专利名称：一种Thermus脂肪酶的固定化方法
技术领域：
本发明涉及一种脂肪酶的固定化方法，特别涉及一种Thermus脂肪酶的固定化方法。背景技术：
脂肪酶(lipase，EC3.1.1. 3)是一类特殊的酰基水解酶，能够在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构体拆分等化学反应。 迄今为止已分离提纯了来源于动植物和微生物的各种脂肪酶，目前被广泛研究的一种酶催化剂，被广泛地应用于洗涤剂、油脂与食品加工、有机合成、表面清洗、医药、化妆品、香料、 皮革与造纸工业、生物柴油的制备、油脂改性等方面的研究。
Thermus脂肪酶是从深海热液口等高温环境中的嗜热微生物(>55°C )中分离得到的一类嗜热性脂肪酶，具有常规中温酶(20°C飞5°C )及低温酶(<20°C )无法比拟的优点， 由于嗜热酶的高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使它在食品、 医药、制革、石油开采及生物柴油等方面都有广泛的应用潜力。但由于酶的价格昂贵、难以回收且在反应过程中易失活等原因，很大程度上限制了它在工业化生产中的应用。所谓酶的固定化，就是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶通过固定化后可以提高活力和稳定性，而且易于回收重复使用，因此酶固定化技术被广泛地应用，以降低生产成本、提高生产效率。
发明内容
本发明目的是提供一种Thermus脂肪酶的固定化方法，为热稳定嗜热酶类 (Mn-SOD)的固定化和应用提供一 种新的策略。
本发明采用的技术方案是
一种Thermus脂肪酶的固定化方法，所述方法为将氨基化纳米磁性载体Fe3O4/ SiO2与pH8. O的缓冲溶液混合，加入质量浓度25%的戊二醛水溶液，室温下磁力搅拌4h， 再加入以所述Tris-HCl缓冲溶液溶解的Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的缓冲溶液，室温下磁力搅拌3. 5h，磁分离，弃去上清液a，将沉淀a用缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得固定化的Thermus脂肪酶；所述Thermus脂肪酶按下述方法获得将序列号为 AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因以大肠埃希氏杆菌(优选E. Coli BL21(DE3))为宿主细胞进行重组，获得含有Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌CGMCC NO :1. 12252 ;将含有 Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌CGMCC NO :1. 12252的单菌落接种于LB液体培养基中，37°C、250rpm培养4h，获得培养液a，取培养液a以体积分数1%的接种量接种于新鲜 LB液体培养基中，37°C、250rpm培养3h，获得培养液b，在培养液b中加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为O. 5mM, 37°C下培养4h，离心，将沉淀b加入pH7. 9的BufferA 缓冲液中，在IOKHz频率下进行超声裂解，离心，取上清液b进行Ni柱亲和层析，洗脱液经孔径7KDa的透析膜透析(MWC07kDa，ThermoSCIENTIFIC)后，取截留液冷冻干燥，获得所述Thermus脂肪酶。
进一步，所述氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02按如下方法制备(1)将氯化铁和氯化亚铁以物质的量之比3:2混合后，加水配制成混合液，在氮气氛围中，将混合液在30°C 下搅拌5min后，分别依次逐滴滴加质量浓度25%的氨水溶液a和聚乙二醇，滴加完毕后， 在60°C条件下继续通入氮气反应30min后，将反应液在53KHz下超声分散5min，室温下自然冷却至25°C后进行磁分离，取沉淀c用超纯水洗涤至中性后干燥，获得Fe3O4纳米颗粒； 所述水的体积用量以氯化铁和氯化亚铁中铁的总物质的量计为4600ml/mol ;所述氨水溶液a的体积用量以氯化铁和氯化亚铁中铁的总物质的量计为400ml/mol，所述聚乙二醇的体积用量以氯化铁和氯化亚铁中铁的总物质的量计为200ml/mol ;所述聚乙二醇的分子量为4000 ; (2)将Fe3O4纳米颗粒与无水乙醇、水和质量浓度25%的氨水溶液b混合，在53KHz 下进行超声分散lh，然后在室温下搅拌，同时缓慢滴加正硅酸乙酯，滴加完毕后室温反应 12h，反应完毕后，将反应液进行磁分离，沉淀d用蒸馏水洗涤至中性，再将洗涤后的沉淀 d在lmol/L的盐酸中室温浸泡12h，磁分离，去除盐酸后将沉淀e水洗至中性，干燥，获得 Fe304/Si02复合颗粒；所述无水乙醇、水的体积用量以Fe3O4纳米颗粒质量计分别为80ml/g、 20ml/g，所述的氨水溶液b体积用量以Fe3O4纳米颗粒质量及为2. 5ml/g ;所述正硅酸乙酯的体积用量以Fe3O4纳米颗粒质量计为1. 5ml/g ; (3)将Fe304/Si02复合颗粒加入无水乙醇中，在53KHz下超声分散Ih后，加入质量浓度25%的氨水溶液c继续在53KHz下超声分散 lOmin，然后通入氮气保护，在搅拌的条件下滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷，同时在50°C反应 8h，反应结束后将反应液在室温下自然冷却至25°C，磁分离，沉淀用蒸馏水洗涤至中性，再用无水乙醇洗涤后干燥，获得所述氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02 ;所述Fe304/Si02复合颗粒与无水乙醇、氨水溶液c和3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量体积比分别为1:60、1 :6、1 :4。
进一步,所述氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02与pH8. O的缓冲溶液混合配制成载体终浓度10mg/mL的混合液。进一步，所述戊二醛水溶液的体积用量以氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02质量计为 19.05ml/g。
进一步，所述Thermus脂肪酶与氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02的质量比为 O. 0925 lo
更进一步，所述的Thermus脂肪酶的固定化方法推荐按如下步骤进行将氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02与pH8. O的Tris-HCl缓冲溶液混合制成载体终浓度10mg/mL的混合液，再加入质量浓度25%的戊二醛水溶液，室温下磁力搅拌4h，然后加入Thermus脂肪酶的Tris-HCl缓冲溶液，室温下磁力搅拌3. 5h，磁分离，弃去反应液，将沉淀用pH8. O的 Tris-HCl缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得所述固定化的Thermus脂肪酶；所述戊二醛水溶液的体积用量以氨基化纳米磁性载体？6304/5;102质量计为19. 05ml/g ;所述Thermus脂肪酶与氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02的质量比为O. 0925 :1。
本发明所述将序列号为AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)以大肠杆菌E. ColiBL21 (DE3)为宿主细胞进行重组，获得含有Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌，并于2012年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号CGMCC NO,1. 12252，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所。
本发明所述的沉淀沉淀e均为沉淀，为便于区分不同步骤获得的沉淀不同而命名，所述培养液a和培养液b均为培养液，为便于区分不同步骤获得培养液不同而命名，所述氨水溶液a 氨水溶液c均为氨水溶液，为便于区分不同步骤加入的量不同而命名，字母本身没有含义。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在(I)本发明所述固定化Thermus脂肪酶对热有较高的耐受范围(40-100°C )；(2)对极端pH值有较宽的适应性(4. 0-9. O) ; (3) 对金属离子(Ba2+，Ca2+，Cu2+，Fe3+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Na+，K+)，酶抑制剂(EDTA，2-ME，SDS, PMSF 或DTT)及去污剂(Tween20，Chaps和Triton X-100)有较强的耐受性；(4)具有极好的超顺磁性，易磁分离回收，较好的操作稳定性。
图1Thermus 脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的凝胶电泳图图中 15、20、25、 30、100表示蛋白质分子量标准,单位为千道尔顿(kDa), M为蛋白marker ;泳道I为纯化的 His-Thermus脂肪酶融合蛋白；泳道2为未经IPTG诱导的非重组菌株；泳道3为经IPTG诱导的非重组菌株；泳道4为未经IPTG诱导的重组菌株；泳道5为经IPTG诱导后的重组菌株；泳道6为经IPTG诱导后的重组菌株超声破碎、离心后上清，A为含有6个组氨酸(His) 标签的Thermus脂肪酶。
图2嗜热Thermus脂肪酶固定化流程 示意图:A表示Fe3O4纳米颗粒,B表示Fe3O4/ SiO2复合纳米颗粒，C表示氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02, D表示Thermus脂肪酶固定到氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02表面。图3Thermus脂肪酶固定化效果的SDS-PAGE图，泳道M :蛋白分子量标准；泳道1:游离Thermus脂肪酶；泳道2 :固定化Thermus脂肪酶磁分离上清液；泳道3 :固定化Thermus脂肪酶微球，A为Thermus脂肪酶。
图4固定化Thermus脂肪酶透射电镜图。
图5载体和固定化Thermus脂肪酶微球的磁滞回线，实心圆点线(~#~)表示固定化Thermus脂肪酶微球,空心圆点线(~o~)表示载体。
图6固定化Thermus脂肪酶微球的磁响应图，实心圆点线(_*_)表示磁场组,空心圆点线(—O—)表不重力场组。
图7固定化Thermus脂肪酶微球的磁响应照片，A表示永久磁铁,B表示磁场组，C 表示重力场组。
图8温度对游离和固定化Thermus脂肪酶酶活的影响,实心圆点线(~#~)表示固定化Thermus脂肪酶,空心圆点线(~o~)表示游离Thermus脂肪酶。
图9pH对游离和固定化Thermus脂肪酶酶活的影响，实心圆点线(_*_)表示固定化Thermus脂肪酶,空心圆点线(~0~)表示游离Thermus脂肪酶。
图10金属离子对游离和固定化Thermus脂肪酶酶活的的影响，实心柱体(■)表示固定化Thermus脂肪酶,空心柱体(CZ])表示游离Thermus脂肪酶。
图11抑制剂和去污剂对游离和固定化Thermus脂肪酶酶活的影响，阴影柱体 (_ )表示固定化Thermus脂肪酶,空心柱体(EZZl)表示游离Thermus脂肪酶。
图12固定化Thermus脂肪酶的操作稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照规定条件如Sambrook所著的《分子克隆实验手册》(New York Cold Spring Harbor Laboatory Press, 2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明所述的室温是指2(T25°C。
His-tag融合蛋白纯化方法(Ni柱)
I) 250ml诱导菌液,离心(5000g, IOmin)取沉淀，重悬在15ml bufferA ;重悬的菌液转移至50ml离心管,冰浴状态下超声波处理(50%, IOmin, 2次,打5s间歇5s)至半透明；
2)超声处理的菌液在18000g，4°C离心20min，取上清；
3)把Ni+介质用Mil1-Q水洗两次，再用Buffer A平衡，然后加入上清，4° C轻摇 Ih,上柱(留样20 μ I用于SDS-PAGE分析)，收集的流出液再重复上柱两次；
4)用20ml Buffer B洗漆介质，共4 5次；
5)用20ml Buffer C洗漆介质，共4 5次；
6)加入O. 5ml Buffer D,当液体流尽后关闭流液口，然后加入O. 5mlBuffer D浸泡5min，打开流液口收集洗脱液，再重复洗脱4次，共收集5管洗脱样品；
7)洗脱液置于 IOcm 长的透析袋(MWC07kDa, ThermoSCIENTIFIC)中，在 IL miI1-Q 水中，200rpm磁力搅拌下透析Ih后换mil1-Q水，重复6次。
8)透析后转移到50mL离心管中，于-80°C预冷Ih后，用真空冷冻干燥机 (7670530, LABC0NC0)在 _40°C抽干。
LB液体培养基终质量浓度组成为蛋白胨1%，酵母膏O. 5%，NaClO. 5%，溶剂为水。
实施例1. Thermus 脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的制备
Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)源于深海热液口分离的嗜热菌 (Thermus thermophilus WL)。Thermus 脂肪酶(Thermus thermophilus WL)基因长度为 486bp,含一个编码161个氨基酸的阅读框(Genbank序列注册号AAS81965.1)。
当用大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)为宿主细胞时，得到含Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏菌[Escherichia coli BL21 (DE3)],该菌株已于2012年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No :1. 12252。
所述Thermus脂肪酶的制备方法为
(I)游离Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的制备挑取上述含有 Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏菌单菌落于5ml LB液体培养基(含Kan50 μ g/ml )，37°C 摇培过夜，获得培养液，然后将培养液以体积分数1%的接种量接种至250ml新鲜LB液体培养基中，再在37°C摇床培养3h后(0D_约0. 6)，获得培养液，取0.1ml培养液在凝胶电泳仪(DYY-6C，北京市六一仪器厂)上进行凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果见图1中的泳道 4所示；剩余培养液中加入异丙基_β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度0. 5mM,37°C 诱导培养4h，培养结束后，将培养液离心，去上清，取15 μ g沉淀进行凝胶电泳(SDS-PAGE) 分析，结果见图1中的泳道5所示，将沉淀用20ml的Buffer A(pH7. 9)重悬，IOKHz下超声 (VCX500，SONICS)裂解菌体20min，离心去沉淀，上清中的重组蛋白Thermus脂肪酶用Ni柱进行亲和纯化，获得游离Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL),并进行凝胶电泳分析，结果见图1中的泳道I所示。
(2)非重组菌株的培养
挑取非重组菌株，即大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)于5ml LB液体培养基(含 Kan50l·! g/ml)，37°C摇培过夜，获得培养液，然后将培养液以体积分数1%的接种量接种至5ml新鲜LB液体培养基中，再在37 °C摇床培养3h后(0D600约O. 6)，取O.1ml培养液在凝胶电泳仪(DYY-6C，北京市六一仪器厂)上进行凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果见图1中的泳道2所示，剩余培养液中加入异丙基_β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度 O. 5mM, 37°C诱导培养4h，培养结束后，将培养液离心，去上清，取15 μ g沉淀进行凝胶电泳 (SDS-PAGE)分析，结果见图1中的泳道3所示。
实施例2.载体制备及Thermus脂肪酶固定化
(I)高性能磁性纳米球(即Fe3O4纳米颗粒)的制备
Fe3O4纳米颗粒采用改进的化学共沉淀法制备，反应式为
Fe2++2Fe3++80H- — Fe304+4H20
具体过程分别称取4. 054g FeCl3 ·6Η20 和1. 988g FeCl2 ·4Η20(考虑 Fe2+ 在制备及后续过程中的氧化作用，选定Fe3YFe2+物质的量比为3/2)置于50mL烧杯中，加入25mL 双蒸水溶解后再加入90mL双蒸水混合配成115mL混合溶液，将混合溶液加入500mL三颈瓶中，通入氮气，在水浴30°C下机械搅拌(转速IOOOrpm) 5min后,用注射器(直径O. 7mm)先后逐滴加入质量浓度25%NH3 -H2OlOmL和PEG (分子量4000) 5mL,将水浴温度升至60°C，继续搅拌并通N2, 30min后将反应液倒入150mL烧杯中，53KHz下超声(SK30GT，上海科导超声仪器有限公司)分散5min，室温下自然冷却至25°C (约Ih)后，磁分离(即用永久磁铁吸附)，弃去上清液，将沉淀分别用Mil1-Q水反复洗涤至pH值为7. 0，得磁流体，-40°C真空烘干24h， 获得Fe3O4纳米颗粒，备用。
(2)Fe304/Si02复合颗粒的制备
称取2g上述Fe3O4纳米颗粒于250ml的三口瓶中，加入160ml无水乙醇，40ml水和5ml质量浓度25%的氨水溶液，53KHz下超声波分散I小时后，室温下机械搅拌(转速为 IOOOrpm),同时以1. 5ml/min的速度缓慢滴加3. Oml正硅酸乙酯(TEOS)，滴加完毕后室温反应12小时，将反应液用永久磁体进行磁分离，取沉淀用蒸馏水反复洗至中性，同时洗涤液不会变浑浊，然后将洗涤后的沉淀中加入lmol/L的盐酸水溶液15ml，室温浸泡12小时，磁分离后，将沉淀再用蒸馏水洗至中性，于室温下真空干燥24小时，即得Fe304/Si02复合颗粒 3g。
(3)高性能磁性高分子纳米球(即氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02)制备
3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对Fe3O4纳米颗粒的化学改性是通过硅烷的乙氧基水解后形成的硅羟基与Fe304/Si02复合颗粒表面的硅羟基缩合而完成。具体实验步骤如下称取Ig上述制备的Fe304/Si02复合颗粒于装有60ml无水乙醇的三口瓶中，53KHz 下超声波(SK30GT，上海科导超声仪器有限公司)分散I小时后，加入6ml质量浓度25% 的NH3 · H2O,再用超声波在53KHz分散lOmin，然后通氮气保护，在匀速机械搅拌(转速为 IOOOrpm)下滴加4ml3_氨丙基三乙氧基硅烷，同时水浴升温至50°C并保持8小时，反应结束后将反应液在室温下自然冷却至25°C，用永久磁体进行磁分离，取沉淀用蒸馏水反复洗至中性，再用乙醇洗涤:Γ5次至液面无白色漂浮物，以除去产物中未反应的硅烷，最后将产物于室温下真空干燥24小时，即得氨基化纳米磁性载体Fe3CVSiO2L 2g。
(4)Thermus 脂肪酶(Thermus thermophilus WL)固定化
由于Fe304/Si02复合颗粒经过APTES的化学改性，其表面富含氨基，故本实验以戊二醛等为双功能试剂，将Thermus脂肪酶负载到Fe304/Si02_APTES载体上(见图2)。
将O. 20g 的氨基化纳米磁性载体 Fe304/Si02 置于 20ml 的 Tris-HCl (IOOmM, pH8. O) 中，加入3. 81ml的质量浓度25%戊二醛水溶液，室温下磁力搅拌4h后，直接再加入含有 18. 5mg实施例1方法获得的Thermus脂肪酶的Tris-HCl (IOOmM, pH8. 0) 2. 0ml，室温下磁力搅拌3. 5h后，磁分离，取沉淀用上述Tris-HCl缓冲液洗涤3飞次，将洗涤后的沉淀在_40°C 冷冻干燥24h,获得固定化Thermus脂肪酶，固定化流程见图2所示。
实施例3.固定化Thermus脂肪酶酶活测定
脂肪酶酶活的测定以对硝基苯酹月桂酸酯(C12, p-nitrophenyl laurate)作为底物进行测定，参见(Sigurgislad0ttir S, Konraosdottir M, Jonsson A, Kristjansson J, Matthiasson E. Lipase activity of thermophilic bacteria from Icelandic hot springs. Biotechnol Lett. 1993, 15:361-366.)，具体操作如下
I)配制C12溶液将一定量C12溶于无水乙醇中配制成25mM的C12乙醇溶液，避光保存(最好现配现用)。
2)配制稀释酶液试样将实施例2方法获得的固定化Thermus脂肪酶用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8. O )稀释为80mg/L的酶液。将氯化钙用50mM Tris-HCl缓冲液 (pH8. O)配制成终浓度40mM的氯化钙缓冲液，将所述酶液与氯化钙缓冲液及步骤I)配制的 C12乙醇溶液以体积比1:1. 8:0. 2混合制成待测试样液，以50mM Tris-HCl缓冲液(pH8. O) 代替酶液与氯化钙缓冲液及步骤I)配制的C12乙醇溶液混合制成对照液。
3)吸取150 μ L步骤2)配制的待测试样液(即90 μ L缓冲液，50 μ L酶液，10 μ L C12乙醇溶液的混合液)加到一个1. 5ml的离心管(Eppendorf,德国)中，混勻后65°C 水浴20min,然后置于冰上I分钟，IOOOrpm离心I分钟，取上清液在T6新世纪紫外-可见分光光度计405nm波长下测定其吸光值A4tl5，该值指示PNP酯分解后释放出来的游离 p-nitrophenyl (PNP)的量，以不加酶液的对照液作为参照，一单位酶活定义为每分钟释放I μ M对硝基苯酚所需要的脂肪酶的量，获得实施例2方法制备的固定化Thermus脂肪酶的酶活为10354U/g。以同样的方法对实施例1制备的游离Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的酶活为 26000U/g。
实施例4.固定化Thermus脂肪酶理化特性表征
(I)固定化Thermus脂肪酶的固定效果检测
将实施例2方法制备的固定化Thermus脂肪酶颗粒用40 μ LTris-HCl缓冲液 (65mM,pH8. O)重悬，加4X蛋白上样缓冲液13. 3 μ L，沸水煮15min，12000rpm离心5min，取 10 μ L上清液进行SDS-PAGE，结果见图3中的泳道2所示，同时以实施例1方法制备的游离 Thermus脂肪酶及实施例2方法制备的固定化Thermus脂肪酶颗粒在同样条件 下直接进行 SDS-PAGE，结果分别见图3中的泳道I和泳道3所示。
图3结果表明，通过磁分离，相对于游离Thermus脂肪酶(泳道3所示)而言， Thermus脂肪酶固定化微球(泳道I所示)可得到明显条带(18kDa,如图3中箭头A所示)。而磁分离上清液(泳道2所示)中则检测不到相应条带。可见，Thermus脂肪酶确实已固定于经3-APTES修饰的Fe3O4OSiO2纳米颗粒表面。
(2)固定化Thermus脂肪酶透射电镜分析(TEM)
取少量实施例2方法制备的固定化Thermus脂肪酶分散于Mil1-Q水中，通过磁分离水洗三次后，在53KHz下超声分散5min后，取10 μ L分散液滴到铜网(230目碳支持膜， 北京中镜科仪技术有限公司)上，平放风干后在透射电镜(JEM-1200EX，NEC, Tokyo, Japan) 上进行分析，结果见图4所示，取其中100个颗粒，平均粒径18. 4±2. 4nm。
(3)震动样品磁强计(VSM)分析
取一端带棉塞、另一端热封的塑料管(内直径为2mm，材质是塑料)，将实施例2方法制备的冷冻干燥后的固定化Thermus脂肪酶微球至于其内并压实后另一端用棉花塞住， 最终样品管长应为6. 5 7mm，装样前后差重得样品重量为l(Tl5mg。将样品管置于振动样品磁强计(VSM) (LakeShore7410VSM, Lakeshore Cryotronics, USA)中，以实施例 2 方法制备的氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02在同样条件下进行检测作为对照，测定载体和固定化 Thermus脂肪酶的磁滞回线，结果见图5所示。
由图5可以看出载体和固定化Thermus脂肪酶的磁滞回线均无顽磁和剩磁,表明所得氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02和固定化Thermus脂肪酶都具备超顺磁性。同时，其饱和磁化强度分别为67. 6和52. 3emu/g。可见，固定化后饱和磁化强度略有下降，这可能是固定化Thermus脂肪酶将载体包裹,影响了载体的磁性。
(4)固定化Thermus脂肪酶的磁响应性
固定化Thermus脂肪酶的磁响应性是采用紫外-可见分光光度计(T6-新世纪,北京普析通用仪器有限责任公司)在光的波长为600nm处，以测定质量浓度4% (w/w)的固定化Thermus脂肪酶微球的水悬浮液分别在磁场和重力作用下的透光率与时间的关系来评价。
将实施例2方法制备的固定化Thermus脂肪酶微球用水配制成质量浓度4%的水悬浮液作为样品液，将样品液分成两组(磁场组和重力场组)，将磁场组的样品液置于体积 3. 5mL,光径Icm的比色皿中,在磁场(磁场强度约为200高斯)下测试600nm波长处透光率, 以时间为横坐标，以透光率为纵坐标，表示固定化Thermus脂肪酶微球在磁场条件下的磁响应性，结果见图6所示和图7中的A，B所示。
将重力场组的样品液置于体积3. 5mL，光径Icm的比色皿中，在远离磁场仅自然重力场条件下测试600nm波长处透光率，以时间为横坐标，以透光率为纵坐标，表示固定化 Thermus脂肪酶微球在磁场条件下的磁响应性,见图6所示和图7中的C所示。
图6表明，固定化Thermus脂肪酶在只有重力没有磁场存在时,静置60分钟后， 其透光率变化约45%(如图6)，说明固定化Thermus脂肪酶在水中分散良好，具有很高的稳定性，且粒径较小，不易沉淀。而将固定化Thermus脂肪酶置于磁场下，仅10分钟左右，透光率就达到90%，基本上将固定化Thermus脂肪酶从溶液中分离(如图6所示)，说明固定化Thermus脂肪酶在外加磁场下具有优越的磁响应性,能够被快速磁化并分离。固定化 Thermus脂肪酶的这种性能有利于用于生物分子的固定化及催化反应。
实施例5固定化Thermus脂肪酶的性质鉴定
(I)温度对固定化Thermus脂肪酶酶活的影响
将实施例2方法制备的固定化Thermus脂肪酶分成7组(组I为40°C，组2为50°C，组3为60°C，组4为70°C，组5为80°C，组6为90°C，组7为100°C)，分别将各组固定化Thermus脂肪酶在各自温度的水中、pH为8. 0的条件下温育30min,取出后置于冰上5分钟，然后根据实施例3进行酶活测定，同时以实施例1方法制备的游离Thermus脂肪酶在同样条件下测定的酶活作为对照，结果见图8所示。图8表明，65°C为游离Thermus脂肪酶的最佳反应温度,而70°C为固定化Thermus脂肪酶的最佳反应温度，且固定化后，酶对温度耐受性更好。(2) pH值对固定化Thermus脂肪酶酶活的影响将实施例2方法制备的固定化 Thermus脂肪酶分成7组(组f组7的pH值分别为3、4、5、6、7、8、9 )，分别将各组固定化Thermus脂肪酶在各自的pH的缓冲液中，70 V温育30min，根据实施例3进行酶活测定，同时以实施例1方法制备的游离Thermus脂肪酶在同样条件下的酶活作为对照，结果见图9所示。图9结果显示，固定化Thermus脂肪酶在pH4. 0-9. 0都维持80%以上活性；而游离Thermus脂肪酶在pH5. 0-9. 0仅能维持在70%以上活性。pH3. 0时，固定化Thermus脂肪酶比游离Thermus脂肪酶活性提高约50%。可见固定化后,Thermus脂肪酶pH耐受性能更好。(3)金属离子对固定化Thermus脂肪酶酶活的的影响将实施例2方法制备的固定化Thermus脂肪酶分成10组(组I为不加金属离子，组2 组10的金属离子分别为Ba2+，Ca2+，Cu2+，Fe3+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Na+，K+)，分别将各组固定化Thermus脂肪酶根据实施例3进行酶活测定，其中实施例3步骤3)中，吸取150 y L步骤2)配制的待测试样液(即90 ii L缓冲液，50 u L酶液，10 u LC12乙醇溶液的混合液)加到一个1. 5ml的离心管(Eppendorf，德国)中，然后分别吸取各组相应的金属离子盐的水溶液(2M)1. 52 u L，使其终浓度为20mM，混匀后65°C水浴20min，然后置于冰上I分钟，IOOOrpm离心I分钟，取上清液在T6新世纪紫外-可见分光光度计405nm波长下测定其吸光值A4tl5,根据实施例3计算酶活，同时以实施例1方法制备的游离Thermus脂肪酶在同样条件下的酶活作为对照，结果见图10所示。图10结果表明，除Fe3+夕卜，20mM的各金属对固定化Thermus脂肪酶酶活促进比游离酶稍大，分别增强281. 4-513. 4%和230. 8-428. 4%。其中20mM的Cu2+对酶活促进明显。Fe3+由于在测定波长405纳米附近吸收，严重干扰测定。(4)抑制剂及去垢剂对固定化Thermus脂肪酶酶活的的影响将实施例2方法制备的固定化Thermus脂肪酶分成9组(组I为不加抑制剂或去垢齐U，组疒组9的抑制剂或去垢剂分别为EDTA (乙二胺四乙酸二钠盐)、2-ME(P -巯基乙醇)、SDS (十二烷基磺酸钠)、PMSF (苯甲基磺酰氟)、DTT ( 二硫苏糖醇)、TWeen20 (吐温-20)、Triton X-100 (曲拉通X-100)和CHAPS (3-[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸))，分别将各组固定化Thermus脂肪酶根据实施例3进行酶活测定，其中实施例3步骤3)中，吸取150 ii L步骤2)配制的待测试样液(即90 ii L缓冲液，50 ii L酶液，IOii L C12乙醇溶液的混合液)加到一个1. 5ml的离心管(Eppendorf,德国)中,然后分别吸取各组相应的试剂,使抑制剂(EDTA、2-ME、SDS、PMSF 和 DIT)的终浓度为 ImM，去污剂(Tween20、CHAPS 和 TritonX-100)的质量终浓度为0. 1% (Tween20和Triton X-100体积终浓度为0. 1%，CHAPS质量终浓度0. 1%)，混匀后65°C水浴20min，然后置于冰上I分钟，IOOOrpm离心I分钟，取上清液在T6新世纪紫外-可见分光光度计405nm波长下测定其吸光值A4tl5,根据实施例3计算酶活，同时以实施例1方法制备的游离Thermus脂肪酶在同样条件下的酶活作为对照，结果见图11所示。图11结果显示，EDTA、2-ME、PMSF和DTT对游离Thermus脂肪酶酶活均有抑制效果，对固定化Thermus脂肪酶酶活均无抑制效果。SDS,Tween20和Triton X-100对游离和固定化Thermus脂肪酶酶均有明显的促进效果。而CHAPS对游离和固定化Thermus脂肪酶酶均有强烈的抑制效果。(5)固定化Thermus脂肪酶操作稳定性将实施例2方法制备的固定化Thermus脂肪酶根据实施例3进行酶活测定，测定结束后，通过用永久磁铁吸附分离固定化Thermus脂肪酶,经lmLpH8. 0的Tris-HCl缓冲液清洗后投入再次使用。重复进行10次，结果见图12所示。
从图12可见，重复使用10次，酶活仍可保持在80%以上。
权利要求
1.ー种Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述方法为将氨基化纳米磁性载体Fe3CVSiO2与pH8. O的缓冲溶液混合，加入质量浓度25%的戊ニ醛水溶液，室温下磁力搅拌4h,再加入以所述Tris-HCl缓冲溶液溶解的Thermus脂肪酶(Thermus thermophilusWL)的缓冲溶液，室温下磁力搅拌3. 5h，磁分离，弃去上清液a，将沉淀a用缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得固定化的Thermus脂肪酶；所述Thermus脂肪酶按下述方法获得将序列号为AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因以大肠埃希氏杆菌为宿主细胞进行重组，获得含有Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌CGMCC NO :1. 12252 ;将含有Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌CGMCC NO :1. 12252的单菌落接种于LB液体培养基中，37°C、250rpm培养4h，获得培养液a，取培养液a以体积分数1%的接种量接种于新鲜LB液体培养基中，37°C、250rpm培养3h，获得培养液b，在培养液b中加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为O. 5mM，37°C下培养4h，离心，将沉淀b加入pH7. 9的Buffer A缓冲液中，在IOKHz频率下进行超声裂解，离心，取上清液b进行Ni柱亲和层析，洗脱液经透析后，取截留液冷冻干燥，获得所述Thermus脂肪酶。
2.如权利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02按如下方法制备(1)将氯化铁和氯化亚铁以物质的量之比3:2混合后，加水配制成混合液，在氮气氛围中，将混合液在30°C下搅拌5min后，依次逐滴滴加质量浓度25%的氨水溶液a和聚こニ醇，滴加完毕后，在60°C条件下继续通入氮气反应30min后，将反应液在53KHz下超声分散5min，室温下自然冷却至25°C后进行磁分离，取沉淀c用超纯水洗涤至中性后干燥，获得Fe3O4纳米颗粒；所述水的体积用量以氯化铁和氯化亚铁中铁的总物质的量计为4600ml/mol ;所述氨水溶液a的体积用量以氯化铁和氯化亚铁中铁的总物质的量计为400ml/moI，所述聚こニ醇的体积用量以氯化铁和氯化亚铁中铁的总物质的量计为200ml/mol ;所述聚こニ醇的分子量为4000 ; (2)将Fe3O4纳米颗粒与无水こ醇、水和质量浓度25%的氨水溶液b混合，在53KHz下进行超声分散lh，然后在室温下搅拌，同时缓慢滴加正硅酸こ酷，滴加完毕后室温反应12h，反应完毕后，将反应液进行磁分离，沉淀d用蒸馏水洗涤至中性，再将洗涤后的沉淀d在lmol/L的盐酸中室温浸泡12h，磁分离，去除盐酸后将沉淀e水洗至中性，干燥，获得Fe304/Si02复合颗粒；所述无水こ醇、水的体积用量以Fe3O4纳米颗粒质量计分别为80ml/g、20ml/g,所述的氨水溶液b体积用量以Fe3O4纳米颗粒质量计为2. 5ml/g ;所述正硅酸こ酯的体积用量以Fe3O4纳米颗粒质量计为1. 5ml/g ; (3)将Fe304/Si02复合颗粒加入无水こ醇中，在53KHz下超声分散Ih后，加入质量浓度25%的氨水溶液c继续在53KHz下超声分散lOmin，然后通入氮气保护，在搅拌的条件下滴加3-氨丙基三こ氧基硅烷，同时在50°C反应8h，反应结束后将反应液在室温下自然冷却至25°C，磁分离，沉淀用蒸馏水洗涤至中性，再用无水こ醇洗涤后干燥，获得所述氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02 ;所述Fe304/Si02复合颗粒与无水こ醇、氨水溶液c和3_氨丙基三こ氧基硅烷的质量体积比分别为1:60、1 :6、1 :4。
3.如权利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法,其特征在于所述氨基化纳米磁性载体Fe3CVSiO2与pH8. O的缓冲溶液混合配制成载体终浓度10mg/mL的混合液。
4.如权利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述戊ニ醛水溶液的体积用量以氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02质量计为19. 05ml/g。
5.如权利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法,其特征在于所述Thermus脂肪酶与氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02的质量比为O. 0925 :1。
6.如权利要求1所述的Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述固定化方法按如下步骤进行将氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02与pH8. O的Tris-HCl缓冲溶液混合制成载体终浓度10mg/mL的混合液，再加入质量浓度25%的戊ニ醛水溶液，室温下磁力搅拌4h，然后加入Thermus脂肪酶的Tris-HCl缓冲溶液,室温下磁力搅拌3. 5h,磁分离，弃去反应液，将沉淀用PH8. O的Tris-HCl缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得所述固定化的Thermus脂肪酶；所述戊ニ醛水溶液的体积用量以氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02质量计为19. 05ml/g ；所述Thermus脂肪酶与氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02的质量比为O. 0925 :1。
全文摘要
本发明公开了一种Thermus脂肪酶的固定化方法将氨基化纳米磁性载体Fe3O4/SiO2与pH8.0的缓冲溶液混合，加入质量浓度25%的戊二醛水溶液，室温下磁力搅拌4h，再加入以所述Tris-HCl缓冲溶液溶解的Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的缓冲溶液，室温下磁力搅拌3.5h，磁分离，弃去上清液a，将沉淀a用缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得固定化的Thermus脂肪酶；本发明所述固定化Thermus脂肪酶耐热范围40-100℃，pH值适应范围4.0-9.0，对金属离子，酶抑制剂及去污剂有较强的耐受性；具有极好的超顺磁性，易磁分离回收，较好的操作稳定性。
文档编号C12N11/14GK102994491SQ20121024146
公开日2013年3月27日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者章晓波, 宋崇富 申请人:浙江大学