专利名称：微生物发酵法生产青霉素酰化酶的制作方法
技术领域：
本发明是关于用微生物发酵法生产青霉素酰化酶(Penicillin acylase)的方法。
由于青霉素耐药菌的普遍产生，一批疗效高，毒付作用低，抗菌谱广的半合成青霉素成为控制感染的主要药物。青霉素酰化酶能水解青霉素产生6-氨基青霉烷酸(6-APA)，6-APA是制造半合成青霉素的重要中间体。微生物产生的青霉素酰化酶有胞内酶和胞外酶，对制备固定化酶来说胞外酶不需破坏细胞壁释放酶，易于分离纯化，是制备固定化酶的理想酶原，而胞内酶破壁较麻烦，提取较困难。
为得到高产青霉素酰化酶产生菌，已建立了许多种筛选，诱变和得到工程菌的方法。日本专利丁59183692号报导了用紫外线和高能量的射线处理大肠杆菌，得到的突变株具有高的青霉素酰化酶活性或7-氨基头孢氨酸(7-ACA)活性。南朝鲜的Son等用紫外线诱变巨大芽胞杆菌，酶活提高3-4倍，在最适的培养条件下酶产量可增加7-8倍，所用的出发菌ATCC14945在没有苯乙酸存在时不产生酶(J.Gen.Appl.Microbial.28，281-291，1982.)中国科学院上海药物所杨胜利等人用遗传工程的方法构建了青霉素酰化酶产生菌大肠杆菌A56(PA22)活性比大肠杆菌原株高2-4倍，酶活达200-300u/100ml(NIPAB法)。英国专利GB2142336描述了一种用重组DNA技术增加青霉素酰化酶产量的方法，从酰化酶产生菌巨大芽孢杆菌分离能提高青霉素酰化酶产量的基因片断，引入来自枯草芽孢杆菌的质粒，得到的重组质粒转化青霉素产生菌巨大芽孢杆菌，得到的菌株产酶量比原株高20%。
用青霉素酰化酶生产6-APA有固定化细胞和固定化酶两条路线，过去国内的研究主要集中在产胞内青霉素酰化酶的大肠杆菌及固定化细胞生产6-APA的研究上，1979年已完成了固定化细胞生产6-APA的工艺。但存在着由于菌种活力不高，固定化细胞比活不高，投料浓度低，裂解液要经浓缩提取6-APA等缺点。
本发明的目的在于通过物理和化学因子处理得到产高酶活细胞外酶的菌株，结合发酵条件的研究进一步提高酶产量，经分离提纯所得的酶可直接用于固定化酶生产。
实施方案总体介绍如下将土样磨细或用水稀释到适当浓度，喷涂到制备好的分离平皿上，28℃培养24小时菌落长出，盖上沾有NIPAB(6-硝基-3-苯乙酰胺基苯甲酸)的滤纸片，纸片上的NIPAB接触产青霉素酰化酶的菌落就被分解成3-氨基-6-硝基苯甲酸，呈现黄色。把产有黄色的菌落接种到斜面上，再经摇瓶发酵测定酶活力从数百个菌株中选出酶活在50u/100ml以上的菌株10个，菌大小均为0.9-1.0×2.5-4.0u，具有中生芽孢，孢子不膨大等菌学特征，鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，从中复筛出较好菌株诱变。
对高活力菌株进行单株分离，用物理和化学因子进行反复诱变处理，处理因子包括紫外线(UV)，亚硝基胍(NTG)，氯霉素(Cm)，氯化锂(LiCl)，挑选酶活高的单菌落继续诱变处理。所得的突变株巨大芽孢杆菌81号为国内外所见报导的青霉素酰化酶产生菌中活力最高。在最适的发酵产酶条件下，摇瓶发酵可达700-800u/100ml，最高达820u/100ml(NIPAB法)。比较了原菌株和突变株的菌学性质和产酶条件，原菌株菌落表面光滑，呈乳白色，凸起，菌体粘稠，菌体细胞细小，而突变株菌落表面粗糙，有条纹，稍带黄色，菌体干燥，菌体细胞粗大。苯乙酸为青霉素酰化酶的诱导剂，突变株和原株在没有苯乙酸存在下都能产生酶，但酶活力较低。加入苯乙酸随着苯乙酸用量增加，原株当苯乙酸增加到0.4%时酶活力最高，突变株当苯乙酸增加到0.9%时酶活力最高，原株在培养10小时时添加苯乙酸产酶活力最高，突变株在开始培养时加入苯乙酸产酶活力最高。
本发明所用的菌株巨大芽孢杆菌81号保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.0145。研究了突变株的发酵条件，菌种分离和斜面保种培养基为牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，NaCl0.5%，琼脂1.5-2.0%。发酵培养基为，葡萄糖1.0%，蛋白胨1.5%，酵母膏0.3-0.9%，苯乙酸0.1-1.1%，最好在0.6-0.9%，苯乙酸加入时间为从发酵开始到14小时，最好在开始时加入，培养起始的PH为6.5-8.5，最好在6.8-7.2，250ml的摇瓶中装10-20ml最适，28±1℃摇床培养，摇床速度为180-200rpm，种子培养时间为14-18小时，发酵培养时间为30-72小时，最好为40-45小时。
发酵后将发酵液调至酸性，最好用醋酸调PH至6.5，用硅藻土或氧化铝吸附，用硅藻土时以10%(重量体积)用量为宜。搅拌吸附80-120分钟，以120分钟为宜，继续增加时间吸附率基本不变，吸附后静置约1小时，使硅藻土沉于底部，倒掉上面的菌体，水洗数次，一般三次，每次水的用量为原发酵液的体积，水洗后抽干，加入约为原发酵液体积15%的PH8.5的24%的硫铵，调成糊状，装柱，用上述硫铵溶液洗脱，洗脱过程中测定酶活，至基本上测不出酶活为止。用中空纤维膜超滤浓缩，所得酶比活为20u/mg蛋白以上，该酶含硫酸铵高，易保存，固定化之前用中空纤维膜超滤脱盐可直接用于固定化酶生产。酶提取总数率80%以上。
用上述方法所得的青霉素酰化酶以合成纤维为载体制备固定化青霉素酰化酶，达到目前已知的同类产品的国际先进水平。用固定化酶裂解青霉素生产6-APA收率达85-89%，纯度达98%，质量符合规定标准。
借助下述实施例进一步阐明本发明的优选方案。
实施例(1)、菌株诱变筛选得到的菌株中对产酶量高的菌株46号进行单株分离，得46-1，对菌株46-1按下表进行物理和化学因素处理。
表1 诱变谱系诱变菌落 筛选株数 酶活力(u/100ml) 提高(%)46-1 197 100↓UV，7′U17-1 255 240 122↓单菌纯化U17-1-41 64 221 119↓UV，3′U23-82 464 288 146↓CmC1-4 329 495 251↓CmC5-130 678 536 272↓单菌纯化C51-130-1 54 530 269↓UV，5′U45-3 274 560 284↓NTGN14-57 436 706 358↓UV+LiClULi-81 223 723 367
表中UV代表紫外线，Cm代表氯霉素，NTG代表亚硝基胍。
所得的菌株ULi-81酶活为723U/100ml(2)、发酵ULi-81菌种从斜面接种到250ml的含20ml种子培养基的三角瓶中，培养基为，蛋白胨1.5%，葡萄糖1%，酵母膏0.5%，PH7.0，28℃摇床培养16小时作为种子液，接种到500ml发酵培养基中(分装在25个250ml的三角瓶中，每瓶装20ml，接种1ml种子液)，培养基为，蛋白胨1.5%，葡萄糖1%，酵母膏0.5%，苯乙酸0.6%，PH7.0，28℃摇床上培养40小时，摇床转速200rpm。
(3)、分离提纯合并培养液(500ml)，用醋酸调PH到6.5，加入50克硅藻土，搅拌2小时，静置1小时，倒掉上面的菌体，水洗三次，每次用500ml水，水洗后抽干，加入PH8.5的24%硫铵80ml，搅成糊状，装入柱中，用上述硫铵溶液洗脱，洗脱过程中监测酶活，洗至基本无酶活为止，得洗脱液约200ml，用中空纤维膜超滤浓缩、脱盐，得酶比活为24单位/mg蛋白，酶总收率80%。所得的酶可直接用于固定化酶的制备。
(4)、用上述酶制备固定化酶，裂解青霉素，青霉素投料浓度10%，6-APA收率87.5%，6-APA纯度98.1%，质量符合标准。
权利要求
1.一种利用微生物发酵生产青霉素酰化酶的方法，该方法包括菌种的筛选和诱变，发酵，酶的分离提纯步骤，其特征在于(1)、以筛选的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为出发菌进行反复诱变处理，得到产胞外青霉素酰化酶的高产菌株巨大芽胞杆菌81号(CGMCC NO.0145)，(2)、将种子培养液接入含1.0%葡萄糖，1.5%蛋白胨，0.3-0.9%酵母膏，0.1-1.1%苯乙酸的发酵培养基中，发酵起始培养PH为6.5-8.5，在28℃±1℃摇床培养30-72小时，摇床速度为180-200rpm，(3)、用吸附，洗脱，超过滤步骤提纯青霉素酰化酶。
2.根据权利要求1所述的方法其特征在于菌种分离时培养基中不加青霉素酰化酶的诱导剂苯乙酸。
3.根据权利要求1所述的方法其特征在于菌种诱变方法包括用物理和化学因子反复处理，处理中选高酶活的单菌落，这些处理因子包括，紫外线，亚硝基胍，氯霉素，氯化锂。
4.根据权利要求1所述的方法其特征在于发酵培养基中酵母膏为0.4-0.6%，苯乙酸为0.6-0.9%。
5.根据权利要求1所述的方法其特征在于苯乙酸在发酵开始0-14小时加入，在开始发酵时加入最好。
6.根据权利要求1所述的方法其特征在于发酵时间在40-45小时。
全文摘要
一种用微生物发酵生产青霉素酰化酶的方法。以巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为出发菌，经物理和化学因子反复诱变处理，得到产胞外青霉素酰化酶高产菌株。在适宜的发酵培养条件下，酶活达700-800单位/100ml，最高达820单位/100ml(NIPAB法)。发酵液经分离提纯，酶比活20单位/mg蛋白以上，可直接用于固定化酶的制备。
文档编号C12N9/00GK1049682SQ8910820
公开日1991年3月6日 申请日期1989年10月26日 优先权日1989年10月26日
发明者王祯祥, 徐冠珠, 朱丽钊, 韩文珍, 门大鹏 申请人:中国科学院微生物研究所