌gltA基因的核苷酸序列制备的引物DNA(Microbiology，140，pp.1817-1828(1994))和作为模板的谷氨酸棒杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869的染色体DNA来实现PCR以获得约3kb gltA基因片段。将该片段插入用SmaI消化的质粒pHSG399(购自Takara Shuzo有限公司)以获得质粒pHSGCB(图9)。随后，用HindIII消化pHSGCB，将约3kb切断的gltA基因片段插入用HindIII消化的质粒pSTV29(从Takara Shuzo有限公司购得)以获得质粒pSTVCB(图9)。通过测量成团泛菌AJ13355菌株中的酶活性证实了获得的质粒pSTVCB表达了gltA基因。
(iii)在SC17sucA菌株中引入RSFCPG和pSTVCB通过电穿孔，用RSFCPG转化成团泛菌SC17sucA菌株以获得显示出抗四环素活性的转化体SC17sucA/RSFCPG菌株。而且，通过电穿孔，用pSTVCB转化成团泛菌SC17sucA/RSFCPG菌株以获得显示出抗氯霉素的转化体SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。
<5>获得具有改进了的在低pH环境中抗L-谷氨酸的菌株从成团泛菌SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株分离具有改进的在低pH环境中抗高浓度L-谷氨酸的菌株(下文也称为“在低pH下抗高浓度谷氨酸的菌株”)。
在30℃下，在LBG培养基中(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸膏、10g/L氯化钠、5g/L葡萄糖)培养SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株过夜，将用生理盐水稀释的细胞适当地稀释并涂敷在M9-E培养基(4g/L葡萄糖、17g/LNa2HPO4·12H2O、3g/LKH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、10mM MgSO4、10μMCaCl2、50mg/L的L-赖氨酸、50mg/L的L-蛋氨酸、50mg/L的DL-二氨基庚二酸、25mg/L四环素、25mg/L氯霉素、30g/L的L-谷氨酸，用氨水调节至pH4.5)平板上。在32℃下培养2天后获得出现的菌落，为在低pH下抗高浓度谷氨酸的菌株。
对于获得的菌株，测量在M9-E液体培养基中的生长水平，在50ml容积的大的含5mlL-谷氨酸生产试验培养基(40g/L葡萄糖，20g/L硫酸铵，0.5g/L硫酸镁七水合物，2g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，0.25g/L氯化钙二水合物，0.02g/L硫酸亚铁七水合物，0.02g/L硫酸锰四水合物，0.72mg/L硫酸锌二水合物，0.64mg/L硫酸铜五水合物，0.72mg/L氯化钴六水合物，0.4mg/L硼酸，1.2mg/L钼酸钠二水合物，2g/L酵母浸膏，200mg/L的L-赖氨酸盐酸盐，200mg/L的L-蛋氨酸，200mg/L的DL-α，ε-二氨基庚二酸，25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素)的试管中测试产L-谷氨酸的能力。显示出最好的生长水平并且和其亲株具有相同的产L-谷氨酸能力的菌株SC17/ RSFCPG+pSTVCB菌株命名为成团泛菌AJ13601。AJ13601菌株于1999年8月18日保藏在国际贸易和工业部，工业科学和技术局，国立生物科学和人类技术研究所(现在为国际专利生物体保藏中心，国立先进工业科学和技术研究所，Central 6，Higashi1-1-1，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本)，收到保藏号为FERM P-17516。然后在布达佩斯条约的规定下于2000年7月6日转为国际保藏，收到保藏号为FERM BP-7207。
实施例1在30℃下，在含25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素的LBG琼脂培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸膏，10g/LNaCl，5g/L葡萄糖和15g/L琼脂)上培养成团泛菌AJ13601菌株14小时，收集在一个平板(直径8.5cm)中的细胞并接种进300mL含50g/L葡萄糖，4g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸镁七水合物，2g/L磷酸二氢钾，10mg/L硫酸亚铁七水合物，10mg/L硫酸锰五水合物，4g/L酵母浸膏，400mg/L的L-赖氨酸盐酸盐，400mg/L的DL-蛋氨酸，400mg/L的DL-α，ε-二氨基庚二酸，25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素的培养基中，在34℃和pH6.0下在1升容积的发酵罐中开始培养。通过添加氨气控制培养物的pH。开始培养后约16小时，即在培养基中的葡萄糖被耗尽时终止培养。
将15mL如上所述培养的培养液接种进15L含50g/L葡萄糖，4g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸镁七水合物，2g/L磷酸二氢钾，10mg/L硫酸亚铁七水合物，10mg/L硫酸锰五水合物，4g/L酵母浸膏，400mg/L的L-赖氨酸盐酸盐，400mg/L的DL-蛋氨酸，400mg/L的DL-α，ε-二氨基庚二酸，25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素的培养基中，在34℃和pH6.0下在30升容积的发酵罐中开始培养。开始培养后约16小时，即在培养基中的葡萄糖被耗尽时终止培养。
将2.8L如上所述培养的培养液接种进14L含50g/L葡萄糖，5g/L硫酸铵，0.4g/L硫酸镁七水合物，5g/L磷酸二氢钾，20mg/L硫酸亚铁七水合物，20mg/L硫酸锰五水合物，6g/L酵母浸膏，800mg/L的L-赖氨酸盐酸盐，600mg/L的DL-蛋氨酸，600mg/L的DL-α，ε-二氨基庚二酸，1.5g/L氯化钠，0.75g/L氯化钙二水合物，25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素的培养基中，在34℃和pH6.0下在30升容积的发酵罐中开始培养。虽然继续培养，但当L-谷氨酸积聚时，pH自发地降低达到pH4.5。之后，通过添加氨气控制培养物的pH为4.5。当初始添加的葡萄糖耗尽后，继续添加700g/L的葡萄糖水溶液。
如上所述继续进行L-谷氨酸的发酵生产。当培养液中积聚的L-谷氨酸的浓度达到45g/L时，从发酵罐上部往培养液中添加30gα-型L-谷氨酸晶体，以在100ml水中的晶体悬浮液的形式添加，然后继续进行发酵。L-谷氨酸在培养基中积聚为晶体的浓度和L-谷氨酸溶解在培养基中的浓度总和达到100g/L时终止培养。大量的α-型L-谷氨酸晶体在发酵罐中沉淀。利用往培养基中添加硫酸的方法，调节pH至3.2，此时L-谷氨酸的溶解度变低。而且通过冷却促进溶解在溶液中的L-谷氨酸的结晶，获得晶体浆液。通过超级滗析分离在晶体浆液中沉淀的L-谷氨酸的晶体以获得所需的含有机氮的组合物。
相对于在得到的含有机氮的组合物中的总固形物的每个组分的分析含量示于表1中。
表1含有机氮的组合物的分析值
对比实施例1和实施例1相同的方式进行培养，除了在实施例1中包含300mL培养基的30L发酵罐中的培养条件按如下改变在34℃和pH6.0下开始培养，然后通过添加氨气控制培养物的pH以保持在pH6.0。通过和实施例1相同的方式，从得到的培养基获得含有机氮的组合物。
相对于在得到的含有机氮的组合物中的总固形物的每个组分的含量示于表2中。
表2对比的含有机氮的组合物的分析值
从表1和表2的结果可以看出，本发明的含有机氮的组合物具有高含量的作为肥料有效的有机氮，相对于总氮具有高比例的有机氮，特别是除了谷氨酸的氮之外具有高含量的有机氮。还可以看出硫酸根基团的量少，因此本发明的含有机氮的组合物适合于用作肥料的原料。
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>含有机氮的组合物及其肥料<140>JP 2001-44137<141>2001-02-20<160>8<210>1<211>935<212>PRT<213>成团泛菌<400>1Met Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10 15Gly Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr20 25 30Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu35 40 45Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu50 55 60Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val65 70 75 80Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile85 90 95Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu100 105 110Gly Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His115 120 125Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe130 135 140Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu145 150 155 160Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn165 170 175Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala180 185 190Ser Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu195 200 205Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro210 215 220Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met225 220 235 240Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val245 250 255Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val260 265 270Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His275 280 285Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser
290 295 300Ser Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe305 310 315 320Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val325 330 335Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu340 345 350Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val355 360 365Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly370 375 380Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn385 390 395 400Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met405 410 415Val Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val420 425 430Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg435 440 445Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu450 455 460Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys465 470 475 480Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu485 490 495Gly Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg500 505 510Asp Ala Leu Asp 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His Ser Ser Ala Arg Leu725 730 735Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val740 745 750Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu755 760 765Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu770 775 780Arg His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser785 790 795 800Phe Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val805 810 815Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu820 825 830Gln Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu835 840 845Gln Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala850 855 860Tyr Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn865 870 875 880Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro885 890 895Phe Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro900 905 910Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val915 920 925Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn930 935<210>2<211>407<212>PRT<213>成团泛菌<400>2Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala1 5 10 15Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser20 25 30Arg Asp Glu Val Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu35 40 45Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu50 55 60Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly65 70 75 80Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr85 90 95Thr Pro Ala Gln Arg Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp100 105 110Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp115 120 125Ala Ala Gln Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu130 135 140Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala145 150 155 160Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg165 170 175Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu180 185 190Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn195 200 205Glu Ile Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp210 215 220Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr225 230 235 240Ile Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala245 250 255Ser Ile Asp Gly Glu Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser260 285 270Ile Ala Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp275 280 285Val Asp Ala Leu Ser Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu290 295 300Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly305 310 315 320Gly Asn Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser325 330 335Thr Pro Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala340 345 350Ile Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro355 360 365Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg370 375 380Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lya Glu Met Leu Glu Asp Pro385 390 395 400Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val405<210>3<211>41<212>PRT<213>成团泛菌<400>3Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala Arg Tyr Gly1 5 10 15Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu20 25 30Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala Gly35 40<210>4<211>39<212>PRT<213>成团泛菌<400>4Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val1 5 10 15Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser20 25 30Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala
35<210>5<211>933<212>PRT<213>大肠埃希氏菌<400>5Met Gln Asn Ser Ala Leu Lys Ala Trp Leu AsP Ser Ser Tyr Leu Ser1 5 10 15Gly Ala Asn Gln Ser Trp Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr20 25 30Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Asn Trp Arg Ser Thr Phe Gln Gln Leu35 40 45Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Asp Gln Phe His Ser Gln Thr Arg Glu50 55 60Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ile65 70 75 80Ser Asp Pro Asp Thr Asn Val Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile85 90 95Asn Ala Tyr Arg Phe Arg Gly His Gln His Ala Asn Leu Asp Pro Leu100 105 110Gly Leu Trp Gln Gln Asp Lys Val Ala Asp Leu Asp Pro Ser Phe His115 120 125Asp Leu Thr Glu Ala Asp Phe Gln Glu Thr Phe Asn Val Gly Ser Phe130 135 140Ala Ser Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Gly Glu Leu Leu Glu Ala Leu145 150 155 160Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Pro Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Thr165 170 175Ser Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Arg180 185 190Ala Thr Phe Asn Ser Glu Glu Lys Lys Arg Phe Leu Ser Glu Leu Thr195 200 205Ala Ala Glu Gly Leu Glu Arg Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly Ala210 215 220Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ile Pro Met Leu Lys225 230 235 240Glu Met Ile Arg His Ala Gly Asn Ser Gly Thr Arg Glu Val Val Leu245 250 255Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Val Asn Val Leu Gly260 265 270Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ala Gly Lys His Lys Glu275 280 285His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser Asp290 295 300Phe Gln Thr Asp Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro305 310 315 320Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Ile Gly Ser Val Arg Ala325 330 335Arg Leu Asp Arg Leu Asp Glu Pro Ser Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile340 345 350Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Thr Gly Gln Gly Val Val Gln Glu355360 365Thr Leu Asn Met Ser Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val
370 375 380Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu385 390 395 400Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val Gln405 410 415Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe420 425 430Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val435 440 445Phe Ile Asp Leu Val Ser Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp450 455 460Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His465 470 475 480Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gln Glu Lys Val485 490 495Ala Thr Leu Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala500 505 510Leu Asp Ala Gly Asp Cys Val Val Ala Glu Trp Arg Pro Met Asn Met515 520 525His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Glu530 535 540Tyr Pro Asn Lys Val Glu Met Lys Arg Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg545 550 555 560Ile Ser Thr Val Pro Glu Ala Val Glu Met Gln Ser Arg Val Ala Lys565 570 575Ile Tyr Gly Asp Arg Gln Ala Met Ala Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp580 585 590Trp Gly Gly Ala 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Lys Gly Val Lys Arg805 810 815Val Val Met Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Arg820 825 830Arg Lys Asn Asn Gln His Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln Leu835 840 845Tyr Pro Phe Pro His Lys Ala Met Gln Glu Val Leu Gln Gln phe Ala850 855 860His Val Lys Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln Gly865 870 875 880Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Glu Val Ile Pro Phe Gly885 890 895Ala Ser Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala Val900 905 910Gly Tyr Met Ser Val His Gln Lys Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn Asp915920 925Ala Leu Asn Val Glu930<210>6<211>405<212>PRT<213>大肠埃希氏菌<400>6Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala1 5 10 15Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Val20 25 30Arg Asp Glu Val Leu Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu35 40 45Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Ile Leu Asp Ala Val Leu Glu Asp Glu50 55 60Gly Thr Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Arg Glu Gly65 70 75 80Asn Ser Ala Gly Lys Glu Thr Ser Ala Lys Ser Glu Glu Lys Ala Ser85 90 95Thr Pro Ala Gln Arg Gln Gln Ala Ser Leu Glu Glu Gln Asn Asn Asp100 105 110Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Leu Ala Glu His Asn Leu Asp115 120 125Ala Ser Ala Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu130 135 140Asp Val Glu Lys His Leu Ala Lys Ala Pro Ala Lys Glu Ser Ala Pro145 150 155 160Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gln Pro Ala Leu Ala Ala Arg Ser Glu165 170 175Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu180 185 190Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu Val195 200 205Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Glu Ala Phe210 215 220Glu Lys Arg His Gly Ile Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Val Lys225 230 235 240Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile245 250 255Asp Gly Asp Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Met Ala260 265 270Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp275 280 285Thr Leu Gly Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val290 295 300Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Glu Asp Leu Thr Gly Gly Asn305 310 315 320Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro325 330 335Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ale Ile Leu Gly Met His Ala Ile Lys340 345 350Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Glu Ile Leu Pro Met Met355 360 365Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser370 375 380Val Gly Phe Leu Val Thr Ile Lys Glu Leu Leu Glu Asp Pro Thr Arg385 390 395 400Leu Leu Leu Asp Val405<210>7<211>60<212>PRT<213>大肠埃希氏菌<400>7Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala Arg Tyr Gly1 5 10 15Leu Pro Ala Pro Val Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu20 25 30Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala Gly Pro Trp Val Val Lys Cys Gln35 40 45Val His Ala Gly Gly Arg Gly Lys Ala Gly Gly Val50 55 60<210>8<211>58<212>PRT<213>大肠埃希氏菌<400>8Phe Leu Ile Asp Ser Arg Asp Thr Glu Thr Asp Ser Arg Leu Asp Gly1 5 10 15Leu Ser Asp Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys20 25 30Val Ser Val Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His35 40 45Ile Lys Ser Met Leu Leu Gln Arg Asn Ala50 5权利要求
1.一种含有机氮的组合物，含有发酵母液，其通过在液体培养基中培养具有产L-谷氨酸能力的微生物，该液体培养基的pH被调节至使L-谷氨酸沉淀的条件下以产生L-谷氨酸和伴随L-谷氨酸的沉淀而积聚，然后从培养基分离L-谷氨酸而获得。
2.根据权利要求1的含有机氮的组合物，其中微生物属于肠杆菌属。
3.根据权利要求2的含有机氮的组合物，其中微生物是成团泛菌。
4.根据权利要求1-3任意一项的含有机氮的组合物，其中微生物在特定的pH下代谢液体培养基中的碳源，该液体培养基含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源，并且具有以超过在该pH下的液体培养基中的饱和浓度的L-谷氨酸的数量积聚L-谷氨酸的能力。
5.根据权利要求4的含有机氮的组合物，其中特定的pH是5.0或更小。
6.根据权利要求4或5的含有机氮的组合物，其中适合于用微生物生产L-谷氨酸的pH是在该pH下，L-谷氨酸在培养基中沉淀的pH，并且在该pH下的培养基中进行培养时，产生L-谷氨酸并且伴随L-谷氨酸的沉淀而积聚。
7.含有权利要求1-6任意一项所定义的含有机氮的组合物的肥料。
全文摘要
一种含有机氮的组合物,含有通过在液体培养基中培养具有产L－谷氨酸能力的微生物,该液体培养基的pH被调节至使L－谷氨酸沉淀的条件下以产生L－谷氨酸和伴随L－谷氨酸的沉淀而积聚,然后从培养基分离L－谷氨酸而获得的发酵母液。
文档编号C12R1/01GK1377971SQ0210803
公开日2002年11月6日 申请日期2002年2月20日 优先权日2001年2月20日
发明者香田隆之, 佐藤和博 申请人:味之素株式会社