一种琼脂糖酶的固定化方法
【技术领域】
[0001] 本发明所属酶工程研究开发技术领域。本发明涉及壳聚糖微球固定化琼脂糖酶的 方法研究，适合工业化生产。
【背景技术】
[0002] 琼胶是一种重要的海藻多糖，主要由琼胶糖和硫琼胶组成。琼胶酶降解琼胶糖，根 据其作用方式不同，可以把琼胶酶分为两类：α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶裂解琼 胶糖的α_1，3-糖苷键，生成以β-D-半乳糖为非还原性末端和以3,6_内醚-α-L-半乳 糖为还原性末端的琼寡糖列；β-琼胶酶裂解琼胶糖的β-1，4-糖苷键，生成以β-D-半乳 糖为还原性末端和以3,6-内醚-a-L-半乳糖为非还原性末端的新琼寡糖系列。琼胶酶降 解过程具有得率高、污染小和产物的安全性高等优点，是降解琼胶糖最有潜力的方法。
[0003] 琼胶酶降解琼胶糖生产琼寡糖产品已广泛应用于食品业，化妆品业和医药工业， 例如作为天然的防腐剂、淀粉老化抑制剂、功能性食品基料、抗氧化剂等。同时琼胶酶在海 藻的单细胞分离、酶解破壁制备原生质体等过程具有重要的使用价值，是一种海藻遗传工 程的工具酶；在分子生物学方面，利用琼胶酶降解琼胶糖从琼胶糖凝胶中回收DNA和RNA， 已经被证明是最好的方法之一；琼胶酶也用于海藻多糖的结构研究，用琼胶酶水解某些海 藻的多糖，测定其水解产物的结构，进而推测多糖的结构，是行之有效的方法。
[0004] 但目前该酶的应用研究主要是对游离酶，但游离酶稳定性差，保质期短，重复利用 率低，往往使应用成本增高而限制了其应用。所以在酶的应用研究中，固定化酶的研究是生 物技术领域中新兴的一门技术。
[0005] 酶的固定化是指用载体材料将酶限制于一定空间内进行催化反应，固定化酶可回 收及反复连续利用的一类技术。固定化酶保留了游离酶高效专一、温和的催化性质，同时又 克服了游离酶的缺点，具有高稳定性、易分离纯化、回收使用、操作简便等优点。然而，广泛 投入工业化应用的固定化酶却不多。因此，进一步开发更经济适用的固定化方法，使更多的 酶取得工业上的广泛应用，仍是科技工作者追求的目标。
[0006] 酶的固定化方法常用的是：吸附法、交联法、共价结合和法包埋法。在此基础上还 出现了上述方法的结合法等
[0007] 酶固定化研究中，良好的载体是固定化酶成功的关键。所以在酶固定化领域，作为 固定化载体的筛选和制备就成为了主要研究方向。
[0008] 甲壳素是由乙酰胺基葡萄糖以β_1，4链连接而成的天然线性高聚物，是自然界 中仅次于纤维素的第二可再生资源。壳聚糖是甲壳素经脱乙酰化反应得到的产物，分子结 构中含有丰富的游离氨基。选择壳聚糖作为固定化载体是基于它来源丰富，具亲水性，生物 相容性以及抗微生物分解特性等。壳聚糖氨基与戊二醛基形成schiff碱，在胶囊表面形成 一层致密的保护膜，可增加微胶囊球的强度，这就是吸附-交联法固定化酶。
[0009] 由于目前琼脂糖酶的固定化国内外还没人研究，所以利用廉价的壳聚糖作为固定 化载体固定琼脂糖酶具有较大的理论和实践意义。而本方法研究的目的是开发壳聚糖的应 用领域，并可以增强琼脂糖酶在工业、医学、食品、环境保护等领域的应用。
【发明内容】
[0010] 1.本发明涉及用壳聚糖固定化琼脂糖酶的方法，其特征在壳聚糖固定化琼脂糖酶 的方法，包括以下过程：
[0011] 步骤（一）：用1.5-2% (V/V)乙酸配制1 : 20 (W/V)的壳聚糖溶液，充分溶解；
[0012] 步骤（二）：将步骤（一）的壳聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氢氧化钠溶液中，壳聚 糖将凝聚成白色颗粒，过滤收集壳聚糖珠；
[0013] 步骤（三）：将步骤（二）的壳聚糖珠用蒸馏水洗涤至中性；
[0014] 步骤（四）：将步骤（三）的壳聚糖珠用0· 2m〇l/L、pH7. 6的磷酸缓冲溶液浸泡过 夜；
[0015] 步骤（五）：取步骤（四）中的壳聚糖珠载体2.5-5g，加入2.5 %的戊二醛 20-25ml，水浴振荡0. 5小时，室温交联5-6小时，磷酸缓冲液冲洗壳聚糖珠交联载体；
[0016] 步骤（六）：在步骤（五）中的壳聚糖珠交联载体中加入10_15mL稀释的琼脂糖 酶液，搅拌均匀，4°C固定2-3小时，用磷酸缓冲液冲洗；
[0017] 步骤（七）：将步骤（六）中的固定化酶抽真空得到固定化琼脂糖酶。
[0018] 2.根据本发明所述的制备固定化琼脂糖酶的载体是壳聚糖微球。
【附图说明】
[0019] 图1是pH值对酶活性的影响图，图2是温度对酶活性的影响图，图3是游离酶和 固定化酶的热稳定性图。
【具体实施方式】
[0020] 本发明所述的涉及壳聚糖微球固定化琼脂糖酶方法包括以下实施例，下面的实施 例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0021] 实施例1 :pH值对酶活性的影响
[0022] 平行取制备好的壳聚糖固定化酶0. 5g和相应的游离酶，在不同pH(4. 0-9. 0)条件 下分别加底物与游离酶及固定化酶作用，分别测定其酶活力，结果如图1所示。
[0023] 图1表明，游离酶的最适pH值为8. 0,随着pH值的升高酶活性下降；对固定化酶而 言，在本实验条件下，当pH值达到8. 5的时候酶活性达到最大值，固定化使酶的最适pH往 碱性方面升高0. 5个单位，符合酶和载体结合后的基本规律。
[0024] 实施例2 :温度对酶活性的影响
[0025] 平行取制备好的壳聚糖固定化酶0. 5g和相应的游离酶，在不同温度（30°C_80°C) 条件下分别加底物与游离酶及固定化酶作用，分别测定其酶活力，结果如图2所示。
[0026] 由图2可知，游离琼脂酶在40°C下表现出最高活力，随温度升高，活力急剧下降， 酶开始失活，但对固定化酶而言，在40_60°C范围内均有较大酶活，50°C时酶活力达最大值， 固定化酶耐热性显著提高。
[0027] 实施例3 :游离酶和固定化酶的热稳定性
[0028] 平行取制备好的壳聚糖固定化酶0. 5g和相应的游离酶，在不同温度（20°C_80°C) 条件下保温0. 5h，然后加底物与其作用，分别测定其酶活力，结果如图3所示。
[0029] 由图3可知，酶液在40 °C以下短暂保温对酶活影响较小，温度进一步提升至50°C 时对游离酶活性影响增加，损失约为27. 36%，而对固定化酶活力影响仍较小。在60°C时， 游离酶的活性很低，而固定化酶活约为50%，70°C时酶基本都已完全没有活性，说明固定化 酶的热稳定性高于游离酶。
[0030] 实施例4 :固定化酶的操作稳定性
[0031] 取固定化酶0. 5g，加0. 5%琼脂糖底物1. 5ml与之反应，连续操作6次，分别测定 6次反应后的酶活力大小，结果如表1。
[0032] 表1固定化琼脂酶的操作稳定性
[0033]
[0034] 酶的稳定性可以从反应的产物（还原糖）收率来衡量。而产物的收率可以间接的 从酶活力的大小来判断。因此，从表1可以看出，在使用第1次的时候固定化酶有较高的活 力，说明还原糖的量较高，也就是说产物的收率较高；第2次以后固定化酶活力略有减少， 随着使用次数的增加，酶活力虽然逐渐减小，但使用6次后酶活力仍有83.8左右。说明固 定化琼脂酶具有固定化酶的显著特点，即可重复利用性。
[0035] 实施例5 :固定化琼脂酶对琼脂糖的转化及转化率
[0036] 准确称取取固定化琼脂酶0. 5g，加0. 5%琼脂糖底物1. 5ml与之反应，加入2ml缓 冲液，在50°C下酶解lh，测其转化率，其平均转化率可达92. 6 %。
[0037] 实施例6 :固定化琼脂糖酶的稳定性
[0038] 在最佳条件下所得固定化酶，其活力回收为77. 6%，在室温下贮存4个月，测得活 力回收72.8% .可见，固定化琼脂糖酶的稳定性优良。
【主权项】
1. 琼脂糖酶固定化的方法，其特征在于用壳聚糖微球固定化琼脂糖酶。包括以下过 程： 步骤（一）：用1.5-2% (V/V)乙酸配制1 : 20(W/V)的壳聚糖溶液，充分溶解； 步骤（二）：将步骤（一）的壳聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氢氧化钠溶液中，壳聚糖将 凝聚成白色颗粒，过滤收集壳聚糖珠； 步骤（三）：将步骤（二）的壳聚糖珠用蒸馏水洗涤至中性； 步骤（四）：将步骤（三）的壳聚糖珠用〇· 2mol/L、ρΗ7·6的磷酸缓冲溶液浸泡过夜； 步骤（五）：取步骤（四）中的壳聚糖珠载体2. 5-5g，加入2. 5%的戊二醛20-251111，水 浴振荡〇.5小时，室温交联5-6小时，磷酸缓冲液冲洗壳聚糖珠交联载体； 步骤（六）：在步骤（五）中的壳聚糖珠交联载体中加入10_15mL稀释的琼脂糖酶液， 搅拌均匀，4°C固定2-3小时，用磷酸缓冲液冲洗； 步骤（七）：将步骤（六）中的固定化酶抽真空得到固定化琼脂糖酶。2. 根据本发明所述的制备固定化琼脂糖酶的载体是壳聚糖。
【专利摘要】本发明所属酶工程研究开发技术领域。本发明涉及一种琼脂糖酶的固定化方法研究。用1.5-2％(V/V)乙酸配制1：20(W/V)的壳聚糖溶液，充分溶解；溶解后的壳聚糖溶液逐滴滴入1mol/L氢氧化钠溶液中，过滤收集壳聚糖珠；用蒸馏水洗涤至中性，再用0.2mo1/L、pH7.6的磷酸缓冲溶液浸泡过夜；取浸泡的壳聚糖珠载体2.5-5g，加入2.5％的戊二醛20-25ml，水浴振荡0.5小时，室温交联5-6小时，磷酸缓冲液冲洗壳聚糖珠交联载体；在壳聚糖珠交联载体中加入10-15mL稀释的琼脂糖酶液，搅拌均匀，4℃固定2-3小时，用磷酸缓冲液冲洗；抽真空得到固定化琼脂糖酶。本发明制备固定化酶的方法，载体廉价易得，工艺简单，条件温和，对酶活性损失小，酶活回收率可达到77.6％。
【IPC分类】C12N11/04, C12N11/10
【公开号】CN105349518
【申请号】CN201510251158
【发明人】李晓梅
【申请人】菏泽家政职业学院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年5月14日