用于防治青枯病的大肠埃希氏菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一株用于防治青枯病的大肠埃希氏菌及其应用。该菌株的名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GZ?34，保藏编号为CCTCC NO:M 2016353，于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。本发明的菌株对青枯菌有显著的拮抗作用，为青枯病的防治又提供了一种途径。CCTCC NO: M 201635320160627
【专利说明】
用于防治青枯病的大肠埃希氏菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一株用于防治青枯病的大肠埃希氏菌及 其应用。
【背景技术】
[0002] 植物细菌性青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种维 管束毁灭性土传细菌性病害，在亚热带、热带和温带地区发生普遍系统侵染的毁灭性土传 病害，俗称"植物瘟病"。青枯劳尔氏菌寄主广泛，可侵染54个科的450余种植物。目前，细菌 性青枯病的防治是世界公认的一大难题，它广泛分布于世界各地，在我国南方省市发生严 重，尤其在浙江，近年来不但茄科、瓜类受害，大面积发生的桑青枯病更对蚕业生产造成严 重损失。
[0003] 青枯菌有很多小种，根据青枯菌的寄主范围分为5个生理小种，小种1主要危害多 数茄科植物，包括番茄、马铃薯、茄子和烟草等，还危害其他科植物;小种2能侵染香蕉、海里 康(Heliconais)和大蕉等植物;小种3主要危害马铃薯，也可弱侵染烟草和番茄;小种4侵染 姜以及弱侵染马铃薯等其他植物。另有研究人员将从我国南方桑树上分离到的青枯病菌株 命名为小种5。侵染马铃薯的青枯病菌主要是小种1和小种3。
[0004] 目前，青枯病的防治方法主要有加强田间管理、培育抗病品种、使用化学药剂和施 用生防菌剂等，但实践证明，田间管理难以有效控制青枯病发生;抗性材料的选育耗时长； 而化学防治污染环境、破坏生态平衡，且化学药剂的长期使用易使病原菌产生抗药性。因 此，利用生防菌株及其活性产物防治生姜青枯病越来越受到人们的重视。大量研究表明，部 分细菌、放线菌是较理想的青枯病拮抗菌。
[0005] 目前，大肠埃希氏菌自身作为青枯病生防菌剂的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株用于防治青枯病的 大肠埃希氏菌。
[0007] 本发明的另一目的在于提供所述用于防治青枯病的大肠埃希氏菌的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一株用于防治青枯病的大肠埃希氏菌，名 称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GZ-34,保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2016353,于2016年 6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
[0009] 所述用于防治青枯病的大肠埃希氏菌的菌落形态为:菌株细胞杆状，在LB琼脂平 板上培养时菌落圆形，边缘整齐且规则，表面湿润、光滑，不透明。
[0010] 所述用于防治青枯病的大肠埃希氏菌在防治青枯病中的应用。
[0011] 所述用于防治青枯病的大肠埃希氏菌在防治青枯病中的应用，是将大肠埃希氏菌 施加于培养农作物的土壤中或是喷洒在农作物的表面。
[0012] 所述的农作物为易于被青枯菌感染的农作物;优选为茄科作物。
[0013] 所述的农作物可为已被青枯菌感染的农作物，或是未被青枯菌感染的农作物。
[0014] -种青枯病生物防治菌剂，含有上述用于防治青枯病的大肠埃希氏菌。
[0015] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明提供一株用于防治青枯病 的大肠埃希氏菌，为青枯病的防治又提供了一种途径。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明中菌株GZ-34对青枯菌的拮抗效果照片图。
[0017] 图2是本发明中青枯病拮抗菌生防实验效果图。
[0018] 图3是本发明中菌株GZ-34单菌落的照片图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0020] 实施例1:细菌进行分离纯化
[0021] 1.培养基
[0022] LB琼脂培养基(LB固体培养基）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，用 H20定容至 1000mL，pH 7.0-7·2,121°C灭菌20分钟。
[0023] 2.实验步骤
[0024] (1)样品采集:选择具代表性的地点（青枯病发病田地中健康植株根系土壤，地点 广东省），铲去表层土，用采土工具采取距离地表下5~10厘米深度的土层中的土壤，每个地 点采5个样本，装入袋中并作好记录。
[0025] (2) 土壤稀释液的制备:称取10g 土壤，放入装有90mL无菌水的三角瓶中充分振荡， 制成1:10浓度的土壤稀释液。待土粒沉淀后，吸取lmL上清液，移入盛有9mL灭菌水的试管 中，制成1:100浓度的土壤悬浮液，依次类推，制成1:1000和1:10000的土壤悬浮液，制成10 -2、10- 3、10-4、10-5和10-6倍的土壤溶液备用。
[0026] (3)细菌分离:选择10-3、10-4、10- 5和10-6四个浓度各O.lmL，将稀释的土壤悬浮液分 别倒入含LB琼脂培养基的培养皿中，将涂布棒在酒精灯火焰充分灼烧灭菌，待冷却后涂布 平板。将接种完的培养皿倒置，30°C恒温培养，设置三个重复。
[0027] (4)结果:分离得到细菌384株。
[0028] 实施例2:分离得到的细菌对青枯菌的平板拮抗试验
[0029] 1.培养基
[0030] TTC固体培养基：①蛋白胨10g，酸水解酪蛋白（Casein Acid Hydrolysate)lg，葡 萄糖5g，琼脂15g，用H20定容至1000mL，pH6.8-7.2; 121°C灭菌20分钟，得到溶液I;②TTC(2， 3,5-氯化三苯四氮唑）用蒸馏水配成质量百分比1%的溶液，用0.22μπι滤膜过滤除菌，得到 溶液Π ;③在溶液I冷却至约45°C时，每100mL溶液I加入0.5mL溶液II，即可倒平板。
[0031 ] TTC液体培养基:同TTC固体培养基，不加琼脂和TTC。
[0032] 2.实验步骤
[0033] 2.1平板诘抗试验--初筛
[0034] 2.1.1菌种活化
[0035] 青枯菌和细菌进行菌种活化:青枯菌GMI1000 (ATCC)和实施例1分离得到的384株 细菌分别转接至TTC固体培养基平板和LB琼脂培养基平板，分别于28 °C培养2天或于30 °C培 养1天，备用。
[0036] 2.1.2青枯菌平板的制备
[0037]活化的青枯菌接入TTC液体培养基中进行摇瓶培养，28°C，200rpm培养2天，得到青 枯菌发酵液。隔天以TTC固体培养基倒平板，等培养基凝固后每个平板中加入0.1mL(OD6〇〇约 2.0) 青枯菌发酵液，涂布均匀，吹干备用，得到青枯菌平板。
[0038] 2.1.3平板拮抗试验初筛
[0039]用灭菌的牙签挑取活化的384株细菌单菌落，点接在青枯菌平板上，每个平板接30 株不同的拮抗菌，3个重复，28°C培养，24h、36h和48h分别观察实验结果，主要观察抑菌圈的 有无。
[0040] 2.2平板拮抗试验一一复筛
[0041 ] 2.2.1菌种活化
[0042]同2.1.1，活化选择初筛有抑菌圈的分离细菌。
[0043] 2.2.2青枯菌平板的制备
[0044]活化的青枯菌接入TTC液体培养基中进行摇瓶培养，28°C，200rpm发酵2天，得到青 枯菌发酵液。隔天以TTC固体培养基倒平板，等培养基凝固后每个平板中加入0.1mL(OD6〇〇约 2.0) 青枯菌发酵液，涂布均匀，吹干后打孔器（Φ5_)打孔，每个平板打一个孔备用。
[0045] 2.2.3分离细菌液体发酵
[0046] 在青枯菌液体摇瓶培养的第二天，活化的分离细菌转入LB液体培养基中进行摇瓶 培养，30 °C，200rpm培养24小时(0D6QQ约 2 · 0)。
[0047] 2.2.4平板拮抗试验复筛
[0048]用移液枪吸取10yL分离细菌发酵液放入青枯菌平板的孔中，吹干，3个重复，28°C 培养。24h、36h和48h分别观察实验结果，主要观察抑菌圈的有无和大小。
[0049] 3.结果
[0050] 通过初筛试验得到有拮抗效果的细菌53株，通过平板拮抗试验打孔复筛，抑菌圈 越明显，说明拮抗作用越好。复筛得到拮抗效果较好的细菌6株，菌株GZ-34就是其中一株。 [0051 ]由图1可以看出抑菌圈明显，说明菌株GZ-34对青枯菌具有明显的拮抗作用。
[0052]实施例3:菌株GZ-34的生物防治效果试验
[0053]为了检验菌株GZ-34的生防效果，将菌株GZ-34发酵液在盆栽上对青枯病进行生防 效果试验。
[0054] 1.实验步骤
[0055] 1.1买茄子苗
[0056]买在大棚中育好的茄子苗。
[0057] 1.2茄子苗移栽
[0058]在花盆(规格170mm*160mm)装满基质土，略压紧，然后每盆移入1株前子苗，饶水后 两指在根部略压紧，在大棚中培养。花盆中培养4周左右。
[0059] 1.3青枯菌和拮抗菌的活化与发酵液制备
[0060] 青枯菌GMI1000和拮抗菌GZ-34分别活化，然后挑单菌落接入TTC液体培养基和LB 液体培养基摇瓶培养，200rpm，分别于28 °C和30 °C培养两天(0D6QQ都约2.5)。
[0061 ] 1.4青枯菌和拮抗菌接种
[0062] 本试验设置2个对照组，即CK1和CK2 XK1:不加任何菌，只加入5mLTTC液体培养基； CK2:只加5mL青枯菌发酵液，不加拮抗菌发酵液。菌株GZ-34处理:按照青枯菌:拮抗菌体积 比为1:1、1:2.5和1:5，做3个处理，每个处理5盆，每株根部先浇5mL青枯菌发酵液，然后再浇 5mL、12.5mL、25mL诘抗菌发酵液。
[0063] 1.5i 己录
[0064] 隔一天记录发病植株数和发病严重程度。
[0065] 2.试验结果
[0066]如图2所示，人工接种后，只接TTC液体培养基的对照组CK1不发病，死亡率0,直接 青枯菌GMI1000发酵液的对照组CK2全部发病，死亡率100%，接种青枯菌GMI1000发酵液和 拮抗菌GZ-34发酵液的处理组1:1、1:2.5、1:5死亡率分别为40 %、40 %、20 %，由此可见，拮 抗菌GZ-34发酵液处理能使茄子植株青枯病的发生得到有效控制。
[0067] 实施例4菌株GZ-34的鉴定
[0068]经广东省微生物分析检测中心检测，其检测依据为《常见细菌系统鉴定手册》（东 秀珠主编科学出版社)《伯杰细菌鉴定手册》第九版以及《分子克隆实验指南》第二版(黄培 堂译2002科学出版社），鉴定结果为:菌种GZ-34的16S rDNA序列与Escherichia coli(大肠 埃希氏菌）的同源性达99.37%，其形态特征及生理生化特性与Escherichia coli(大肠埃 希氏菌)最相似。具体检测结果如下：
[0069] 1.该保藏菌株的形态、培养、生理、生化等特征
[0070] 大肠埃希氏菌GZ-34:属大肠埃希氏菌(Escherichia coli);在LB培养基中生长良 好，菌株细胞杆状，在LB琼脂平板上培养时菌落圆形，边缘整齐且规则，表面湿润、光滑，菌 落不透明（如图3所示）。
[0071] 2.菌株GZ-34理化实验
[0072]实验结果如表1所示：
[0073] 表 1
[0074]
[0075] 注："+"表示阳性，表示阴性。
[0076] 3.16S rRNA序列比对
[0077] 菌株GZ-34 16S rRNA基因序列测定结果如下：
[0079] 将所得16S rRNA基因序列在NCBI网站上进行BLAST比对分析，得到与大肠埃希氏 菌16S rRNA的相似度达99.37%，其形态特征及生理生化特性与大肠埃希氏菌最相似，因此 根据16S rRNA基因序列测定和形态特征、生理生化特性结果来看，该菌株可以归为大肠埃 希氏菌（Escherichia coli)〇
[0080] 将GZ-34命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GZ-34,保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2016353,于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
[0081] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一株用于防治青枯病的大肠埃希氏菌，其特征在于：名称为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)GZ-34,保藏编号为CCTCC NO:M 2016353,于2016年6月27日保藏于位 于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。2. 权利要求1所述的用于防治青枯病的大肠埃希氏菌在防治青枯病中的应用。3. 根据权利要求2所述的用于防治青枯病的大肠埃希氏菌在防治青枯病中的应用，其 特征在于:是将大肠埃希氏菌施加于培养农作物的土壤中或是喷洒在农作物的表面。4. 根据权利要求3所述的用于防治青枯病的大肠埃希氏菌在防治青枯病中的应用，其 特征在于:所述的农作物为易于被青枯菌感染的农作物。5. 根据权利要求4所述的用于防治青枯病的大肠埃希氏菌在防治青枯病中的应用，其 特征在于:所述的农作物为茄科作物。6. -种青枯病生物防治菌剂，其特征在于:含有权利要求1所述用于防治青枯病的大肠 埃希氏菌。
【文档编号】C12N1/20GK105969707SQ201610614212
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】邓音乐, 宋施豪, 杨春喜, 崔朝宇, 董廷艳, 孙秀云
【申请人】华南农业大学