Masp－3,一种固定补体的酶,及其应用的制作方法

专利名称：Masp－3,一种固定补体的酶,及其应用的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及先天性免疫防御，以及与甘露聚糖结合型凝集素(MBL)有关的补体固定途径，其中所述MBL也称为甘露聚糖结合蛋白或甘露糖结合蛋白(MBP)。
背景技术：
补体系统包括一组复杂的对先天性以及适应性免疫防御1功能起重要作用的酶和非酶蛋白。迄今已知有两种活化模式，由抗体-抗原复合物引发的经典途径以及由微生物表面特定结构引发的替代途径。现已有对第三种，即不依赖抗体的补体活化新途径的描述2。当结合甘露聚糖的凝集素(MBL，最初被称为结合甘露聚糖的蛋白3，MBP，参见Ezekowitz，US专利申请5270199)与碳水化合物结合时引发此途径。
结构上MBL与补体的C1组分的C1q亚组分有关，似乎MBL通过称为MASP4或p1005的相连的丝氨酸蛋白酶活化此补体系统，其新的补体活化途径称为MBLectin途径。按照假设的此途径机理，MBL与多种微生物，包括细菌，酵母，寄生性原生动物，和病毒表面的特异性碳水化合物结构结合6，其抗微生物活性来自于对最终裂解性补体途径成分的活化7或启动吞噬作用8。
据报导，血浆中MBL含量可能是由遗传决定的9，10，11。MBL缺陷与儿童期，以及可能成年期，易于频繁受到多种微生物感染有关13，14。最近的信息将MBL缺陷与HIV感染，以及AIDS发病后更快地死亡联系在一起15，16。MBL与类风湿性关节炎患者中浓度升高的半乳糖苷型IgG(G0)结合，然后活化补体17。MBL缺陷也与复发性自发流产体质有关18，也与系统性红斑狼疮的发病有关19。
在首次临床重建试验(first clinical reconstitution trial)中，通过注射纯MBL表面上治愈了一位患有复发性感染的MBL缺陷的女婴20。有关MBL的最新评论，参见ref.6。
与MBL缺陷有关的相对高频率的MBL突变在所有研究人群中都有报导。该发现导致这样的假设在某些特定的情况下，MBL可能使个体对特定的细胞内感染因子易感，所述因子利用MBL得以到达靶组织21。由于MBL是补体系统强有力的活化剂，故也可能是通过微生物碳水化合物或内毒素不适当的活化导致破坏性炎症应答10。因此，一个群体因其中个体的MBL浓度范围的差异很大而使总存活率提高。
MASP-1(与MBL相连的丝氨酸蛋白酶1)是结构上与补体途径C1r和C1s近似的丝氨酸蛋白酶，它具有在胰蛋白酶和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶上发现的组氨酸环结构。已发现MASP-1参与MBL对补体的活化。已有报导编码MASP-1的cDNA克隆编码假定的19个氨基酸的前导肽以及其后预计形成成熟肽的680个氨基酸。
MASP-2(与MBL相连的丝氨酸蛋白酶2)22是结构上与补体途径C1r和C1s近似的丝氨酸蛋白酶。和这二者相同但与MASP-1相异，它不具有在胰蛋白酶和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶上发现的组氨酸环结构。已发现MASP-2参与MBL对补体的活化。
发明简述本发明涉及与凝集素相连的丝氨酸蛋白酶(MASP-3)的分离和鉴定。MASP-3表现出与以前报导的MASP(MASP-1和MASP-2)和两种与C1q相连的丝氨酸蛋白酶，C1r和C1s，有一定的同源性。
我们已经纯化了MASP-3并通过其与凝集素的联系，分子量，其部分氨基酸序列对其进行了鉴定。我们克隆了cDNA片段并对其碱基序列进行了确定，所述序列可以翻译为包含一些已测序肽的氨基酸序列。与MASP-1和MASP-2相似，MASP-3部分地与MBL共纯化，其可能参与介导MBL复合物的生物作用。
因此，本发明的一个方面描述了基本上纯的MASP-3多肽和编码所述多肽的核酸。优选地，所述MASP-3多肽保留了一或多个MASP-3功能，如能与甘露聚糖结合型凝集素(MBL)相连或/和具有丝氨酸蛋白酶活性，基本上纯的与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶-3(MASP-3)多肽，优选能与甘露聚糖结合型凝集素(MBL)相连的多肽。
本发明的又一方面是抗-MASP-3抗体的产生，所述抗体在建立MASP-3分析中的应用，以及这样的分析对确定与此蛋白表达过量或不足有关的临床症状，如为产生抗体而将权利要求1所述MASP-3多肽，或所述MASP-3多肽的一部分，或编码任意这样的多肽的DNA给予动物后所产生的抗体。
按照本发明，一些MASP-3多肽，如在结合分析中所用的那些，可与一种标记相偶联以便能在这样的分析中对它们的存在进行检测和/或定量。合适的标记包括能产生信号(如可见的吸收)的酶，荧光团，放射性核素等。其它MASP-3多肽能竞争性抑制MASP-3的某种活性，因此可用于评估MASP-3功能。其它MASP-3多肽可在如下生产抗体时用作抗原或半抗原。本发明还包括能竞争性抑制MASP-3活性的化合物。优选地，这样的化合物通过抑制MASP-3或其片段的丝氨酸蛋白酶活性来起作用。这样的化合物包括MASP-3或MBL的片段，它们可竞争性抑制对所述复合物功能至关重要的MBL-MASP-3的相互作用。
本发明此方面的具体的多肽包括a)分子量48k的多肽，其包括鉴定为SEQ ID NO3(IIGGRNAEPGLFPWQALIVV)的序列；b)分子量约为110k的多肽，其包含鉴定为SEQ ID NO3的序列；c)包括鉴定为SEQ ID NO4(WQALIVEDTSRVPNDKWFGSGALLSASWILTAAHVLRSQRRDTTVIPVSKEHVTVYL)的氨基酸序列的多肽；d)包含SEQ ID NO2，包括任意其功能性等价物的多肽；e)包含MASP-3的B链(对应SEQ ID NO2的435(Glu)到728(Arg)位残基)，包括任意其功能性等价物的多肽。
本发明的另一方面包括分离的核酸分子，其包含编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO1，SEQ ID NO1的编码部分，即以91位核苷酸(a)开始，以2277位核苷酸(a)结束的部分，以及SEQ ID NO5中任一序列有至少85％，例如至少90％，例如至少95％同一性的序列。
因此，本发明涉及编码本发明多肽的分离的核酸分子，所述分子包含编码多肽的核酸序列，所述多肽与SEQ ID NO1，2，3或5的序列至少具有50％的同一性。
本发明还包括编码上述MASP-3多肽的分离的核酸序列。这样的核酸序列可能包含在核酸载体(例如表达载体，包括具有调控核酸元件允许重组核酸在表达系统中表达的表达载体)中。
本发明还包括编码110kDa完整MASP-3蛋白的多肽的分离的核酸序列。这样的核酸序列可能包含在核酸载体(例如表达载体，包括具有调控核酸元件允许重组核酸在表达系统中表达的表达载体)中。
本发明还记述了选择性结合MASP-3的抗体。这样的抗体可由任何已知技术制备，例如多克隆和单克隆抗体技术。所述抗体可与包含可检测标记的化合物相偶联，这样就可用于，例如检测MASP-3的分析中。
所述多肽或抗体可被配制为药物组合物，并如下所述给药。
本发明还记述了检测MASP-3的方法。该方法包括得到生物样品；将该生物样品与MASP-3多肽特异性结合配偶体接触；检测所结合的复合物，如果有，作为该样品中MASP-3存在的指示。分析所用结合配偶体可以是抗体，或对MASP-3的分析可以测定固定补体的活性。这些对MASP-3的分析也可用于对生物样品中MASP-3或MASP-3活性的定量分析。所述结合配偶体之一可以是对MBL特异性的，这样就可以检测MBL/MASP-3复合物。
本发明中也包括了检测MASP-3核酸表达的方法。这些方法包括通过将样品与在严谨条件下同编码MASP-3全部或片段的核酸序列特异性杂交的核酸探针混合检测具有编码MASP-3多肽的序列的RNA。
本发明也记述了治疗MASP-3或MASP-3活性缺陷患者的方法。此方法通过给药患者MASP-3多肽或编码MASP-3的核酸而完成。因为有时需要抑制MASP-3活性，故本发明也包括抑制MASP-3活性的方法，该方法是给药患者抑制MASP-3的表达或活性的化合物。通过给药MASP-3反义核酸序列也可以对MASP-3活性进行抑制。
本发明记述了对编码MASP-3的核酸序列多态性的分析。对检测样品中MASP-3编码核酸的存在的方法要求了权利。例如，本发明方法可以包括将样品与至少一种核酸探针混合(所述探针能与编码MASP-3的核酸在严谨条件下形成复合物)，并测定所述探针是否与样品核酸结合。因此本发明包括能与MASP-3的编码核酸在严谨条件下形成复合物的核酸探针。
本发明记述了对包含MASP-3或其前体或MASP-3调控序列的多肽序列的多态性分析。
MASP-3分析可用于测定感染，炎症疾病和复发性自发流产等各种患者的MASP-3水平和MASP-3活性。MASP-3可用于治疗那些MASP-3功能未达最佳的感染，对MASP-3活性的抑制可用于调节MASP-3活性引起的炎症和负作用。
此外，本发明涉及本文定义的多肽在制备药物组合物中的用途。
“与凝集素相连的丝氨酸蛋白酶110”或“MASP-3”表示被称为“与凝集素相连的丝氨酸蛋白酶110”的多肽或活性，或具有与SEQ ID NO2基本上相同序列的任一其它多肽。
本文所用术语“蛋白”和“多肽”表示任何氨基酸，不考虑长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。因此，术语“MASP-3多肽”包括全长，天然的MASP-3蛋白，以及相应于全长天然MASP-3多肽的重组或合成得到的多肽，或天然蛋白的特定的结构域或部分。该术语也包含成熟MASP-3，其在氨基末端添加了甲硫氨酸(其对于在原核细胞中的表达有用)。
本文所用术语“纯化的”指当通过重组DNA技术产生时，基本上不含细胞物质，病毒物质或培养基的核酸或肽，当是化学合成时，不含化学前体或其它化合物。
“分离的核酸分子”指以任何方法从天然生物的基因组中分离的核酸分子。因此，术语“分离的核酸分子”包括并非天然存在的核酸分子，例如重组DNA技术产生的核酸分子。
术语“核酸分子”包括RNA和DNA，所述DNA包括cDNA，基因组DNA，和合成的(例如，化学合成的)DNA。如果是单链的，核酸可能是有义链或反义链。
术语“MBL/MASP复合物”包括MBL/MASP-1复合物，MBL/MASP-2复合物，MBL/MASP-3复合物，所述复合物还任选包括其它物质。例如“MBL/MASP-2复合物”也可包含其它物质。
本发明还包括核酸分子，所述核酸分子优选在严谨条件下与编码MASP-3多肽的核酸分子(例如具有编码SEQ ID NO3的序列的核酸分子，例如图5所示的cDNA序列，SEQ ID NO5(tggcaggccc tgatagtggt ggaggacacttcgagagtgc caaatgacaagtggtttggg agtggggccc tgctctctgc gtcctggatc ctcacagcagctcatgtgct gcgctcccag cgtagagaca ccacggtgat accagtctcc aaggagcatgtcaccgtctacctg))或编码全部MASP-3序列的全长cDNA的任一其它部分杂交。此外，本发明包含核酸分子，所述核酸分子优选在严谨条件下，与在克隆中具有MASP-3的编码cDNA的核酸分子杂交。优选能杂交的核酸分子由400，更优选200个核苷酸组成。
优选能杂交的核酸分子编码MASP-3所具有的活性，例如它们结合MBL(或另一种MASP-3配基)或能起丝氨酸蛋白酶作用。
本发明还记述了基本上纯的或分离的MASP-3多肽，优选对应MASP-3各种功能区的多肽，或其片段。本发明多肽包含基本上与图5所示序列相同，或基本上与全长MASP-3蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
本发明多肽还可以化学合成，通过重组技术合成，或按照标准的生物化学纯化方法从其天然表达组织中纯化。
本发明中还包括“功能性多肽”，其具有MASP-3的一或多种生物学功能或活性。这些功能或活性在说明书中有详述。如果功能性多肽可作为抗原生产特异性结合MASP-3或其片段(尤其是包含片段的决定簇)的抗体，则它也在本发明范围内。
所述功能性多肽可能包含对本文公开的序列加以修饰得到的一级氨基酸序列。优选这些修饰是本文所述的保守的氨基酸取代。所述多肽可以以设计为促进或延缓它们的代谢(提高它们的半衰期)的任何方法来取代。
本发明所用的保守氨基酸取代涉及一个氨基酸(在预定的氨基酸组中)被取代为另一个具有相似或基本上相似特性的氨基酸(在同一组内)。
本文所用“保守的氨基酸取代”是指在下述氨基酸组内一个氨基酸可以被另一氨基酸所取代，所述组的氨基酸具有i)极性侧链(Asp，Glu，Lys，Arg，His，Asn，Gln，Ser，Thr，Tyr，Cys)ii)非极性侧链(Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro，Met)iii)脂肪族侧链(Gly，Ala，Val，Leu，Ile)iV)环侧链(Phe，Tyr，Trp，His，Pro)v)芳香族侧链(Phe，Tyr，Trp)vi)酸性侧链(Asp，Glu)vii)碱性侧链(Lys，Arg，His)viii)酰胺侧链(Asn，Gln)ix)羟基侧链(Ser，Thr)x)含硫侧链(Cys，Met)，和，xi)单氨基-双羧酸或单氨基-单羧基-单酰胺羧酸形式的氨基酸(Asp，Glu，Asn，Gln)。
当所述氨基酸序列中有一个氨基酸被另一个所取代时，这样的取代可以是如上所述的保守氨基酸取代。本发明的MASP-3片段可包含一个以上的这样的取代，例如两个保守的氨基酸取代，如三或四个保守的氨基酸取代，如五或六个保守的氨基酸取代，如七或八个保守的氨基酸取代，如10到15个保守的氨基酸取代，如15到25个保守的氨基酸取代。取代可以在上述列出的一或多个预定的氨基酸组内进行。
氨基酸的添加或缺失可以是2到优选10个氨基酸的添加或缺失，例如2到8个氨基酸，例如2到6个氨基酸，例如2到4个氨基酸。但是，多于10个氨基酸的添加，如10到200个氨基酸的添加也包含在本发明之内。
因此应该理解本发明也涉及包含MASP-3(包括其任何变体和功能等价物)的至少一种片段的免疫原性组合物。
本发明的MASP-3片段，包括其任何变体和功能等价物，在一个实施方案中可以包括少于100个的氨基酸残基，如少于95个氨基酸残基，如少于90个氨基酸残基，如少于85个氨基酸残基，如少于80个氨基酸残基，如少于75个氨基酸残基，如少于70个氨基酸残基，如少于65个氨基酸残基，如少于60个氨基酸残基，如少于55个氨基酸残基，如少于50个氨基酸残基。
本发明所述功能等价在一优选实施方案中，是相对于预定的MASP-3片段(如包含或基本上由MASP-3的B链，或MASP-3全长序列组成)的功能性。
包含预定氨基酸序列的MASP-3片段的功能性等价物如上述定义。Geysen，US 5,595,915记述了一种在已知氨基酸序列中测定免疫原性氨基酸序列的方法，本文引入作为参考。
US6013478记述了确定肽片段的结构和功能关系的另一合适的方法，本文引入作为参考。
应理解随着插入，缺失和取代(包括保守取代)的数量和范围增加，MASP-3片段的功能等价物的氨基酸序列将越来越不同于优选的预定序列(包含或基本上由MASP-3 B链组成)。此不同可测定为在优选的预定序列和所述变体或功能等价物之间同源性的降低。
所有补体激活型MASP-3片段都包括在本发明范围之内，而不考虑它们与优选的MASP-3预定序列(包含MASP-3的B链)的同源程度。这是由于MASP-3的一些区很易于突变，或能够完全缺失而没有显著的生物学影响。
如果含有功能近似氨基酸侧链的残基被取代，取代得到的功能变体可以很好地表现出天然MASP-3活性的一些形式或程度，但同源性较低。此处功能近似是指侧链的主要特征，如疏水性，碱性，中性或酸性，或空间体积的存在与否。因此，在本发明的一个实施方案中，在i)能引发补体激活作用的给定的MASP-3片段和ii)优选的预定MASP-3片段之间的同一性程度不是该片段能否作为本发明优选的给定MASP-3片段的变体或功能等价物的主要衡量标准。
导致形成MASP-3功能等价片段的非保守取代可以i)在疏水性上显著不同，例如疏水残基(Val，Ile，Leu，Phe或Met)被取代为亲水性残基如Arg，Lys，Trp或Asn，或亲水性残基如Thr，Ser，His，Gln，Asn，Lys，Asp，Glu或Trp被取代为疏水残基；和/或ii)对多肽骨架走向有显著不同的影响，如Pro或Gly取代为其它残基或被其它残基取代；和/或iii)对所带电荷改变巨大，例如带负电残基如Glu或Asp被取代为带正电残基如Lys，His或Arg(反之亦然)；和/或iv)在空间体积方面改变巨大，例如体积大的残基如His，Trp，Phe或Tyr被取代为有较小侧链的残基，如Ala，Gly或Ser(反之亦然)。
本发明的另一实施方案涉及优选的预定的MASP-3片段的功能等价物，包括MASP-3的B链，其中所述等价物中取代的氨基酸的亲水或疏水(hydropathic)指数范围在被取代氨基酸值的+/-2.5之内，如+/-2.3之内，如+/-2.1之内，如+/-2.0之内，如+/-1.8之内，如+/-1.6之内，如+/-1.5之内，如+/-1.4之内，如+/-1.3之内，如+/-1.2之内，如+/-1.1之内，如+/-1.0之内，如+/-0.9之内，如+/-0.8之内，如+/-0.7之内，如+/-0.6之内，如+/-0.5之内，如+/-0.4之内，如+/-0.3之内，如+/-0.25之内，如+/-0.2之内。
在赋予蛋白相互作用的生物功能方面亲水性和疏水性氨基酸指数的重要性为本领域已知(Kyte&Doolittle，1982和Hopp，US 4554101，皆引入作为参考)。
此处所用氨基酸疏水指数为异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷胺酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)(Kyte&Doolittle，1982)。
氨基酸亲水性值为精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氮酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷胺酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)(US 4554101)。
在一个实施方案中氨基酸取代可基于它们的亲水性和疏水性值，氨基酸侧链取代基的相似性，包括电荷，尺寸等进行。考虑了前述各种特征的氨基酸取代为本领域所熟知，包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷胺酰胺和天冬酰胺；缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。
除本文所述肽基化合物外，可以配制空间特征相似的化合物以模仿所述肽结构的关键部分，这样的化合物也可以与本发明所述肽相同的方法使用。这可以本领域一般技术人员所知的建模和化学设计技术完成。例如，可以使用酯化作用和其它烷基化作用修饰如双精氨酸肽骨架的氨基末端，以模仿四肽结构。应理解的是所有这样的空间类似的构建物都在本发明范围之内。
N末端烷基化和C末端酯化的肽也包括在本发明之内。功能等价物也包括糖基化的以及与相同或不同MASP-3片段和/或MASP-3分子(包括二聚体或不相关的化学组分)形成的共价或聚集偶联物。按照本领域已知方法，这样的功能等价物可通过体内合成方法或通过对在片段内包括在N和/或C末端发现的基团的功能性连接制备。
包括本发明MASP-3片段的同型二聚体和异型二聚体等二聚体在内的MASP-3寡聚体也包括在本发明范围之内。MASP-3功能等价物和变体可以按同型二聚体或与其它氨基酸序列或与天然MASP-3序列形成的异型二聚体的形式制备。
本发明所用术语功能性MASP-3等价物，MASP-3变体和MASP-3衍生物涉及含给定的氨基酸序列的MASP-3片段的功能等价物，以及如下定义的等价物，衍生物和变体i)包含能被抗体识别的氨基酸序列的MASP-3或其片段，所述抗体也可识别给定的氨基酸序列，和/或ii)包含能与MBL途径的一种成分如MBL/MASP-2复合物结合的氨基酸序列的MASP-3或其片段，其中该成分也能与所述给定氨基酸序列结合，和/或
iii)具有与包含该给定氨基酸序列的MASP-3片段至少基本上相似的补体活化作用的MASP-3片段，例如当与MBL/MASP-2复合物结合时抑制C4的裂解。
目的多肽或其它化合物当与任何天然组成不同时为“基本上纯的”，它们适合于至少一种本发明所述的用途。尽管与天然物质相比稍有改变的制剂有一定程度的用途，更常见的是，所述制剂的重量的至少10％(干重)是目的化合物。优选所述制剂的重量的至少60％，更优选至少75％，最优选至少90％是目的化合物。可采用任何适合的标准方法测定纯度，例如通过柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或HPLC分析。
如果一种多肽或核酸分子的序列与参照多肽或核酸分子的序列有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，98％，或99％是相同的，则所述多肽或核酸分子与参照多肽或核酸分子“基本上相同”。
当称特定的多肽与限定长度的参考多肽有特定的同一性百分比时，所述同一性百分比是相对于参考多肽的。因此，与具有100个氨基酸的参考多肽50％相同的肽可以是一种有50个氨基酸的多肽，它与该参考多肽中长约50个氨基酸的部分完全相同。它也可以是100个氨基酸长的多肽，它与参考多肽的全长作对比有50％相同。当然，许多其它多肽也会符合同样的标准。
当多肽序列与参考序列同一性小于100％时，其中的不相同部分是对参考序列进行保守取代时的优选位点，但非必需位点。典型的保守取代包括下列组中的取代甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷胺酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。
对于多肽，参考多肽序列的长度一般至少是16个氨基酸，优选至少20个氨基酸，更优选至少25个氨基酸，最优选至少35个氨基酸，50个氨基酸，或100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度一般至少是50个核苷酸，优选至少60个核苷酸，更优选至少75个核苷酸，最优选100个核苷酸或300个核苷酸。
可采用序列分析软件(例如，遗传计算机组的序列分析软件包，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 UniversityAvenue，Madison，Wi 53705)，按照其中指示的缺省参数设定进行序列同一性测定。
本发明的核酸分子可以如下所述插入到载体中，这会有利于插入子的表达。所述核酸分子和它们编码的所述多肽可以直接用作诊断或治疗试剂，或可以用于(如果是多肽可以直接，或如果是核酸分子则间接)产生抗体，这些抗体在临床用作治疗或诊断试剂。因此，包含本发明核酸的载体，用这些载体转染的细胞，表达的多肽，和对全长多肽或其抗原性片段产生的抗体都属于优选的实施方案。
本发明还涉及特异性结合MASP-3的抗体，例如单克隆或多克隆，以及工程化抗体。“特异性结合”是指一种识别并结合特定的抗原，例如本发明的MASP-3多肽的抗体，但它基本上不识别或结合样品中的其它分子，所述样品例如为含有MASP-3的生物样品。与包含可检测标记的化合物相偶联的抗体(或其片段)的构建体包括由任何技术，包括化学方法或重组技术制备的构建体。
本发明还涉及能分别抑制或增强MASP-3的一或多种功能或活性的拮抗剂和激动剂。适合的拮抗剂包括小分子(即分子量低于约500的分子)，大分子(即分子量高于约500的分子)，结合并“中和”MASP-3的抗体(如下所述)，与MASP-3的天然形式竞争对蛋白(如MBL)的结合的多肽，能干扰MASP-3转录的核酸分子(例如，反义核酸分子和核酶)。MASP-3激动剂也包括小分子和大分子，以及除“中和”抗体以外的抗体。
本发明还涉及能提高或降低MASP-3表达的分子(例如通过影响转录或翻译)。小分子(即分子量低于约500的分子)，大分子(即分子量高于约500的分子)，以及能抑制MASP-3表达的核酸分子(例如反义和核酶分子)或增强它们的表达的核酸分子(例如将编码MASP-3的核酸序列置于强启动子系统控制之下的表达构建体)，表达MASP-3转基因的转基因动物。
本发明包含治疗与MASP-3的表达或活性异常有关的疾病的方法。因此，本发明包括治疗与MASP-3的表达或活性过度相关的疾病的方法。这样的方法需要给药能降低MASP-3表达或活性的化合物。本发明还包括治疗与MASP-3表达不足有关的疾病的方法。这些方法需要给药能提高MASP-3表达或活性的化合物。
“竞争性抑制”丝氨酸蛋白酶活性是指，例如改型MBL或其片段可逆或不可逆地结合MASP-3肽，但不活化或中和丝氨酸蛋白酶活性。相反地，MASP-3的片段，例如包含MASP-3的N末端部分的多肽可竞争性抑制完整MASP-3的结合并因此有效抑制MASP-3的活化。
本发明还涉及检测MASP-3多肽的方法。这样的方法包括获得生物样品；在允许特异性结合的条件下，将样品与特异性结合MASP-3的抗体接触；并检测任何形成的抗体-MASP-3复合物。
此外，本发明包括对与MASP-3表达或活性异常相关的疾病进行诊断性评价，分型，预后的方法和组合物。例如，本发明的核酸分子可用作诊断性杂交探针用于检测，例如MASP-3的异常表达或MASP-3基因的突变。这样的方法可用于按照MASP-3表达水平将细胞分类。
备选地，核酸分子可在用于鉴定MASP-3基因中的基因突变，等位基因变异和调控缺陷(regulatory defect)的诊断性PCR分析中作为引物。本发明还提供了实施这些方法的诊断试剂盒。
本发明涉及通过在所选化合物存在或不存在的情况下评价MASP-3的表达或活性来鉴定调节MASP-3表达或活性的化合物的方法。在所选化合物存在或不存在的情况下MASP-3表达水平或活性的差异表明所选化合物能调节MASP-3的表达或活性。可采用本领域技术人员所熟知的技术通过评价基因表达水平(例如通过测定mRNA)或蛋白表达水平来评价表达。可以功能性地评价MASP-3的活性，即通过分析所述化合物的酶活性。
下述实施例中记述了优选的方法和材料，它们用于说明，而非限制本发明。本领域技术人员能识别与本文所述类似或等同，并也可用于实施或检验本发明的方法和材料。
除非另有说明，本文所用所有的技术和科学术语都与本发明所属领域一般技术人员所理解的含义相同。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可用于实施或检验本发明，本文记述了优选的方法和材料。本文提到的所有出版物，专利申请，专利，其它文献皆全文引入作为参考。如果有冲突，以本说明书，包括定义，为准。此外，材料，方法和实施例都只是为了说明而非限制本发明。
从详细说明和权利要求中可以明显发现本发明的其它特点和优势。


图1是经蔗糖亲和层析纯化并用抗-pMASP-3抗体显影的人血浆蛋白的蛋白质印迹图。泳道1代表电泳前被还原的样品，而泳道2是在非还原条件下进行电泳的结果。箭头指示48kDa(还原的)和110kDa(非还原的)MASP-3带的位置。
图2表示的结果说明在MBL和MASP-3间形成的复合物。凝集素制剂在用单克隆抗-MBL抗体，单克隆抗-MASP-1抗体包被的孔中，或作为阴性对照的用同一亚类的非特异性单克隆免疫球蛋白包被的孔中温育。既在含钙缓冲液又在含EDTA缓冲液中稀释凝集素制剂。洗脱被抗体捕获的蛋白，经非还原条件下的SDS-PAGE/蛋白质印迹法进行分析。该印迹用抗-MASP-3抗体显影。泳道1表示未分级的凝集素制剂。泳道2和3代表来自包被了非有义IgG并与凝集素制剂温育的洗脱物(泳道2是在钙的存在下，泳道3是在EDTA存在下)，泳道4和5代表来自包被了单克隆抗-MASP-1抗体并与凝集素制剂温育的洗脱物(泳道4是在钙的存在下，泳道5是在EDTA存在下)，泳道6和7代表来自包被了单克隆抗-MBL抗体并与凝集素制剂温育的孔的洗脱液(泳道6是在钙的存在下，泳道7是在EDTA存在下)。图中指明了110kDa MASP-3带的位置。
图3是用甘露糖-TSK珠从MBL-缺陷型血清(泳道1，还原型；泳道2，非还原型)，或从加入了无MASP的MBL的MBL缺陷型血清(泳道3，还原型；泳道4，非还原型)中纯化的人血浆蛋白的蛋白质印迹图。用大鼠抗-pMASP-3抗体然后用HRP标记的抗-大鼠IgG抗体使蛋白质印迹显影。
图4表示得自48kDa MASP-3带的N末端部分和得自48kDa MASP-3带的肽的氨基酸序列。
图5表示肝cDNA的PCR产物中编码MASP-3的DNA序列和推定的部分氨基酸序列。
图6表示了MASP-3的已知氨基酸序列与MASP-222，MASP-123，24，C1r25，26和C1s27，28的序列的比对。在所有四种序列中相同的残基以星号标出。
图7.a，甘露聚糖-Sepharose亲和层析纯化的MBL复合物的双向SDS-PAGE蛋白质印迹。第一方向(水平)在非还原条件下展开。将泳道还原并在第二方向展开。将凝胶印迹并用抗42k蛋白N末端肽的抗体显影。制备第二方向凝胶其带有为MBL复合物的还原样品单独准备的孔(泳道R)，这样可以显示标准的单向电泳后的模式。指示了Mr标记的位置。b，MASP-3与MBL的连接。用等体积TBS稀释的血清样品(100μl)温育在包被了单克隆抗MBL抗体的微滴板的孔中，用100μl SDS样品缓冲液洗脱10个相同的孔19，采用抗42k蛋白N末端肽的抗体通过SDS-PAGE蛋白质印迹法检测。所述样品是A，含有MBL 2μg/ml的正常血清；B，纯化的MBL29(1μg)；D和F，两种MBL缺陷型血清(MBL浓度20ng/ml)；C和E，MBL同样两种添加了2μg/ml的MBL缺陷型血清。
图8.MBL复合物的分级分离。a，蔗糖梯度离心表明每种级分的C4活化能力以及MBL含量。指出了7S IgG和19S IgM的位置。b，用抗MBL抗体显影所述级分的SDS-PAGE蛋白质印迹，c，用抗MASP-1抗体22，d，用抗MASP-2抗体29，e，用抗MASP-3抗体，f，用与MAp19反应的抗MASP-2抗体，g，来自离子交换层析级分中的MBL，h，同样这些级分的C3活化能力(标示了泳道4和5中的C3α’链)。
图9.MASP-3对MBL复合物活化C4的抑制活性。a，在加入到甘露聚糖包被的微孔之前，rMASP-3的稀释液(空心圆)或对照(实心圆)与天然MBL复合物温育2h。进一步在4℃温育过夜后，洗涤孔，加入C4，37℃下温育2小时。用Eu标记的抗C4抗体定量活化的结合型C4。从基于MBL复合物的稀释液的标准曲线读取活性(％)。b，rMASP-230与rMBL(待公开)和rMASP-3的稀释液(空心圆)或对照(实心圆)混合，温育，然后加入到甘露聚糖包被的孔中，再如a.所述进行处理。在所示实验(a和b)中，所用rMASP-3为转染细胞的培养上清液的形式，采用伪(sham)转染的细胞的上清液作为对照。通过离子交换层析纯化的rMASP-3得到相同的结果。
图10.a，推出的MASP-3 B链的氨基酸序列。所述序列(第三和第四行)与人MASP-1(NM001879)和MASP-2(Y09926)B链(以上两行)进行比对，还与鲨鱼(AB009074)和鲤鱼(AB009073)的MASP-3 B链以及猪MASP-3的部分序列(AW414970)(以下的行)比对。*)相同的残基)保守的取代，.)半保守取代。所述比对采用BLOSUM G2(缺口存在罚分(gap existence cost)11，残基缺口罚分为1，lambda比例为0.85)。比对的半胱氨酸被框起来。MASP-1的组氨酸环中的半胱氨酸以阴影表示。三个N糖基化位点以粗体表示。b，编码MASP-1和MASP-3的外显子的基因组排列。c，MASP-1和MASP-3的mRNA中蛋白编码区的对比。
发明详述MASP-3核酸分子本发明的MASP-3核酸分子可以是cDNA，基因组DNA，合成的DNA，或RNA，也可以是双链或单链(即，有义或反义链)。这些分子的片段也包括在本发明范围内，并可以通过，例如聚合酶链式反应(PCR)产生，或通过用一或多种限制性内切酶处理产生。核糖核酸分子(RNA)可通过体外转录产生。优选的，所述核酸分子编码的多肽，无论长短，在正常生理条件下是可溶的。
本发明的核酸分子可包含天然的序列，或与天然序列不同，但是由于遗传密码的简并性而编码相同多肽的序列(例如，SEQ ID NO5的多肽)。此外，这些核酸分子并不限于只编码多肽的序列，因此，可以包括位于编码序列上游或下游的部分或者全部非编码序列。
在本发明的优选实施方案中，本发明涉及编码本文所述多肽的分离的核酸分子，该分子包含编码多肽的核酸序列，所述多肽序列与SEQ ID NO1，2，3或5有至少50％的同一性。所述多肽优选是与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶-3(MASP-3)，其具有的多肽序列与SEQ ID NO5有至少85％的同一性。
因此，该分离的核酸序列优选编码与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶-3(MASP-3)，所述核酸序列与SEQ ID NO4至少有85％的同一性。
本发明的核酸分子可以合成得到(例如，通过基于亚磷酰胺的合成)或得自生物细胞，如哺乳动物细胞。因此，所述核酸分子可以来自于人，小鼠，大鼠，豚鼠，牛，绵羊，马，猪，兔，猴，狗，或猫。本发明也包括这些类型核酸中核苷酸的组合或修饰。
此外，本发明的分离的核酸分子包括未在自然状态下发现的片段。因此本发明包括重组分子，如那些其中一个核酸分子(例如，编码MASP-3的分离的核酸分子)整合入载体(例如，质粒或病毒载体)或异源细胞的基因组(或同源细胞的基因组，位置与其在天然染色体中的位置不同)中的分子。重组核酸分子及其应用将在下文进一步讨论。
如果本发明所述核酸分子编码或起反义分子作用，它们可被用于，例如，调节MASP-3的翻译。与核酸表达的检测或调控相关的技术为本领域一般技术人员所熟知，并可以被用于诊断和/或治疗与MASP-3活性相关的疾病。这些核酸分子在后面它们的临床应用部分再进行讨论。
本发明还包含在严谨条件下与编码MASP-3多肽的核酸分子杂交的核酸分子。本文所述cDNA序列(SEQ ID NO3)可用于鉴定这些核酸，其包括例如，在其它种属中编码同源多肽的核酸，以及人或其它哺乳动物的MASP-3基因的剪接变体。因此，本发明涉及检测和分离这些核酸分子的方法。
采用这些方法，将样品(例如，核酸文库，如cDNA或基因组文库)用MASP-3特异性探针(例如，SEQ ID NO5的至少12个核苷酸长的片段)进行接触(或“筛选”)。所述探针选择性地与编码相关多肽的核酸(或与其互补序列)杂交。因为MASP-3编码的多肽与其它丝氨酸蛋白酶有关，术语“选择性杂交”用于表示这样的情况，其中一种探针与编码MASP-3的核酸(或与其互补序列)结合的可检测程度大于与编码其它丝氨酸蛋白酶的核酸(或与其互补序列)的结合。所述探针包含至少12(例如15，25，50，100或200个核苷酸)个核苷酸，其可通过任何标准方法生产(参见，例如，Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology，Vol.l，”Green Publishingassociateds，Inc.，NY，1989)。例如，所述探针能通过PCR扩增技术产生，其中可使用寡核苷酸引物扩增MASP-3特异性核酸序列(例如，编码成熟MASP-3的N末端的核酸)，该序列可用作筛选核酸的探针，并因此可检测与该探针杂交的核酸分子(在文库内)。
一个单链核酸与另一个之间形成双链体(duplex)，则称第一个与另一个杂交。此情况发生在当一个核酸包含另一个的相反或互补序列时(此相同的排列产生基因组中DNA的有义和反义链间天然的相互作用，成为“双螺旋”构型的基础)。形成双链体并不需要杂交区之间的完全互补；只需要在所用的杂交条件下成对碱基的数量足够保持该双链体。
一方面，本发明涉及能与编码MASP-3的核酸在严谨条件下形成复合物的核酸探针，如能与相同于SEQ ID NO5的核酸序列杂交的序列。
所述可杂交的探针可以是编码MASP-3的核酸序列的反义核酸。
通常，杂交条件具有低到中等严谨度。这些条件有利于完全互补序列间的特异性相互作用，但也能允许不完全互补的序列间发生一些非特异性相互作用。杂交后，在中度或高度严谨条件下“洗涤”核酸，使依靠非特异性相互作用连接在一起的双链体解离(形成这些双链体的核酸因此不是完全互补)。
如本领域所知，最佳洗涤条件可根据经验确定，经常是通过逐渐提高严谨度来确定。改变后能影响严谨度的参数主要包括温度和盐浓度。通常，盐浓度越低和温度越高，严谨度越高。洗涤可以低温开始(例如室温)，采用的溶液中的盐浓度等于或低于杂交溶液的盐浓度。随后的洗涤可采用具有同样的盐浓度，但温度逐渐升高的溶液进行。作为替代，可以在洗涤步骤中降低所述盐浓度但保持温度不变，或盐浓度降低的同时提高温度。也可以改变其它的参数。例如，使用去稳定剂，如甲酰胺，改变严谨条件。
在核酸进行杂交的反应中，为达到给定严谨水平的所用条件将有不同。没有一组条件，例如能允许在所有相互之间有85％同一性的核酸间形成双链体；杂交也有赖于每一核酸的独特特点。序列的长度，序列的组成(例如，嘌呤样核苷酸的含量与嘧啶样核苷酸含量的比)以及核酸的类型(例如DNA或RNA)都会影响杂交。还需考虑的是核酸之一是否被固定了(例如固定在滤膜上)。
从较低到较高严谨条件渐变的例子如下所述，盐含量以SSC(含有氯化钠和柠檬酸钠的盐溶液；2×SSC比0.2×SSC多浓缩10倍)的相对丰度给出。核酸在42℃，2×SSC/0.1％SDS(十二烷基磺酸钠，一种去污剂)中杂交，然后在0.2×SSC/0.1％SDS中于室温下洗涤(指低度严谨条件)；0.2×SSC/0.1％SDS于42℃下洗涤(指中度严谨条件)；0.1×SSC于68℃下洗涤(指高度严谨条件)。可以只采用给定的条件之一进行洗涤，或者每一条件都采用(例如，按照上面列出的次序每一条件下洗涤10-15分钟)。任一或全部所述洗涤都可以重复。如上所述，最佳条件会不同，能根据经验确定。
被认为是“严谨条件”的第二组条件中，杂交在50℃下于Church缓冲液(7％SDS，0.5％NaHPO4，1M EDTA，1％牛血清白蛋白)中进行，并在50℃下在2×SSC中洗涤。
一旦有了检测结果，所述核酸分子可根据若干标准方法中的任一标准方法分离(参见，例如，Sambrook等，“Molecular Cloning，A LaboratoryManual，”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
本发明还包括(a)表达载体，其包含任何前述的MASP-3相关的编码序列和/或它们的互补体(即，“反义”序列)；(b)表达载体，其包括与调控元件(下面给出例子)操纵相连的任一前述MASP-3相关的编码序列，所述调控元件指导编码序列的表达；(c)表达载体，除编码MASP-3多肽的序列外，其包含与编码MASP-3的核酸序列无关的核酸序列，例如编码报告分子或标记物的分子；(d)基因工程宿主细胞，其包含任一前述的表达载体，并从而在宿主细胞中表达本发明的核酸分子。
重组核酸分子包括编码可溶性MASP-3，成熟MASP-3，具有信号序列的MASP-3，或MASP-3的功能区如丝氨酸蛋白酶区，EGF区，或MBL结合区的序列。全长MASP-3多肽，MASP-3结构域，或其片段可与其它的多肽融合，如下所述。类似地，本发明的核酸分子可编码MASP-3的成熟形式或编码利于分泌的多肽的形式。在后面的例子中，所述多肽一般指前蛋白(proprotein)，其可以通过，例如在宿主细胞内去掉信号序列而转化为活化形式。前蛋白可以通过去掉不活化的序列而转化为蛋白的活化形式。
上面所指的调控元件包括，但不限于，诱导型启动子和非诱导型启动子，增强子，操纵子和其它元件，这些为本领域所熟知，它们驱动或者调控基因表达。这样的调控元件包括但不限于细胞巨化病毒hCMV立即早期基因，SV40腺病毒的早期或晚期启动子，lac系统，trp系统，TAC系统，TRC系统，大操作子(major operator)和噬菌体A的启动子区，fd包被(coat)蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸激酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子，酵母配对因子(yeast-mating factor)的启动子。
类似地，所述核酸能形成杂合基因的一部分，所述杂合基因还编码其它多肽序列。例如，起标记或报告基因作用的序列。标记或报告基因的例子包括内酰胺酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，腺苷脱氨酶(ADA)，氨基糖苷磷酸转移酶(neo4，G418r)，二氢叶酸还原酶(DHFR)，潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)，胸苷激酶(TK)，lacZ(编码半乳糖苷酶)，绿色荧光蛋白(GFP)，黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。采用许多与本发明实施有关的标准方法，本领域一般技术人员将了解其它有用的试剂，例如，其它能作为标记或报告基因的序列。通常，杂合多肽将包括第一部分和第二部分；第一部分是MASP-3多肽，第二部分是，例如，上述的报告基因或免疫球蛋白恒定区。
可用于本发明目的的表达系统包括，但不限于，所述微生物用包含本发明核酸分子的重组噬菌体DNA，质粒DNA，或粘粒DNA表达载体转化；用包含本发明核酸分子(优选包含MASP-3的核酸序列(SEQ ID NO5))的重组酵母表达载体转化的酵母(例如糖酵母属和毕赤氏酵母属)；用包含本发明核酸分子的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含MASP-3核苷酸序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)分别感染或转化的植物细胞系统；或载有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS，CHO，BHK，293，VERO，HeLa，MDCK，WI38，和NIH3T3细胞)，所述构建体包含得自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或得自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子和痘苗病毒7.5k启动子)。
在细菌系统中，根据所表达的基因产物的用途挑选几种表达载体。例如，当需要大量产生这样的蛋白，以获得包含MASP-3多肽的药物组合物或产生针对这些多肽的抗体时，需要能指导融合蛋白产物高水平表达的载体，所述产物是易于纯化得到的。这样的载体包括，但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.21791，1983)，其中插入子的编码序列可分别与lacZ编码区连接在载体中同一阅读框内，这样产生了融合蛋白；pIN载体(Inouye和I，Nucleic Acids Res.133101-3109，1985；Van Heek和Schuster，J.Biol.Chem.2645503-5509，1989)；等等。pGEX载体也可用于表达与谷胱甘肽S-转移酶(GST)形成融合蛋白的外来多肽。通常，这样的融合蛋白是可溶的，并能通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠，然后在游离谷胱甘肽存在下进行洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化得到。将所述pGEX载体设计为包含凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，以便克隆的靶基因产物可从GST组分上释放。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可用作表达外源基因的载体。所述病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中培养。所述插入子的编码序列可以各自克隆到该病毒的非必要区(例如多角体蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的调控下。编码序列的成功插入会导致多角体蛋白基因的失活，以及产生非包含体重组病毒(即缺少多角体蛋白基因编码的蛋白性外壳的病毒)。然后将这些重组病毒用于感染草地夜蛾细胞，插入的基因已在这些细胞中表达。(例如，参见Smith等，J.Virol.45584，1983；Smith，US 4215051)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用多种基于病毒的表达系统。如果腺病毒用作表达载体，本发明的核酸分子可与腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列连接。然后通过体外或体内重组，将此嵌合基因插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必要区(例如E1或E3区)的插入产生有活力并能在感染的宿主中表达MASP-3基因产物的重组病毒(例如参见Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-3659，1984)。插入的核酸分子的有效翻译可能还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。如果完整基因或cDNA，包括其本身的起始密码子和相邻序列，被插入到适合的表达载体，则不需要其它的翻译控制信号。但是，如果只插入编码序列的一部分，必须提供外源翻译控制信号，包括，也许是，ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与所要编码的序列在同一阅读框内，以确保完整插入子的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的，可以是天然的和合成的。通过包含适当的转录增强子元件，转录终止子等，可以增强表达的效率。(参见Bittner等，Methods in Enzymol.153516-544，1987)。
此外，可以挑选能调控插入序列的表达，或以所期望的具体形式修饰并加工基因产物的宿主细胞菌株。这样的蛋白产物修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白的功能是重要的。对于蛋白和基因产物翻译后的加工和修饰，不同的宿主细胞具有各自的特点和特定的机理。可以挑选合适的细胞条或宿主系统以确保待表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此目的，可以使用具有正确加工初级转录物，使基因产物糖基化和磷酸化所需的细胞结构的真核宿主细胞。上述哺乳动物细胞类型可以用作合适的宿主细胞。
为了长期高产率地获得重组蛋白，优选稳定的表达。例如，可以工程化获得如上所述的稳定表达MASP-3序列的细胞系。不使用含有病毒复制起点的病毒载体，而用由合适的表达调控元件(例如，启动子，增强子序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)调控的DNA和选择性标记转化宿主细胞。在引入外源DNA后，使工程化的细胞在富集培养基中培养1-2天，然后换为选择性培养基。重组质粒中的选择性标记赋予对此种选择的抗性，使细胞将质粒稳定整合于它们的染色体中，并生长形成转化灶(foci)，其反过来能被克隆并在细胞系中扩展。可利用此方法改造表达MASP-3的细胞系。这样改造的细胞系尤其适用于筛选和评价能影响基因产物的内源活性的化合物，以及生产用于治疗用途的MASP-3。为实验或医疗目的，这些方法也可用于改造引入宿主生物的细胞。这些引入的细胞可以暂时或永久地存在宿主生物中。
可以使用几种选择系统。例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，等，Cell 11223，1977)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026，1962)，以及腺苷磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell 22817，1980)基因可分别在tk-，hgprt-或aprt-细胞中应用。同样，抗代谢物抗性可用作选择下列基因的基础dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA773567，1980；O’Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527，1981)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072，1981)；neo，其赋予对氨基糖苷G418的抗性(Colberre-Garapindeng，J.Mol.Biol.1501，1981)；hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，Gene 30147，1984)。
备选地，任何融合蛋白可容易地利用对被表达的融合蛋白具有特异性的抗体来纯化。例如，Janknecht等所述系统可以容易地纯化在人细胞系中表达的非变性融合蛋白(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888972-8976，1991)。在此系统中，目的基因被亚克隆到痘苗病毒重组质粒，以便该基因的开放读码框与由六个组氨酸残基组成的氨基末端标签融合并一起被翻译。重组痘苗病毒感染细胞的提取物上柱到Ni2+.次氮基乙酸(nitriloacetic acid)-琼脂糖柱，用含咪唑的缓冲液选择性洗脱被组氨酸标记的蛋白。
MASP-3多肽本文所述MASP-3多肽是由如上所述任一核酸分子编码的那些，包括MASP-3片段，突变体，截短形式，以及融合蛋白。这些多肽可被制备用于多种用途，包括但不限于，产生用作诊断分析试剂的抗体，用于鉴定其它可调节MBLectin应答的细胞基因产物或化合物，和作为可用于治疗与MBLectin途径的活性有关的炎症和某些疾病(如下所述)的药剂。优选的多肽是基本上纯的MASP-3多肽，包括对应于具有完整信号序列的多肽，人MASP-3多肽的成熟形式的多肽，以及代表MASP-3多肽的一部分的多肽的那些。特别优选的是在正常生理条件下可溶的多肽。
具体地，本发明涉及多肽，所述多肽包含鉴定为SEQ ID NO 5的氨基酸序列或SEQ ID NO 5的功能等价物，和/或鉴定为SEQ ID NO 1的氨基酸序列或SEQ ID NO 1的功能等价物，和/或鉴定为SEQ ID NO 2的氨基酸序列或SEQ ID NO 2的功能等价物，和/或鉴定为SEQ ID NO 3的氨基酸序列或SEQ ID NO 3的功能等价物。
在一个实施方案中，所述多肽可限定为在非还原条件下的SDS-PAGE中具有约110kDa分子量的多肽，如包含鉴定为SEQ ID NO 5的序列的所述多肽。
在另一个实施方案中，所述多肽可定义为在还原条件下的SDS-PAGE中具有约48kDa分子量的多肽，如包含鉴定为SEQ ID NO 5的序列的多肽。
本发明还包括功能等价于MASP-3的多肽。这些多肽在生物系统中能发挥MASP-3的一或多种功能，在这些方面它们等价于MASP-3。优选的MASP-3多肽具有全长，成熟人型MASP-3的活性的20％，40％，50％，75％，80％，或甚至90％。这样的对比通常是基于生物活性分析，其中采用相同浓度的多肽进行对比。这样的对比也基于要达到可能的最大活性的50％所需的多肽的量。
功能性等价蛋白可以是，例如，含有添加或取代的氨基酸残基的蛋白。取代是基于相关残基在极性，电荷，溶解性，疏水性，亲水性，和/或两亲性方面的相似。在本发明简述中具体给出了通常用于保守取代另一氨基酸的氨基酸。可引入D-氨基酸以改变所述多肽的半衰期。
可以采用本领域所熟知的随机诱变技术制备与MASP-3功能等价的多肽(例如SEQ ID NO5)(并可检测所得MASP-3突变蛋白的活性)。这样的多肽更可能通过定点诱变来产生(也是采用本领域所熟知的技术)。这些多肽的功能可能得到了提高，例如更高的激活MBLectin途径的活性。这样的多肽可用于增强MBLectin途径的免疫功能。
为设计功能等价多肽，需要区分保守位置和可变位置。这可以通过对得自不同生物的MASP-3 cDNA序列进行比对来完成。本领域技术人员将会认识到保守的氨基酸残基更有可能是保留功能所需要的。因此，优选不改变保守残基。这样的保守残基可以是在丝氨酸蛋白酶区形成所谓催化三联体(catalytic triad)的三个氨基酸(SEQ ID NO 5的His-497，ASP-553，Ser-664)。
可在MASP-3编码序列内进行突变以产生更适合在所选宿主细胞内表达的MASP-3多肽。糖基化序列的引入也可以用于产生具有改变的生物特性的MASP-3多肽。
本发明还涉及分析包含MASP-3或其前体的多肽序列的多态性方法。这可以用多种技术完成。例如，将纯化的多肽进行胰蛋白酶消化，通过单向或双向电泳来对所得片段进行分析。样品多肽分析结果与采用已知序列得到的结果相对比。同样此分析可包含单向或双向电泳对生物样品(例如血清或其它体液)进行分离，接着再将分离的蛋白转移到印迹膜上(蛋白质印迹)。这样的印迹膜再与抗MASP-3抗体反应，然后与第二标记抗体反应。染色模式与采用含有已知序列或改变的样品所得结果对比。
本发明多肽可以被表达为与另一多肽，如标记多肽或融合配偶体的融合体。例如，所述多肽可以与6-组氨酸标签融合以利于对细菌中表达的蛋白的纯化，或与血凝素标签融合以利于在真核细胞中表达的蛋白的纯化。本发明的MASP-3多肽，或其一部分可与免疫球蛋白Fc区融合而改变，以使之具有更长的循环半衰期(Capon等，Nature 337525-531，1989)。类似地，可以产生MASP-3多肽的二聚体形式，其在体内具有更高的稳定性。
为将所述多肽用于诊断目的，所述多肽可与标记或毒素相偶联。
因此，本发明还提供了带有可检测标记的，固定化的和毒素偶联型的多肽，抗体及其片段。借助本领域熟知技术，所述抗体可采用放射性标记，荧光标记，酶标记，自由基标记，亲和素-生物素标记，或噬菌体标记(Chard，Laboratory Techniques in Biology，“An Introduction to Radioirnmunoassay andRelated Techniques，”North Holland Publishing Company(1978))。
典型的荧光标记包括异硫氰酸荧光素，罗丹明，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，荧光胺。
典型的化学发光化合物包括鲁米诺，异鲁米诺，芳香吖啶酯，咪唑，和草酸酯。
典型的生物发光化合物包括萤光素，荧光素酶。典型的酶包括碱性磷酸酶，B-半乳糖苷酶，葡糖-6-磷酸脱氢酶，马来酸脱氢酶，葡糖氧化酶，和过氧化物酶。
本发明多肽可以化学合成(例如参见Creighton，“ProteinStruncture andMoleculare Principles，”W.H.Freeeman&Co9.，NY，1983)，或者，也许更有利地，通过本文所述重组DNA技术产生。对于其它的指导，本领域一般技术人员可以参考Ausubel等(出处同上)，Sambrook等，(“Molecular Cloning，ALaboratory Manual，”Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，具体可参见例如Gait，M.J.编(“Oligomucleotide Synthesis，”IRL Press，Oxford，1984)。
本发明还涉及能与MASP-3作用并因此改变MASP-3功能的多肽(以及编码它们的基因)。可采用本领域所熟知技术鉴定能与MASP-3作用的多肽。一种适合的方法是“双杂交系统(two-hybrid system)”，其检测体内蛋白相互作用(Chien，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578，1991)。实施本方法的试剂盒可从Clontech得到(Palo Alto，CA)。
抗MASP-3抗体人MASP-3多肽(或免疫原性片段或类似物)可用于制备本发明所用抗体；这样的多肽可通过重组技术或合成产生(参见，例如“Solid Phase PeptideSynthesis，出处同上”；Ausubel等，出处同上)。通常，可将所述肽偶联到载体蛋白，如KLH上，如Ausubel等，出处同上所述，将其与佐剂混合后注射给宿主哺乳动物。所述载体也可以是PPD。可通过肽抗原亲和层析来纯化抗体。
具体地，通过注射MASP-3蛋白或多肽可以对各种宿主动物进行免疫。所述宿主动物包括兔，小鼠，豚鼠，大鼠，和小鸡。用于提高免疫应答的各种佐剂取决于宿主种类，这类佐剂包括弗氏佐剂(完全或不完全)，矿物质凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，多聚阴离子，肽，油乳液，匙孔血蓝蛋白，和二硝基苯酚。强效人用佐剂包括BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。也可通过注射编码MASP-3或其部分的DNA来进行免疫。多克隆抗体是抗体分子的异质种群，其包含在免疫动物的血清中。
本发明优选涉及，以产生抗体为目的，给药动物按照权利要求1所述的MASP-3多肽，或MASP-3多肽的一部分，或编码任意这样的多肽的DNA，使之产生的抗体。优选该抗体选择性结合MASP-3。
因此本发明的抗体包括多克隆抗体，此外还有单克隆抗体，人源化或嵌合型抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab’)2片段，采用Fab表达文库产生的分子，以及噬菌体展示技术产生的抗体或片段。
单克隆抗体是针对特定抗原的抗体均一群，它能通过采用如上所述MASP-3蛋白和标准杂交瘤技术制备(参见，例如，Kohler等，Natare 256495，1975；kohler等，Eur.3.Immunol.6511，1976；Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等，“Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，”Elsevier，NY，1981；Ausubel等，出处同上)。
具体地，可采用为生产抗体分子提供的任何技术得到单克隆抗体，如Kohler等，Nature 256495，1975，和US 4376110所述的传代细胞系培养；人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today 472，1983；Cole等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026，1983)，和EBV杂交瘤技术(Cole等，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，”Alan R.Liss，Inc.，77-96页，1983)。这样的抗体可以是任何免疫球蛋白类的，包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD及其任何亚类。(如果是鸡，免疫球蛋白类也可以是IgY)。产生本发明mAb的杂交瘤可在体外或体内培养。体内产生高滴度mAb的能力使其成为目前优选的生产方法，但在某些情况下，优选体外产生以避免引入癌细胞到活动物，例如，不希望有来自腹水(acitis fluids)的正常免疫球蛋白时，或者是涉及伦理方面的考虑。
多克隆，单克隆或噬菌体源的抗体一旦产生，就可通过如Ausubel等，出处同上所述标准方法用蛋白质印迹或免疫沉淀分析检测它们的MASP-3特异性识别。特异性识别和结合MASP-3的抗体都可用于本发明。例如，这样的抗体可以用于免疫测定以监测动物产生的MASP-3水平(例如，测定MASP-3的量和细胞内位置)。
优选的，本发明抗体用MASP-3蛋白的片段产生，所述片段位于高度保守区外，且根据诸如带电残基的高频率等标准判断很可能具有抗原性。在一具体的实施例中，这样的片段通过PCR标准技术产生，然后克隆进pGEX表达载体(Ausubel等，出处同上)。在大肠杆菌中表达融合蛋白，采用谷胱甘肽琼脂糖亲和基质纯化，如Ausubel等，出处同上所述。
在某些情况下可能需要使抗血清低亲和性或特异性的潜在问题最小化。在这样的情况下，针对每种蛋白会产生2或3种融合体，将每种融合体注射入至少2只兔子。抗血清可通过一系列注射获得，优选包括至少3次加强注射。
也检查抗血清使重组MASP-3蛋白或对照蛋白，如糖皮质激素受体，CAT，或萤光素酶免疫沉淀的能力。
所述抗体可在，例如诊断分析中用于检测生物样品中的MASP-3。抗体也可在筛选试验中使用以测定候选化合物对MASP-3表达或定位的影响。因此，为诊断目的，抗体可与包含可检测标记的化合物偶联。这类标记如上所述。此外，这样的抗体可与某些基因治疗技术联合应用，例如在引入患者前评价正常和/或工程化MASP-3表达细胞。这样的抗体还能在抑制异常MASP-3活性的方法中使用。
此外，可以使用生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851，1984；Neuberger等，Nature，312604，1984；Takeda等，Nature，314452，1984)，其将具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物活性的人抗体分子的基因剪接在一起。嵌合抗体是所含不同部分来自于不同动物种类的分子，如可变区来自鼠mAb而恒定区来自人免疫球蛋白的那些。
备选地，生产单链抗体的技术(US 4946778，4946778，和4704692)可改良后用于生产抗MASP-2蛋白或多肽的单链抗体。通过一个氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段，得到单链多肽，即为单链抗体。
识别并结合特异性表位的抗体片段可通过已知技术产生。例如，这样的片段包括，但不限于，抗体分子经胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段，通过还原F(ab’)2片段的二硫桥产生的Fab片段。备选地，可构建Fab表达文库(Huse等，Science，2461275，1989)以快速并容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。
MASP-3抗体可以反过来用于利用本领域所熟知技术产生抗-独特型抗体，其类似MASP-3的一部分(参见Greenspan等，FASEB J.7437，1993；Nissinoff，J.Immunol.1472429，1991)。例如，结合MASP-3并竞争性抑制MASP-3配基结合的抗体可用于产生类似MASP-3的配体结合结构域的抗-独特型抗体，因此，结合并中和MASP-3的配体，如MBL。这样的中和型抗-独特型抗体或这样的抗-独特型抗体的Fab片段可用于治疗方案中。
通过本领域已知方法可以使抗体人源化。例如，具有所需结合特异性的单克隆抗体可以商业化人源化(Scotgene，Scotland；Oxford Molecular，PaloAlto，CA)。完全人抗体，例如在转基因动物中表达的那些也是本发明特点(Green等，Nature Genetics 713-21；1994；参见US 5545806和5569825，都引入作为参考)。
本文所述利用了抗MASP-3抗体的方法可以通过，例如使用含本文所述至少一种特异性MASP-3核苷酸序列或抗体试剂的预包装诊断试剂盒进行，其可以便利地用于，例如在临床设备中，诊断表现出下述疾病的症状的病人。
MASP-3的定量分析只作为例子，可设计定量分析以评估体液或器官(活组织检查)提取物中的MASP-3浓度。这样的分析可以是流体相或固相。例如有竞争性和非竞争性ELISA。举一个后者的例子，微滴板的孔用抗MASP-3抗体包被，与样品温育，依次加酶标抗体和底物，底物被裂解为有颜色的化合物因此可观察MASP-3的存在。备选地，可使用标记如铕，并可利用时间分辨荧光测定术(time resdved fluoronetry)进行检测。
MASP-3抗原的分析采用标准免疫学方法方便地评估MASP-3蛋白为抗原。因此，本发明涉及检测生物样品中与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶-3(MASP-3)的方法，该方法包括(a)获得生物样品；(b)将该生物样品与特异性结合MASP-3的MASP-3多肽特异性结合配偶体接触；(c)检测该复合物，如果有，则指示该样品中与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶-3的存在。
所述结合配偶体可以是任何能特异性结合MASP-3并能被检测的分子，如通过用可检测标记物进行标记然后检测。因此特异性结合配偶体可以是本文所述抗体，或甘露聚糖结合型凝集素(MBL)，具体是MBL/MASP-2复合物。
只作为例子，MASP-3的定量TRIFMA(时间分辨免疫荧光测定法)如下进行1)用1g抗-MASP-3抗体包被微滴定板的孔；2)用Tween-20封闭；3)加入待测样品，例如稀释的血浆或血清样品；4)加Eu标记的抗MASP-3抗体；5)加增强溶液(Wallac Ltd)；6)在时间分辨荧光测定仪上读取Eu。(通过ELISA进行的评估可类似地通过，例如在步骤4中采用生物素标记的抗MASP-3；在步骤5中采用碱性磷酸酶标记的亲和素；6)加底物；7)读取光密度而进行。)在每个步骤之间，室温下孵育板，洗涤板(除在步骤6和7之间)。采用汇集的正常血浆的稀释液构建标准曲线，可任意规定其每ml包含1单位的MASP-3。
采用与天然或重组MASP-3或其部分反应的多克隆或单克隆或重组抗体构建类似的试验。
通过采用与完整MASP-3或活化产物选择性反应的抗体，或通过抗所述分子各部分的抗体的组合，来建立能评估MBLectin途径体内活化的试验。这些试验可用于确定此途径活化引起的炎症。
可采用几种方法分析MASP-3或其作为MBL/MASP复合物的一部分时的功能。可通过如下检测MASP-3的方法分析MASP-3抑制MBL/MASP-2复合物裂解C4的效应，该方法包括对MASP-3活性的检测，包含如下步骤-将含有预定量MBL/MASP-2复合物的样品加在含有结合型复合物的固相上，-将预定量的MASP-3加到所述结合型复合物上，-将至少一种补体因子与加到所述复合物上，-检测被裂解的补体因子的量，-将裂解的补体因子的量与MASP-3的量相关联，并且-确定MASP-3的活性。
可对各种浓度的MASP-3进行此分析以得到校正曲线。
为用此方法分析样品，如血清样品中MASP-3的功能，该方法包括如下步骤-将含有预定量MBL/MASP-2复合物的样品加到含结合型复合物的固相上，-将所述样品加到所述结合型复合物上，-将至少一种补体因子加到所述复合物上，-检测裂解的补体因子的量，-将裂解的补体因子的量与样品中MASP-3的活性相关联。
其中所述关联是相对上述标准校正曲线进行的关联。
所述固相可以是任何能结合MBL的涂层，如甘露聚糖涂层。
本方法中优选使用的补体因子是可被MBL/MASP-2复合物裂解的补体因子，例如C4。但是，补体因子也可选自C3和C5。
裂解的补体因子可通过几种方法检测，例如使用针对该裂解的补体因子的抗体。
下面给出了一个检测MASP-3活性的例子，其中所述待测样品加到用甘露聚糖包被的微孔中，加入C4以评估C4裂解活性，或加入C3以评估产生的C3转化酶的C3裂解活性。对不以MBL/MASP-2复合物的部分出现的MASP-3的检测类似地进行，但是MBL在加入甘露聚糖包被的孔之前，加入上述微孔或样品中。在加入MBL/MASP-2复合物之前，所述样品可以用固相甘露聚糖(例如，珠结合型甘露聚糖)处理，或通过固相抗-MBL抗体处理，或通过用合适浓度的沉淀试剂如PEG处理而耗竭MBL和MBL/MASP-1和MBL/MASP-2和MBL/MASP-3复合物，所述PEG使所述复合物沉淀但是MASP-3留在上清中。此检测进行的条件是最小化或消除经典补体活化途径和旁路补体活化途径的干扰。
优选抑制经典补体活化途径以减少试验中的人为现象(artifact)。优选通过在高离子强度下进行试验来进行抑制，例如其中的盐浓度为0.3-10M，例如0.5M-5M，例如0.7M-2M，例如0.9M-2M，例如约1.0M。所用盐可以是任何适于此试验的一种或多种盐，例如选自NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，NaI，KCl，MgI2，CaI2，NaBr，KBr，MgBr2，CaBr2，Na2S2O3，(NH4)2SO4，NH4HCO3。
旁路途径的抑制可通过在试验前将样品稀释至少5倍，例如至少10倍，例如至少20倍或更多倍来进行。
分析MBL/MASP复合物的MASP-3活性可通过MASP-3使补体系统活化或失活的能力来评估MASP-3。当C4被MBL/MASP裂解时，暴露出一个活性的硫羟酸酯，而C4与邻近的亲核基团共价连接。该C4的主要部分因此附着到已包被的塑料孔上，并可通过抗C4抗体来检测。MASP-3活性的定量TRIFMA如下进行1)用含1g甘露聚糖的100L缓冲液包被微滴板；2)用Tween-20封闭；3)加入预先定量的MBL/MASP-2复合物，加待测样品，例如稀释的血浆或血清样品；5)以5g/ml加入纯化的补体因子C4；6)在37℃下温育1小时；7)加Eu标记的抗C4抗体；8)加入增强溶液；9)用时间分辨荧光测定术读取Eu。(通过ELISA进行的评估可类似地通过，例如在步骤7加入生物素标记的抗C4；8)加入碱性磷酸酶标记的亲和素；9)加底物；10)读取显色光密度而进行)。除步骤8和9外，在每个步骤之间将板室温下温育并洗涤。选出一种正常血浆，可任意规定其每ml含有1单位MASP-3活性，使用其不同稀释度来构建校正曲线。优选此分析在排除了补体的经典或旁路不同活化途径对C4的活化的条件下进行。C4的活化被丝氨酸蛋白酶抑制因子苄脒完全抑制。经典途径的活化可通过在存在足够高的离子强度(0.7-2.0M NaCl；优选约1.0M NaCl)的情况下进行步骤3)而被有效消除，此离子强度不会干扰MBL/MASP复合物但会完全破坏C1qrs复合物；旁路途径的活化通过在如上稀释进行试验而有效排除。
试验在存在MASP-3时进行比不存在MASP-3时进行所需C4b的量要少，这表明MASP-3是MBL/MASP-2复合物的补体活化作用的抑制因子。
对游离MASP-3活性的评估试验对来自MBL缺陷个体的样品中MASP-3活性的评估在包被了MBL/MASP-2复合物的孔中进行。对具有MBL的个体的样品中游离MASP-3的评估是首先要通过与Sepharose-偶联的甘露聚糖温育(300L10倍稀释的血浆或血清与10L珠温育)而除去MBL/MASP-1和MBL/MASP-2和MBL/MASP-3复合物，然后在分析上清。该分析可如上进行，或按照下列的分析进行在TRIFMA甲酸盐(formate)方案中如下进行试验1)用含1g甘露聚糖的100L缓冲液包被微滴板；2)用Tween-20封闭；3)在含有100ng无MASP的MBL/ml的缓冲液中温育稀释1000倍的样品，每孔加入该混合物100L；4)4℃下温育过夜4)洗涤并加入5g/ml纯化的补体因子C4；5)在37℃下温育1小时；6)加入Eu标记的抗C4抗体；7)加入增强溶液；8)经时间分辨荧光测定术读取Eu。(通过ELISA进行的评估可类似地通过，例如在步骤6加入生物素标记的抗C4；7)加入碱性磷酸酶标记的亲和素；8)加底物；9)读取显色光密度而进行。)除步骤7和8外，在每步骤之间将板室温下洗涤。选出一种MBL缺陷血浆，任意规定其每ml含有1单位MASP-3活性，使用其不同稀释度来构建校正曲线。此分析在排除了补体的经典或旁路活化途径对C4的活化的条件下进行(参见上面)。
评估MASP-3活性或定量MASP-3的分析可用于为诊断和治疗目的而测定个体样品，特别是那些患有传染病或炎症疾病者。
MASP-3的功能在血清中这些蛋白酶只有一小部分与MBL相连，如针对MASP-1和MASP-218，19所证实的那样，，认识到这一点是重要的。通过耗竭(deplete)血清中的MBL复合物以及对残余MASP-3的分析证实该蛋白也是如此。
MASP-3被认为对补体活化施加了抑制效应，具体是当与MBL/MASP-2复合物结合时。
血清中只有一小部分MASP-3与MBL结合，基于此事实，还认为MASP-3也可直接或通过与其它蛋白结合，如通过形成MBL/MASP-3复合物而对诸如补体活化等施加刺激效应。
MASP-3用于治疗在权利要求中特指的组分的治疗用途可在这样的情况下使用，因组成性或暂时性MASP-3缺陷使患者易对一或多种感染易感时，或当个体不能中和已有感染时。MASP-3或MBL/MASP复合物的给药优选静脉输注，这样可改善患者的免疫防御。
并非与某种理论相关，认为MBL/MASP复合物的强抗微生物活性需要MASP-3，当MASP-3因先天或后天原因缺陷时会因此削弱个体对感染的抵抗力以及对已患感染的恢复能力。这时，采用天然或重组MASP-3进行重建是一种有用的治疗方法。重组MASP-3可以是完整分子，或该分子的一部分，或是为调控活性而通过任何方法与另一结构相连的其整体或部分。重组产物结构上可与天然分子相同，或稍加改变以根据需要产生增强的活性或降低的活性。
刺激在一种实施方案中，MASP-3可具有对补体活化的刺激作用，如直接或通过与MBL结合而活化补体系统。
采用天然或重组MBL进行的重建需要受者具有足够多的MASP-3用于MBL/MASP活性的表达。这样，当患者MASP-3活性不足时，治疗制剂中必须有MASP-3。
为改善个体的免疫防御而例如通过静脉输注给药功能性MASP-3或MBL/MASP-3复合物或其任意功能性衍生物或变体，这是本发明的优选治疗方法。但是，其它治疗方法可包含对人和动物的，例如免疫系统和生殖系统的治愈性治疗和/或预防。
要治疗的病理情况并不限于目前已知的需要治疗的病情。此病理情况一般包括与当时和/或预期的需要或与正常病情的改善有关的任何病情。具体地，所述治疗可以是治疗MBL缺陷疾病。本发明的另一方面提供制备药物的方法，所述药物包含药物组合物，其中有功能性MASP-3或MBL/MASP复合物，或任意其变体，用于治疗和/预防疾病，例如人或具有与人类类似功能单位的动物的免疫系统和生殖系统的疾病。
需要用本发明化合物治疗的这些疾病和/或病情包括例如治疗MBL缺陷疾病，治疗与与免疫抑制性化疗有关的癌症和感染，具体包括与在癌症治疗期间有关的感染或与器官植入或移植有关的那些感染。本发明还包括与复发性流产有关的病情的治疗。
因此，具体是包含MASP-3或其功能性变体的药物组合物可用于治疗和/或预防的临床疾病选自感染、MBL缺陷，癌症，与化疗有关的疾病，如感染，与人免疫缺陷病毒(HIV)有关的疾病，与先天或获得性免疫缺陷有关的疾病。更具体地，慢性炎性脱髓鞘多发性神经炎(CIDP)，多灶性运动神经元病(multifocal motoric neuropathy)，多发性硬化症，重症肌无力，Eaton-Lambert综合征，视神经炎(Opticus Neuritis)，癫痫；原发生抗磷脂综合征；类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，全身性硬皮病，脉管炎；Wegner肉芽肿病，Sjogren综合征，少年性(juvenile)类风湿性关节炎；自身免疫性中性白细胞减少症，自身免疫性溶血性贫血，中性白细胞减少症；Crohn病，溃疡性结肠炎，Coeliac disease；哮喘，败血性休克综合征，慢性疲劳综合征，牛皮癣，毒性休克综合征，糖尿病，窦炎(Sinuitis)，扩张性心肌炎(Dilatedcardiomyopathy)，心内膜炎，动脉粥样硬化，包含普通可易型免疫缺陷在内的原发性低/无丙种球蛋白血症(hypo/agammaglobulinaemia)，Wiskot-Aldrich综合征和重症联合免疫缺陷(SCID)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)和多发性骨髓瘤患者中的继发性低/无丙种球蛋白血症(Secondaryhypo/agammaglobulinaemia)，急性和慢性特发性血小板减少(ITP)，同种异体骨髓移植(BTM)，川崎征(Kawasaki)，Guillan-Barre综合征。
具体地，可给药MASP-3组合物以预防和/或治疗有与先天性或获得性MBL缺陷有关的临床症状或有患此症状风险的病人的感染。很多状况可能导致MBL缺陷个体对感染易感，例如化疗或其它治疗性细胞毒治疗，癌症，AIDS，遗传因素，慢性感染和中性白细胞减少症。
所述感染可能由任何病原体或寄生虫引起，包括任何细菌病原体和病毒性病原体。治疗可针对局部感染，例如脑膜感染，或治疗目的可以是应对如不治疗可能有生命危险的那些急性全身性感染。炎症疾病也可能是由于自身免疫疾病。
在另一实施方案中，MASP-3具有抑制补体活化，具体是C4活化的效果。采用在哺乳动物表达系统中产生的重组蛋白对MASP-3的生物学活性进行的检测揭示，rMASP-3对天然MBL复合物的C4活化作用有显著抑制活性(图9a)。rMBL-rMASP-2复合物的活性也被rMASP-3抑制(图9b)。
因此提供一种通过抑制MBL途径来抑制补体活化的方法，该方法包括给药有效量的MASP-3或其功能性变体至需要下调和/或抑制补体个体的步骤。
在本发明的一个优选实施方案中，提供通过抑制MBL途径抑制C4补体活化的方法，该方法包括对需要下调C4和/或抑制C4的个体给药有效量的MASP-3或其功能性变体。
还提供抑制MASP-2活性的方法，该方法包括对需要下调MASP-2和/或抑制MASP-2的个体给药有效量的MASP-3或其功能性变体。在一个优选实施方案中，MASP-3能抑制MASP-2与MBL形成复合物。
因此，提供了抑制或治疗个体中炎症疾病，具体是与经由MBL/MASP复合物的补体活化有关的疾病的方法，该方法包括对需要治疗炎症的个体给药有效量的MASP-3或其功能性变体。所述炎症疾病可以是慢性的，例如类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮，或是急性炎症疾病。本发明的治疗在一个实施方案中是针对reoxygenated缺血组织的治疗，例如该炎性疾病也可能是在急性心肌梗塞或脑局部缺血后自身免疫病所致。
在另一实施方案中，提供了治疗由于失衡的细胞因子网(imbalancedcytokine network)所致疾病的方法，例如与TNF对细菌脂多糖的不利应答有关或因此导致的疾病，该方法包含对有需要的个体给药有效量的MASP-3，或其功能性变体的步骤。
给药途径可以是任何合适的途径，例如经静脉，肌肉内，皮下或皮内。同样，本发明也设想了经肺或局部给药。
MASP-3的临床应用本发明所述多肽可以用于各种临床目的，例如作为药物组合物给药。因此，本发明的一方面涉及本发明所述多肽，或如本文定义的化合物在制备药物组合物中的应用。
所述药物组合物优选能不经肠给药，如经静脉，肌肉内，皮下或能口服给药。
如上对MASP-3治疗所述，所述药物组合物可用于很多疾病，如治疗MASP-3缺陷，或用于抑制MBL/MASP复合物。
MASP-3分析在用MASP-3(或MASP-3抑制因子)治疗前必须评估患者血清或血浆中的MASP-3。这样的检测实施例如下所述。
对MASP-3活性的抑制MASP-3生物活性的抑制因子可用于调控MASP-3的补体活化活性和炎症活性或用于中性MASP-3的抑制效应，以使MBL/MASP复合物的活性有全面的提高。这样的抑制因子可以是具有MASP-3酶活性的目标结构的底物类似物。抑制因子可以是天然肽，修饰的肽，或任何竞争性或非竞争性抑制MASP-3活性的有机分子。所述抑制因子可经修饰以在循环中保留更短或更长的时间，可被构建成能经注射或经口给药。抑制因子可以是MASP-3片段，通过化学或酶方法产生自天然或重组MASP-3。抑制因子可以是MASP-3天然较短形式。抑制因子可以是MASP-3的突变型。抑制因子可以是可溶型或与固相偶联型。固相可以是相容表面(compatible surface)，例如体外(extracorporal)血液或血浆流装置所用的表面。
所述MASP-3活性可被能抑制MBL和MASP-3形成复合物的化合物所抑制。所述化合物可以是任何能与MBL/MASP-2复合物结合而不表现出MASP-3效应的化合物。相应地，所述化合物可以包含本文所定义的多肽，或其能结合MBL的片段。
在另一实施方案中，所述化合物可以是或包含本文所述能结合MASP-3并因此抑制MASP-3活性的抗体。
同样，这样的化合物可能破坏MBL和MASP-3形成复合物从而抑制MASP-3活性。
微生物碳水化合物或内源寡糖可激发MBL/MASP复合物的意外活化，产生破坏性炎症应答。这种病理性活性可通过给药MASP-3活性的抑制因子，如Pefabloc来减弱。同样在检测MASP-3活性的TRIFMA中其它的酶抑制因子(C1抑制因子，β2-巨球蛋白，抑肽酶(Aprotenin)，PMSF，苄脒等)也证明是有效地。显然，当设计体内应用的抑制因子时，主要考虑的是毒性，可以认为高度特异性的抑制因子比更广泛反应的抑制因子具有较低的毒性。特定的抑制因子可通过使用具有目标结构的肽，肽类似物或肽衍生物得到。另一种抑制因子可以是基于针对MASP-3的活性位点或MASP-3上其它结构并因此抑制MASP-3活性的抗体(或抗体片段)。抑制因子也可以直接抑制MASP-3的活化。另一种抑制因子将阻止MASP-3与MBL结合，从而抑制MASP-3活化。MASP-3的消耗(drain)片段可以是此类型的合适的抑制因子。更具体地，可定位所述多肽链中介导MASP-3结合MBL的准确部位，并用合成肽或结构类似物作为抑制因子。抑制因子也可用D-氨基酸取代L-氨基酸。
同样，抑制因子可以是以MASP-3或其片段作为能与MASP-3分子结合的选择性分子经SELEX(通过指数富集进行的配体的系统性进化)分离的单链DNA或RNA。抑制MASP-3活性的另一方法是给受试者一种抑制MASP-3表达的化合物如MASP-3反义核酸序列。
也可通过控制MASP-3的酶原形式转化为活化的MASP-3来控制MASP-3的活性。
药物组合物本发明所述药物组合物可包含一或多种本发明的多肽或化合物，任选还包含药物可接受的载体。
依照本发明方法，所述组合物可以通过注射给药，如一段时间内渐进输注或通过其它医学可接受的形式。所述给药可以是，例如，经静脉，腹膜内，肌肉内，腔内，皮下或经皮给药。非经肠道给药的制剂包括无菌水性或非水性溶液，悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子有丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射的有机酯如ethyloliate。水性载体包括水，醇类/水溶液，乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲基质。
非经肠道赋形剂包括氯化钠溶液，Ringer葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸化Ringer或固定油。静脉内赋形剂包括液体和营养补充物，电解质补充物，(如基于Ringer葡萄糖的那些)，等等。也可以有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，惰性气体等。本领域技术人员无需实验就能容易地确定制备这些备选药物组合物的各种参数。当给药本发明的药物组合物以治疗肺病时，所述组合物可通过例如气雾剂输送。
本发明的组合物可以以治疗有效量给药。本文中，本发明多肽或化合物的“有效量”是足够实现所需相关补体活化或中和作用的剂量。所述有效量足够产生所要的与细胞损伤有关的抑制效应，直到与MBL介导的疾病相关的症状得到缓解或降低。优选所述多肽的有效量是阻止细胞损伤的有效量。
通常，治疗有效量可根据受治疗者的年龄，状况，和性别，以及受治疗者的疾病程度而不同，并可由本领域技术人员确定。在出现任何并发症时，所用剂量可以由不同的医生或兽医作出调整。治疗有效量范围通常为约0.01mg/kg到约500mg/kg，如通常从约0.1mg/kg到约200mg/kg，经常从约0.2mg/kg到约20mg/kg，每天一或多剂，共给药一或多日(取决于给药方式和上述讨论的因素)。
本领域技术人员能通过在体外实验中筛选MASP-3浓度和有关的补体活化确定化合物的有效剂量。
所述多肽和化合物可以在生理可接受的载体中给药。术语“生理上可接受的”指能与生物系统如组织或器官相容的非毒性材料。生理上可接受的载体体内给药时必须是无菌的。所述载体的特征取决于给药途径。
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实施例实施例1MASP-3的鉴定以钙依赖方式结合糖类的人血浆蛋白和蛋白复合物(即凝集素和与凝集素相连的蛋白)通过在甘露聚糖-或甘露糖-或N-乙酰氨基葡萄糖-衍生的Sepharose或TSK珠上进行亲和层析来纯化。汇集的CPD-血浆(2.5L)用含EDTA和酶抑制剂的缓冲液稀释，然后流经Sepharose 2B CL和甘露聚糖Sepharode。加入凝血酶抑制剂PPACK(D-苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酰-氯甲基酮)和CaCl2。使混合物流经Sepharose 2B-CL和甘露聚糖-Sepharose，依靠钙与甘露聚糖-Sepharose结合的蛋白用含EDTA的缓冲液洗脱。将洗脱液重新钙化，流经GlcNAc-Sepharose柱，如上洗脱得到20ml“凝集素制剂”。
所述蛋白制剂经SDS-PAGE并印迹至PVDF膜来进行分析。用抗牛凝集素制剂31的小鸡抗体使该印迹显影，显示出MASP-2的52kDa A-链以及32kDa的MBL。用考马斯亮蓝经非特异性蛋白染色显示出另一条48kDa带。对该48kDa带进行NH2-末端氨基酸序列分析。所得序列(图4)表现出与前述MASP的丝氨酸蛋白酶区(B链)的相似性。用抗代表19个NH2-末端氨基酸的合成肽的抗体(抗-pMASP-3抗血清)可以识别所述48kDa分子(图1，泳道1)。在非还原条件下用该抗pMASP-3抗血清测出一种110ka的多肽(图1，泳道2)，表示链内二硫键的存在。
实施例2制备抗MASP-3的抗体被BCG(卡介苗)引发的动物用与PPD(结核菌素纯蛋白衍生物)偶联的合成肽免疫。抗-pMASP-3抗体来自于用对应于48kDa MASP-3带的前20个氨基酸(IIGGRNAEPGLFPWQALIVV)的肽免疫的兔。所有肽还具有另一个C-末端半胱氨酸用于偶联。单克隆抗-MBL抗体，IgG1-κ(克隆131-1)和对照IgG1-κ(克隆MOPC 21)由蛋白A亲和层析纯化。蛋白质印迹染色所用抗体为1g/ml。结合的免抗体用过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体IgG经增强的化学发光技术显影后显示。
实施例3MBL/MASP复合物2μg无MASP的MBL加入到1ml MBL缺陷型血清中，随后加入100μL甘露糖-TSK珠。另外1ml MBL缺陷血清与100μL甘露糖-TSK珠4℃温育过夜。将珠用含钙缓冲液洗涤，随后向这些珠子添加由含10mM EDTA的TBS(tris缓冲盐溶液，含20mM Tris，145mM NaCl)稀释2倍的SDS-PAGE缓冲液组成的洗脱缓冲液。洗脱的蛋白在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE蛋白质印迹分析。用大鼠抗-pMASP-3抗体及随后用HRP标记的抗-大鼠IgG抗体使蛋白质印迹显影。发现MASP-3只在与加入了无MASP之MBL的MBL缺陷血清温育的珠的洗脱液中存在，在只与MBL缺陷血清温育的珠的洗脱液中并不存在(图2)。
凝集素制剂(如上实施例1所述)在用单克隆抗-MBL抗体，单克隆抗MASP-1抗体包被的微滴孔，或在作为阴性对照的用同一亚类的非特异性单克隆免疫球蛋白包被的孔中温育。用含钙缓冲液和含EDTA缓冲液稀释所述凝集素制剂。将被所述抗体捕获的蛋白洗脱并通过非还原条件下的SDS-PAGE/蛋白质印迹进行分析。所述印迹用抗pMASP-3抗体显影。结果(图3)显示抗-MBL抗体除结合MBL外还捕捉MASP-3而单克隆抗-MASP-1并不这样。泳道1表示未分级的凝集素制剂。泳道2和3表示来自于用非有义IgG包被并与凝集素制剂温育的孔的洗脱物(泳道2为有钙时，泳道3是有EDT时)，而泳道4和5表示来自于用单克隆抗MASP-1抗体包被并用凝集素制剂温育的孔的洗脱物(泳道4有钙时，泳道5是有EDTA时)，泳道6和7表示来自于用单克隆抗MBL-1抗体包被并用凝集素制剂温育的孔的洗脱物(泳道6是有钙时，泳道7是有EDTA时)。在图中指出了110kDaMASP-3带的位置。
此实验揭示MASP-3只出现在用抗MBL抗体包被的孔的洗脱物中，在用抗MASP-1包被或用非有义IgG包被的孔的洗脱物中并没有。因此MASP-3与MBL相连，与MASP-1的连接程度极低，或根本不连接。还发现MBL和MASP-3之间的连接是有赖于钙的。
实施例448kDa多肽的N末端-和肽-氨基酸测序将凝集素制品浓缩，进行SDS-PAGE，并转移到PVDF膜上。所述印迹用考马斯亮蓝染色。对应考马斯染色的48kDa带的条带被切下，然后在Applied Biosystems protein sequencer上测序。产生抗pMASP-3抗体后，采用该抗pMASP-3抗体进行类似的蛋白质印迹。被此抗体显影的48Kda带中的蛋白NH2末端接受测序，结果与上述考马斯染色的48kDa条带的相同。对考马斯染色的SDS-PAGE凝胶中48kDa条带的蛋白用胰蛋白酶消化得到肽。所述肽通过反相层析分级分离，对主峰肽进行测序。所得序列见图4。
实施例5MASP-3的克隆和测序肝脏是合成C1r，C1s，MASP-1和MASP-2的主要部位。因此制备自肝脏RNA的cDNA用作PCR的模板，引物来自所得的肽序列。对cDNA进行PCR，所用简并引物衍生自氨基酸序列WQALIVVE和EHVTVYL。借助TA-克隆试剂盒(InVitrogen)将所得PCR产物克隆到大肠杆菌质粒pCRII中，测定插入子的核苷酸序列。
所得PCR产物的核苷酸序列包含一个开放式读码框(ORF)，其中推导的氨基酸序列证实了用于衍生所述引物的肽序列以及另一已测序肽的序列。cDNA的核苷酸序列和翻译的氨基酸一起显示在图5中。
实施例6MASP-3与MASP-1，MASP-2，C1r和C1s的对比推导自图5的cDNA序列的氨基酸序列与MASP-1，MASP-2，C1r和C1s的序列同源(图6)。MASP-1，MASP-2，C1r和C1s都是通过裂解位于第二CCP区和丝氨酸蛋白酶区之间的Arg和Ile残基之间的肽键而活化的。所得肽链(最大的称为A链，最小的称为B链)通过一个二硫键连接在一起。通过类比，我们的结果显示在还原条件下的SDS-PAGE后被抗-pMASP-3抗体识别的48kDa多肽是MASP-3的B链的一部分。基于图6的比对研究了这4种蛋白间的同一性和相似性。在所有4种蛋白中的相同的残基以星号标出。Arg和Ile残基之间能产生A和B链的潜在裂解位点，与MASP-3的丝氨酸蛋白酶区起始点相同。48kDa肽的氨基酸测序所得的序列以下划线标出。只有MASP-1序列包含组氨酸环，是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的特征23，24实施例7MBL补体活化途径的MASP-3和起始复合物补体系统代表具有重要临床意义的抗微生物防御机制32，其在适应性免疫应答中具有确定的作用33，34。最近有一个令人惊异的进展是补体活化的甘露聚糖结合型凝集素(MBL)途径的发现。越来越多的临床证据说明了在抗侵入微生物的非适应性防御中人MBL的重要性12，35，36，但是起始复合物的分子特征和机制仍不清楚。已有报导两种丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-24，5，22和一种多肽MAp1937或sMAP38与MBL相连，该MBL是识别微生物碳水化合物的单元。这些成分显示与经典途径的相应成分，C1q-相连的蛋白酶，C1r和C1s4，22，以及C1q39这种抗体识别单元，的结构相似性。这里，我们提出了一个新的，系统发育高度保守的MBL复合物成员，MASP-3。我们的研究显示两种不同的MBL/MASP复合物，MBL-cI和MBL-cII能引发补体活化。MBL-cI包含与最小的MBL寡聚体MBL-I相连的MASP-1和MAp19，并直接活化C3，而MBL-cII包含与MBL-II相连的MASP-2，并产生C3转化酶c4bc2b。MASP-3也与MBL-II相连并调控MASP-2活性。
我们对MBL途径的研究鉴定了一种新的凝集素结合蛋白。其自血浆通过顺序碳水化合物亲和层析和SDS-PAGE纯化。该42K蛋白的N末端测序表明它是一种丝氨酸蛋白酶结构域。
制备抗该42K蛋白N末端序列衍生的合成肽的抗体。使用此抗体进行的双向SDS-PAGE和Western印迹显示预计的丝氨酸蛋白酶结构域衍生自Mr＝105K的蛋白。在活化前，该105K蛋白形成二硫键连接的二聚体(图7a)。活化将该105K蛋白分为42K和58K的链。较长的链在western印迹中看不到是因为它不能被所用抗体检测到。此结构类似于其它丝氨酸蛋白酶的A和B链结构。
分析性亲和方法显示所述蛋白在血浆中以与MBL的复合物的形式存在(图7b)。当采用MBL充足的血清时所述蛋白与固相抗MBL抗体结合，当采用MBL缺陷血清时却没有结合。当MBL加入到MBL缺陷血清中时，该蛋白又与固相结合。所述蛋白因此被称为与MBL相连的丝氨酸蛋白酶-3，MASP-3。
MBL复合物可通过离子交换层析和蔗糖梯度离心分成不同的结构和功能形式。通过非还原的SDS-PAGE显示出四种不同的MBL条带，MBL-I，II，III和IV，它们的迁移率对应于约275K，345K，580K和900K的Mr(图8b)。在离子交换层析时，通过增加盐浓度可以上述次序将它们洗脱下来，在蔗糖梯度离心上它们也以同样的次序表现出沉降速率(图8)。不同MBL形式的存在与以前的文献相符合39，40。两种分级分离方法表现出MASP-1和MAp19主要与MBL-I相连，MASP-2和MASP-3主要与MBL-II相连，但有极少数例外。活化C4的能力，即产生C3转化酶C4bC2b的第一步与MBL-II复合物，MBL-cII一致(图8a)。MBL-I复合物(MBI-cI)能直接活化C3(图8h)。这与前面对分离的MASP-14，41和MASP-222的活性观察相符合。另还显示rMASP-2与MBL组成的复合物可以活化C430。尽管不知道与MBL形成复合物MASP-3的确切功能，我们采用在哺乳动物表达系统中产生的重组蛋白检测了MASP-3的生物活性。这揭示rMASP-3通过天然MBL复合物显著抑制C4活化的活性(图9a)。rMBL-rMASP-2复合物活性也被rMASP-3所抑制(图9b)。为理解所述这些MASP的生物学，重要的是意识到在血清中这些蛋白酶只有一小部分与MBL相连，MASP-1和MASP-2已被证明是如此29，42。通过消耗MBL复合物血清和分析残余MASP-3，我们对此蛋白发现了同样的结果(未显示)。
对MASP-3衍生肽的进一步测序给出可用于设计和合成简并寡核苷酸的氨基酸序列。这些用在PCR扩增中从肝脏cDNA产生174个碱基的核苷酸片段。推导出的氨基酸序列(图10a)将所述蛋白归类为与MASP-1，MASP-2，C1r和C1s的B链同源的蛋白酶。在此阶段，将来自人类基因组计划(Human Genome Project)的DNA序列提交数据库(AC007920)。通过与MASP-1，MASP-2，C1r和C1s的B链相对比，判断该230kb的随机片段包括MASP-3的完整B链序列。此外，它包括编码MASP-1的A链的十个外显子，和编码MASP-1 B链的6个外显子。根据已公开的MASP-1基因组序列将所述相关片段分类43，产生图10b所示基因组结构。MASP-3 B链的外显子位于编码MASP-1 A链的外显子和编码MASP-1 B链的外显子之间。其它具有这种排列的DNA序列(AC068299，AC069069，AC034190，AC046154)随后进入数据库。合成对应于MASP-3 B链的5’和3’末端的引物并用于基因组DNA和肝脏cDNA的PCR扩增。两个反应产生的DNA片段被克隆并测序，发现与数据库中的B链序列100％相同。因此，与MASP-1B链不同，但与MASP-2，C1r和C1s的B链相似，MASP-3 B链也由单个外显子编码。MASP-3象MASP-2，C1r和C1s一样，缺少MASP-1和其它胰蛋白酶样蛋白酶的特征性组氨酸环(图10a)。
从人的肝脏文库克隆MASP-3 cDNA，结果发现一种由共有的MASP-1/3 A链和特有的MASP-3 B链组成的转录产物。此结构由对人肝脏cDNA的PCR得到证实，所述PCR采用的引物对对应于MASP-1 A链的外显子9的序列和MASP-3 B链的序列(图10b)。A链的最后一个结构域由外显子9和10编码。外显子10之后是一个内显子和编码MASP-3 B链的外显子。最大的克隆编码全长MASP-3(pMASP-3；4.1)，其包含3595bp，以90bp的5’非翻译区开始，后面是2184bp的开放式读码框(ORF)和1321bp的3’非翻译区，最后是聚腺苷酸尾。pMASP-3；4.1的核苷酸序列已登记在GenBank中(登录号AF284421)。在由该克隆导出的序列中鉴别出被测序的肽的氨基酸序列(图10a)。ORF编码728个氨基酸的多肽链，包括19个残基的信号肽。在B链中发现3个N-糖基化位点，在A链中发现4个。忽略信号肽后，在SDS-PAGE上与105K相对比，理论Mr是81,873。理论等电点是5.02，摩尔消光系数在280nm是121，610(1g/l的吸光度＝1.49)。备选的剪接位点紧接在外显子10之后。B链的开放式读码框以42bp的未翻译序列开始，其后是14个残基连接区的密码子。此连接区之后是使A和B链分开的活化位点(图10c)。针对表示MASP-1 A链的20个N末端残基的肽所产生的抗体在蛋白质印迹中识别MASP-3，此MASP-3也可被抗MASP-3 B链抗体和针对代表MASP-3连接区的肽所产生的抗体所鉴定(未显示)，因此证实MASP-3蛋白是不同剪接的产物。
数据库检索显示MASP-3 B链与记录为鲨鱼和鲤鱼MASP243的序列同源(图10a)。所述序列同一性超过60％，而在人MASP-3 B链和人MASP-1和MASP-2 B链间只分别有37％和38％。七鳃鳗MASP和鲨鱼、锂鱼MASP20有许多共同的结构特征。尽管在七鳃鳗(lamprey)MASP和人MASP-3 B链间的序列同一性只有38％，我们认为鲨鱼，鲤鱼和七鳃鳗蛋白与MASP-3是同源的。
记录为猪DNA的序列显示出与人MASP-3 B链有93％的同一性(图10a)。这是蛋白酶中不常见的保守程度，其中对催化中心外的单个氨基酸残基的约束比保守的结构蛋白如组蛋白要少得多。
这些结果给出了MBL复合物和MBL途径的清晰画面。有不同类型的复合物MBL-cI，其包括MASP-1和MAp19并使C3直接活化，MBL-cII，其含有MASP-2并通过C3转化酶C4bC2b的形成活化C3。MASP-3也与MBL-cII相连。rMASP-3表现出对补体活化的调控活性。MASP-3表现出有趣的特点，它是能同时编码MASP-1和MASP-3的单个基因转录所得RNA经不同剪接后的翻译产物。系统发育上MASP-3 B链的保守程度少见的高。
方法MBL复合物MBL复合物通过在酶抑制因子存在下在甘露聚糖-Sepharose上的亲和层析并用含甘露糖的缓冲液洗脱而纯化44。
蔗糖梯度离心如下进行100μL MBL复合物或30μL血清样品用70μLTris缓冲的盐溶液(TBS)稀释，加入到含5mM CaCl2和50μg/ml的人血清白蛋白的TBS中的11-ml蔗糖梯度(10％-30％)中，用于配备Sorval TST 41.14转子的Beckman L8-M离心机35000rpm，4℃下离心24h。收集0.3ml的级分，通过时间分辨免疫荧光测定(TRIFMA)确定IgG，IgM和MBL沉淀峰的位置29。
为进行离子交换层析，将MBL复合物对含50mM NaCl和10mM CaCl2的20mM Tris/HCl，pH7.8透析，在1ml Mono Q柱(Amersham-Pharmacia)上用一个到0.5M的NaCl梯度分级。收集0.5ml的级分并通过TRIFMA分析MBL。
这些级分还通过SDS-PAGE Western印迹用抗MBL(Statens SerumInstitut，Copenhagen，丹麦)，抗-MASP-122，抗-MASP-229，或抗-MASP-3抗体进行分析。采用文献方法22制备针对42K链的前19个氨基酸残基的抗-MASP-3抗体。印迹用辣根过氧化物酶标记的第二抗体(Dako，Glostrup，丹麦)处理，然后用加强型化学发光试剂(Pierce)处理并对X-射线胶片曝光。标准分子量标记来自BioRad(“Precision Standards”)，α2M和IgM(Sigma)。
氨基酸测序纯化自血浆的凝集素制剂22进行SDS-PAGE，转移到PVDF膜上并用考马斯亮蓝染色。切下42K带并在Applied Biosystems蛋白质测序仪上测序。
通过胰蛋白酶消化用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶上的42K带得到肽段，通过反相层析分级分离，并对主峰中的肽测序。
C3活化各种级分中MBL复合物活化C341的能力如下评估从离子交换层析所得级分中取50μl样品与50mg纯化的C322在20μl TBS中的溶液于37℃一起保温2h，经SDS-PAGE Westem印迹后，所得消化产物用生物素化抗C3抗体以及用于显影的亲和素过氧化酶来分析。
C4活化对C4的活化作用如下评价使样品在用甘露聚糖包被的微滴板上4℃温育，随后与纯化的C445在37℃下温育并用Eu-标记的单克隆抗-C4抗体29显影。
MASP-3 cDNA和rMASP-3对人肝脏cDNA(Clontech)进行PCR，采用分别来自氨基酸序列WQALIVVE和EHVTVYL的简并性有义和反义引物。在48℃下退火，进行30个循环后完成PCR，采用Boehringer Mannheim的长扩展PCR系统。将所得174bp的PCR产物克隆到大肠杆菌质粒(2.1-TOPO，InVitrogen)中，测定插入片段的核苷酸序列。通过BLAST将此序列鉴定为由随机片段组成的230kb的基因组片段(AC007917)。用特异性引物得到载体pEAK8(Pangene，California)中两个cDNA克隆(pMASP-3；4.1和pMASP-3；3.0)。插入片段包含编码MASP-3全长2163bp的一个开放式阅读框。
通过先前报导的一种方法合成rMASP-3。简言之，表达Epstein-Barr核抗原的人胚肾细胞(HEK 293EBNA，InVitrogen)用pEAK8/pMASP-3；4.1构建体转染，在补充了胰岛素，运铁蛋白和硒的RPMI-1640(GibcoBRL)中培养。6天后收获培养上清。使HEK 293EBNA细胞与不含所述构建体的磷酸钙沉淀物一起保温来制备对照。
序列表<110>Natimmune<120>MASP-3<130>P475DK00_Masp-3_cDNA_full_length<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3895<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(91)..(2277)<400>SEQ ID N0 4attccggcac agggacacaa acaagctcac ccaacaaagc caagctggga ggaccaaggc 60cgggcagccg ggagcaccca aggcaggaaa atg agg tgg ctg ctt ctc tat tat 114Met Arg Trp Leu Leu Leu Tyr Tyr15gct ctg tgc ttc tcc ctg tca aag gct tca gcc cac acc gtg gag cta 162Ala Leu Cys Phe Ser Leu Ser Lys Ala Ser Ala His Thr Val Glu Leu10 15 20aac aat atg ttt ggc cag atc cag tcg cct ggt tat cca gac tcc tat 210Asn Asn Met Phe Gly Gln Ile Gln Ser Pro Gly Tyr Pro Asp Ser Tyr25 30 35 40ccc agt gat tca gag gtg act tgg aat atc act gtc cca gat ggg ttt 258Pro Ser Asp Ser Glu Val Thr Trp Asn Ile Thr Val Pro Asp Gly Phe45 50 55cgg atc aag ctt tac ttc atg cac ttc aac ttg gaa tcc tcc tac ctt 305Arg Ile Lys Leu Tyr Phe Met His Phe Asn Leu Glu Ser Ser Tyr Leu60 65 70tgt gaa tat gac tat gtg aag gta gaa act gag gac cag gtg ctg gca 354Cys Glu Tyr Asp 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Met Gly Leu Pro Gln Ser705 710 715 720Val Val Glu Pro Gln Val Glu Arg72权利要求
1.一种基本上纯的与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶-3(MASP-3)多肽。
2.权利要求1的多肽，该多肽能与甘露聚糖结合型凝集素(MBL)相连。
3.权利要求1或2的多肽，其中该多肽包括鉴定为SEQ ID NO 5的氨基酸序列或SEQ ID NO 5的功能等价体。
4.前述任一权利要求的多肽，其中所述多肽包括鉴定为SEQ ID NO 1的氨基酸序列或SEQ ID NO 1的功能等价体。
5.前述任一权利要求的多肽，其中所述多肽包括鉴定为SEQ ID NO 2的氨基酸序列或SEQ ID NO 2的功能等价体。
6.前述任一权利要求的多肽，其中所述多肽包括鉴定为SEQ ID NO 3的氨基酸序列或SEQ ID NO 3的功能等价体。
7.前述任一权利要求的多肽，其中所述多肽与标记物或毒素偶联。
8.前述任一权利要求的多肽，其中所述多肽在非还原条件下通过SDS-PAGE测定其分子量约为110kDa。
9.权利要求8的多肽，所述多肽包括鉴定为SEQ ID NO 5的序列。
10.前述任一权利要求的多肽，其中所述多肽在还原条件下通过SDS-PAGE测定其分子量约为48kDa。
11.权利要求10的多肽，所述多肽包括鉴定为SEQ ID NO 5的序列。
12.权利要求1的多肽，所述多肽具有丝氨酸蛋白酶活性。
13.前述任一权利要求的多肽，其中所述多肽在对补体功能的MBL途径进行的体外检测中具有MASP-3活性。
14.前述任一权利要求的多肽，其中所述多肽能够竞争性抑制MASP-3丝氨酸蛋白酶活性。
15.权利要求1的多肽或包含多肽SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ IDNO 3或SEQ ID NO 5的片段的多肽，所述多肽是MBL/MASP-3复合的竞争性抑制因子。
16.编码权利要求1-15任一项的多肽的分离的核酸分子，该分子包含编码具有与SEQ ID NO 1，2，3或5至少50％同一性的序列的多肽的核苷酸序列。
17.权利要求16的分离的核酸序列，其编码具有与SEQ ID NO5至少85％同一性的多肽序列并与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶-3(MASP-3)。
18.权利要求16的分离的核酸序列，其编码与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶-3(MASP-3)，该核酸序列与SEQ ID NO4有至少85％的同一性。
19.包含权利要求16，17或18任一项的核酸分子的核酸载体。
20.权利要求19的核酸载体，其中该载体是表达载体。
21.权利要求20的载体，其还包含调控元件。
22.包含权利要求19-21任一项定义的载体的细胞。
23.包含如权利要求16-18任一项中定义的核酸序列的细胞。
24.权利要求22或23任一项的细胞，其选自酵母细胞或细菌细胞。
25.一种抗体，其通过将权利要求1-15任一项定义的MASP-3多肽，或所述MASP-3多肽的一部分，或编码任一种所述多肽的DNA为了产生抗体的目的而对动物给药来产生。
26.选择性结合MASP-3的抗体。
27.权利要求19或20的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或遗传工程抗体或抗体片段。
28.权利要求19，20或21的抗体，该抗体与包含可检测标记的化合物偶联。
29.能抑制MBL与MASP-3形成复合物的化合物。
30.权利要求29的化合物，该化合物包含权利要求1-15任一项的多肽。
31.权利要求29的化合物，该化合物包含权利要求25-28任一项定义的抗体。
32.能破坏MBL与MASP-3的复合物形成的化合物。
33.权利要求32的化合物，该化合物包含权利要求1-15任一项的多肽。
34.权利要求32的化合物，该化合物包含权利要求25-28任一项定义的抗体。
35.能竞争性抑制MASP-3或其片段的丝氨酸蛋白酶活性的化合物。
36.权利要求35的化合物，该化合物包含权利要求1-15任一项的多肽。
37.权利要求35的化合物，该化合物包含权利要求25-28任一项定义的抗体。
38.一种药物组合物，其包含权利要求1-15任一项的多肽，或权利要求25-28任一项定义的抗体，或权利要求29-37任一项定义的化合物。
39.一种检测生物样品中与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶-3(MASP-3)的方法，该方法包括如下步骤(a)得到生物样品；(b)将该生物样品与特异性结合MASP-3的MASP-3多肽特异性结合配偶体接触；(c)检测所述复合物，如果有，则指示该样品中存在与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶-3。
40.权利要求39的方法，其中所述特异性结合配偶体是权利要求25-28任一项的抗体。
41.权利要求39的方法，其中所述特异性结合配偶体是甘露聚糖结合型凝集素(MBL)。
42.确定MASP-3活性的方法，该方法包括对MASP-3活性的分析，包括如下步骤-将含有MBL/MASP-2复合物的样品加载至固相上以便得到结合的复合物，-将预定量的MASP-3加载至所述结合的复合物中，-将至少一种补体因子加载至所述复合物中，-检测裂解的补体因子的量，-将裂解的补体因子的量与MASP-3的量相关联，并且-确定MASP-3的活性。
43.权利要求42的方法，其中所述固相是甘露聚糖涂层。
44.权利要求42-43任一项的方法，其中所述至少一种补体因子是可被MBL/MASP-2复合物裂解的补体因子。
45.权利要求42-44任一项的方法，其中所述至少一种补体因子选自C3，C4和C5，优选C4。
46.权利要求42-45任一项的方法，其中所述裂解的补体因子是通过针对该补体因子的抗体检测的。
47.权利要求42-46任一项的方法，其中经典补体途径的活化作用受到抑制。
48.权利要求47的方法，其中所述活化通过使所述检测在高离子强度下进行而受到抑制。
49.权利要求48的方法，其中所述盐浓度范围为0.3M到10M，如0.5-5M，如0.7-2M，如0.9-2M，如约1.0M。
50.权利要求49的方法，其中所述盐选自NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，NaI，KCl，MgI2，CaI2，选自NaBr，KBr，MgBr2，CaBr2，Na2SO3，(NH4)2SO4，和NH4HCO3。
51.权利要求42-50任一项的方法，所述方法用于定量分析生物样品中的MASP-3或MASP-3活性。
52.检测MASP-3核酸表达的方法，包括将样品与核酸探针混合以检测具有编码MASP-3多肽的序列的RNA，所述核酸探针在严谨条件下能与权利要求16-18任一项定义的核酸特异性杂交。
53.治疗MASP-3缺陷型病人的方法，其通过对病人给药权利要求1-15任一项定义的多肽来进行治疗。
54.治疗MASP-3缺陷型病人的方法，其通过对病人给药权利要求16-18任一项定义的核酸来进行治疗。
55.抑制MASP-3的活性的方法，其通过对受试者给药一种能抑制MASP-3的表达或活性的化合物来进行治疗。
56.权利要求55的方法，其中所述化合物是MASP-3反义核酸序列。
57.权利要求55的方法，其包括给药一种能抑制MBI与MASP-3形成复合物的化合物。
58.权利要求57的方法，其中所述化合物如权利要求29-37任一项所定义。
59.一种对编码MASP-3的核酸序列的多态性进行分析的测定法。
60.一种检测样品中编码MASP-3的核酸的存在的方法，包括将样品与至少一种核酸探针混合，并确定所述探针是否与样品核酸结合，其中所述探针能与编码MASP-3的核酸在严谨条件下形成复合物。
61.一种能在严谨条件下与编码MASP-3的核酸形成复合物的核酸探针。
62.权利要求61的核酸探针，其为能与相同于SEQ ID NO 5的核酸序列杂交的核酸序列。
63.权利要求61或62的核酸探针，其相对于编码MASP-3的核酸序列而言是反义核酸。
64.一种对包含MASP-3或其前体的多肽序列的多态性进行检测的测定法。
65.一种诊断与MASP-3表达异常有关的疾病的方法，包括从患者获得生物样品并测定该样品中MASP-3的表达，其中该生物样品中的MASP-3表达与对照相比升高或降低指示该患者患有与MASP-3表达异常有关的疾病。
66.一种诊断与MASP-3活性异常有关的疾病的方法，包括从患者获得生物样品并测定该样品中MASP-3的活性，其中该生物样品中的MASP-3活性相对于对照升高或降低指示该患者患有与MASP-3活性异常有关的疾病。
67.权利要求1-15任一项定义的多肽在制备药用组合物中的用途。
68.权利要求67的用途，其中所述药用组合物能肠道外给药，如肌肉，静脉或皮下给药。
69.权利要求67的用途，其中所述药用组合物能口服给药。
70.权利要求67-69的用途，其中所述药用组合物适于治疗MASP-3缺乏。
71.权利要求67-69的用途，其中所述药用组合物适于治疗免疫系统疾病，或治疗recoxygenated缺血组织。
72.权利要求29-37任一项的化合物在制备药用组合物的用途。
73.权利要求72的用途，其中所述药用组合物能肠道外给药，如肌肉，静脉或皮下给药。
74.权利要求72的用途，其中所述药用组合物能口服给药。
75.权利要求72-74任一项的用途，其中所述药用组合物适于治疗MASP-3活性异常。
76.权利要求72-74任一项的用途，其中所述药用组合物适于治疗感染，癌症，MBL缺陷，免疫系统和生殖系统的疾病。
全文摘要
本发明涉及与甘露聚糖结合型凝集素相连的丝氨酸蛋白酶－3(MASP－3)的发现及鉴定，这是一种在MBLectin补体固定途径起作用的新的丝氨酸蛋白酶。
文档编号A61K35/76GK1433466SQ00818674
公开日2003年7月30日 申请日期2000年11月30日 优先权日1999年12月2日
发明者詹斯·C·詹斯尼厄斯, 斯蒂芬·蒂尔 申请人:詹斯·C·詹斯尼厄斯, 斯蒂芬·蒂尔