专利名称：含有一个或几个点突变的青霉素g酰化酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物生产领域，具体涉及β-内酰胺类抗生素生产及其生产用酶，更具体涉及青霉素G酰化酶及其在β-内酰胺类抗生素生产中的应用。
背景技术：
β -内酰胺类抗生素是临床应用中最重要的一大类抗生素(包括青霉素和头孢菌素等)，其分子中所含的青霉烷或头孢烯能够破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用。天然存在的β_内酰胺类抗生素具有抗菌谱窄、不耐酸、容易产生抗药性和容易引起过敏反应等缺点，这些缺点促使了半合成青霉素和半合成头孢菌素的研发。青霉素G 酰化酶(penicillin G acylase, PGA, EC 3.5.1.11))可以水解青霉素G(penicillinG，PenG)获得β -内酰胺抗生素工业中的重要中间体6-氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanic acid, 6-ΑΡΑ),同时又可以6-ΑΡΑ为原料合成其他多种合成或半合成β -内酰胺类抗生素。因此，PGA是β -内酰胺类抗生素工业中一种具有重要意义的生物催化剂。由于PGA的开发具有诱人前景，许多科研院所及制药企业投入大量的研究，并有大量研究文献与专利相继报道。目前已经从许多细菌中克隆并表达出编码PGA的基因，如大肠杆菌(Escherichia co7i,Ec)、嗜朽1 檬酸克吕沃尔氏菌{Kluyvera citrophila’lc)、電氏普罗威登斯菌{Providencia reiigeri, Pr)、幾产喊杆菌(Alcaligenes faecal is, Af) >无色杆菌木糖氧化属 iAchromobacter xylosoxidans, Αχ)、假单胞菌属(Pseudomorms sp,Ps)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium, Bm)与粘节杆菌 iArthrobacterviscosus，Av)
坐寸ο周政(ActaBiochemica et Biophysica, 35 (6):573_579)、程天凡(2005,浙江大学硕士学位论文)等利用PGA基因家族重排技术对PGA基因进行改造，分别获得了合成活性提高的重组体和合成/水解比率提高的重组体；Alkema等(Alkema WBL, 2002，Eur.J.Biochem，269:2093-2100)将a F146和β F24氨基酸残基分别突变为亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)后，氨苄青霉素和头孢氨苄的合成性能得到提高。此外，国际专利申请W096/05318通过突变底物结合位点的一个或多个氨基酸来改变PGA的特异性及合成/水解比率；W098/20210报道了 EcPGA的α 142和α 146位氨基酸的突变和β24、β56或β 177位氨基酸的突变，特别是突变体i3F 24A突变体合成青霉素和头孢菌素的产量具有显著提高；而在W003/055998中，突变体a R145L、a R145C、a R145K虽然具有较高的合成/水解比 率，但合成活性却大大降低，中国专利CN101177688所报道的BmPGA的突变体也显示了相似的结果。虽然研究人员已经分离纯化并克隆表达出许多天然存在的PGA并进行改造，但这些PGA仍有很多方面不尽如人意，如成熟为活性酶的效率不高、合成活性低或合成/水解(S/Η)比率低、生成的副产物多等不足。因此本领域存在对具有合成/水解比率高、合成活性高和副产物少的青霉素G酰化酶的需要。
发明内容
本发明涉及新的青霉素G酰化酶突变体，编码所述突变体的核酸，相关表达载体和宿主细胞以及所述突变体合成阿莫西林的用途。本发明的青霉素G酰化酶突变体的合成活性和合成/水解比率相比野生型有了较大的提高，副产物降低，原料利用率有了很大提升，降低了成本，减少了能耗和环境污染。本发明还构建了青霉素G酰化酶突变体的四倍体表达盒重组菌，使产酶量显著提高，成本大大降低，节约了发酵产酶环节的原料、人员及时间成本。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌{Escherichia coli )ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含选自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、PD334E 中的任意一至八个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a NI IOQ氨基酸突变，以及选自 a D154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a D154E氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野 生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a N176Q氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a Q204N氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含β E85D氨基酸突变，以及选自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β K95R、β Q233N、PD334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含β K95R氨基酸突变，以及选自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β E85D, β Q233N、PD334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含β Q233N氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含β D334E氨基酸突变，以及选自 α NI 10Q、a D154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含aQ204N、β E85D氨基酸突变，以及选自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、β K95R、β Q233N、PD334E 中的任意一至六个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含aQ204N、β K95R氨基酸突变，以及选自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、β E85D, β Q233N、PD334E 中的任意一至六个氨基酸突变。·在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a N110Q、a Q204N、β E85D氨基酸突变，以及选自a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E中的任意一至
五个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a D154E、a Q204N、β E85D氨基酸突变，以及选自a NI 10Q、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E中的任意一至
五个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a Q204N、β E85D,β Q233N氨基酸突变，以及选自a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β K95R、β D334E中的任意一至
五个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a Q204N、β E85D,β D334E氨基酸突变，以及选自a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N中的任意一至
五个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a N110Q、a Q204N、β K95R氨基酸突变，以及选自a D154E、a N176Q、β E85D, β Q233N、β D334E中的任意一至
五个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a Q204N、β K95R、β Q233N氨基酸突变，以及选自a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β E85D、β D334E中的任意一至
五个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a D154E、a Q204N、3E85D、PQ233N氨基酸突变，以及选自aNllOQ、a N176Q、β K95R、PD334E中的任意一至四个氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a N110Q、a Q204N和i3K95R氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a D154E、a Q204N和3Q233N氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a N176Q、a Q204N和3D334E氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a N110Q、a Q204N、3K95R和PQ233N氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a N110Q、a Q204N、βΕ8 和PD334E氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a D154E、a Q204N、βΕ8 和PQ233N氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a N110Q、a Q204N、3E85D、PK95R和PD334E氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a D154E、a Q204N、β E85D、β Q233N 和 β D334E 氨基酸突变。在一个实施方案中，本发明提供了编码本文所述的青霉素G酰化酶突变体的核酸，且所述核酸包括根据简并性编码本文所述的青霉素G酰化酶突变体的核酸。编码SEQID N0.1所述的青霉素G酰化酶野生型的一种形式的核苷酸序列如SEQ ID N0.2中所述。在一个实施方案中，本发明提供了编码本文所述的青霉素G酰化酶突变体的核酸的表达载体。可以采用的表达载体包括所有含有必须表达元件的载体，如Novagen公司的原核表达ρΕΤ系列的卡那霉素抗性载体及Invitrogen公司的酵母表达载体ρΑ0815、PPIC3.5等。本发明所要保护的突变PGA基因的可采用载体不仅限于举例载体。在一个实施方案中，本发明提供了编码本文所述的青霉素G酰化酶突变体的核酸的表达载体，其中所述表达载体具有多于一个拷贝的表达盒，例如具有二、三或四个拷贝的表达盒，优选具有四个拷贝的表达盒。多拷贝表达盒的使用可在一定程度上提高酶活。在一个实施方案中，本发明提供了宿主细胞，其包含编码本文所述的青霉素G酰化酶突变体的核酸的表达载体。 宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。原核细胞优选选自细菌、放线菌等，更优选大肠杆菌{Escherichia coli),更进一步优选大肠杆菌BL21 (DE3)。真核细胞优选选自酵母细胞，更优选巴斯德毕赤酵母(Pichia,更进一步优选巴
斯德毕赤酵母GS115。所述表达载体可通过转化、转染或侵染等本领域公知方式导入宿主细胞。在一个实施方案中，本发明提供了本文所述的青霉素G酰化酶突变体用于催化6-APA和对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐(HPGM.HCl)反应合成阿莫西林的用途。在一个实施方案中，本发明提供了合成阿莫西林的方法，其采用本文所述的青霉素G酰化酶突变体催化6-APA和HPGM.HCl反应合成阿莫西林。除非本文另有定义，本发明使用的相关科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文所述的分子生物学、酶学及细胞生物学相关使用的命名以及技术，是本领域众所周知且普遍使用的那些。除非另有说明，下面的术语应当理解为具有下述含义:
如本文所用，“青霉素G酰化酶野生型”指埃希氏大肠杆菌coli)ATCCl1105的青霉素G酰化酶野`生型，其α、β链定义如下:从N端起始依次为:信号肽:26个氨基酸；α链:209个氨基酸；连接肽:54个氨基酸；β链:557个氨基酸。信号肽及连接肽在翻译后切除，由α链和β链组成有活性的青霉素G酰化酶。青霉素G酰化酶野生型的氨基酸序列如SEQ ID N0.1中所述，其一种形式的核苷酸序列如SEQ ID N0.2中所述，且包括根据简并性编码SEQ ID N0.1所述的青霉素G酰化酶野生型的核苷酸序列。如本文所用，“青霉素G酰化酶突变体”包含野生型多肽内的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失和/或添加，和/或野生型多肽中的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的置换。本文所用的“野生型”氨基酸序列包含自然出现的氨基酸序列。本文所用的“青霉素G酰化酶突变体”的具体突变的含义如下:aNllOQ为α链上第110位氨基酸N突变为Q、a D154E为α链上第154位氨基酸D突变为E、a N176Q为α链上第176位氨基酸N突变为Q、a Q204N为α链上第204位氨基酸Q突变为N、β E85D为β链上第85位氨基酸E突变为D、0K95R为β链上第95位氨基酸K突变为R、β Q233N为β链上第233位氨基酸Q突变为N、β D334E为β链上第334位氨基酸D突变为E (氨基酸名称和缩写见表I)。表1:氨基酸名称和缩写
名称I英文名称I三字母缩写I单字母缩f
甘氨酸Glycine_Gly_G_
丙氨酸AlanineAlaA
缴氨酸ValineValV
亮氨酸LeucineLeuL
异亮氨酸IsoleucineHeI
脑氨酸ProlineProP
苯丙氨酸PhenylalaninePheF
酪氨酸TyrosineTyrY
色氨酸TryptophanTrpW
丝氨酸SerineSerS
苏氨酸ThreonineThrT
半胱氨酸Cysteine_Cys_C_
蛋氨酸MethionineMetM
天冬醜胺AsparagineAsnN
权利要求
1.一种青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌(Mscherichia coli )ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含选自aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至八个氨基酸突变。
2.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aQ204N氨基酸突变，以及选自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。
3.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aQ204N、β E85D 氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至六个氨基酸突变。
4.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aQ204N、β K95R 氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β E85D、β Q233N、β D334E 中的任意一至六个氨基酸突变。
5.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aNllOQ、a Q204N、β E85D 氨基酸突变，以及选自 a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至五个氨基酸突变。
6.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aD154E、a Q204N、β E85D 氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至五个氨基酸突变。
7.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aQ204N、3E85D、PQ233N 氨基酸突 变，以及选自 aNllOQ、a D154E、a N176Q、β K95R、β D334E 中的任意一至五个氨基酸突变。
8.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aQ204N、β E85D、β D334E 氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N 中的任意一至五个氨基酸突变。
9.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aNllOQ、a Q204N、β K95R 氨基酸突变，以及选自 a D154E、a N176Q、β E85D、β Q233N、β D334E 中的任意一至五个氨基酸突变。
10.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aQ204N、β K95R, PQ233N 氨基酸突变，以及选自 aNllOQ、a D154E、a N176Q、β E85D、β D334E 中的任意一至五个氨基酸突变。
11.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aD154E、a Q204N、β E85D、β Q233N 氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a N176Q、β K95R、β D334E 中的任意一至四个氨基酸突变。
12.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aN110Q、aQ204N和0K95R氨基酸突变。
13.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aD154E、aQ204N和PQ233N氨基酸突变。
14.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aN176Q、aQ204N和PD334E氨基酸突变。
15.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aN110Q、a Q204N、β K95R和β Q233N的氨基酸突变。
16.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aN110Q、a Q204N、β E85D和β D334E的氨基酸突变。
17.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aD154E、a Q204N、β E85D和β Q233N的氨基酸突变。
18.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aD154E、a Q204N、β E85D、β Q233N 和 β D334E 的氨基酸突变。
19.一种编码权利要求1-18中任一项青霉素G酰化酶突变体的核酸。
20.—种包含权利要求19的核酸的表达载体。
21.根据权利要求20的表达载体,其特征在于,所述表达载体具有多于一个拷贝的表达盒。
22.根据权利要求20的表达载体，其特征在于，所述表达载体具有四个拷贝的表达盒。
23.—种包含权利要求20的表达载体的宿主细胞。
24.权利要求1-18中 任一项的青霉素G酰化酶突变体用于催化6-ΑΡΑ和HPGM.HCl反应合成阿莫西林的用途。
25.一种合成阿莫西林的方法，其特征在于，采用权利要求1-18中任一项的青霉素G酰化酶突变体催化6-ΑΡΑ和HPGM.HCl反应合成阿莫西林。
全文摘要
本发明涉及新的青霉素G酰化酶突变体，编码所述突变体的核酸，相关表达载体和宿主细胞以及所述突变体合成阿莫西林的用途。
文档编号C12N5/10GK103074320SQ20121016543
公开日2013年5月1日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者余允东, 王晓霞, 祝俊, 杨晓鹏, 吴清云, 吴会广, 马春艳 申请人:石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司