专利名称：利用亲水/疏水复合膜中的微结构固定化脂肪酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用亲水/疏水复合膜中的微结构进行脂肪酶固定化的方法，属于生物工程中的酶固定化技术领域。
背景技术：
脂肪酶可在油-水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、多肽合成及高聚物合成等多种有机反应，已被广泛应用于食品、精细化工及制药工业中。作为重要的生物催化剂，脂肪酶应用的有效性和经济性很大程度上取决于酶的固定化。作为固定酶的载体很多，以膜作为脂肪酶固定的载体，结合了膜的分离功能、载体功能和分隔功能，具有其他载体不可比拟的优点。
在目前的研究中，从亲水到疏水的各种平板或中空纤维膜材料用于脂肪酶的固定化已被报道。亲水膜包括纤维素、聚酰胺和聚丙烯腈，疏水膜包括聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯和聚砜等。与其他类型的载体一样，酶的固定法方法有吸附法、交联法和包埋法等等。其中吸附法和交联法是应用较多的方法。但是化学方法(交联和共价结合)固定酶无可避免的会导致酶部分活性位点的损失，从而降低酶的活力。同时还带来制备成本高，而载体无法重复使用的问题。而吸附法虽然能很好的保持酶的活性，但是由于材料吸附性能的局限，酶的负载量太小，使得单位面积固定化酶膜的活力较低。
发明内容
本发明的目的是建立一种利用特殊结构的复合膜，用物理的手段实现脂肪酶固定化的方法。
本发明的技术方按如下1)将亲水性膜材料醋酸纤维素溶解在二甲基甲酰胺中，制备得到质量分数为10％-20％的膜液，静置脱除气泡；2)将疏水性聚四氟乙烯膜平铺在玻璃板上，将步骤1)制备的亲水性膜液刮涂在其表面，利用干-湿相转换法使其成膜，制备得到由致密亲水层和多孔疏水层组成的复合膜；3)将脂肪酶溶解在磷酸钠缓冲溶液中，充分溶解后滤去溶液中的不溶物，得到酶蛋白浓度为84-167mg/L的脂肪酶溶液；4)将步骤2)制备的亲水/疏水复合膜装入一个死端过滤器，使其疏水层向上，将不同体积步骤3)制备的脂肪酶溶液注入过滤器，在0.3-0.6Mpa压力下进行过滤，实现脂肪酶的固定化。
上述技术方案中，步骤1)中所述的醋酸纤维素的优选质量分数为15％。步骤2)中所述的干-湿相转换法成膜是在温度25℃，湿度40％条件下挥发20分钟，然后浸入去离子水凝胶浴固化成膜；步骤2)中所述的致密亲水层的厚度为65-135μm。步骤2)中采用的疏水性聚四氟乙烯膜的孔径0.1-1.0μm，厚度65-85μm，孔隙率50％-65％)。步骤3)中所述的磷酸钠缓冲溶液为0.05M，pH7.3～7.7。
本发明与现有的固定化脂肪酶膜制备方法相比，具有以下优点及突出效果①利用致密亲水层的截留效果，使脂肪酶在过滤的过程中沉积在亲水层和疏水层的结合面上和疏水层的膜孔中，利用物理的方法实现了脂肪酶的固定化，方法简单，成本低；②脂肪酶在固定化过程中活力损失小，制备得到的固定化脂肪酶膜活力及其活力回收率高；③酶的负载量容易控制，范围在0.002-0.08mg/cm2之间；④固定化酶膜的使用稳定性较好；⑤载体可以再生重复使用，降低了成本。
图1为亲水/疏水复合膜固定化脂肪酶示意图，其中1为多孔疏水层，2为致密亲水层，2为固定化脂肪酶。
图2为固定化脂肪酶膜的动力学曲线。
图3为脂肪酶负载量与固定化酶膜活力关系曲线。
图4为固定化脂肪酶膜重复使用稳定。
具体实施例方式
本发明设计并制备了以多孔聚四氟乙烯膜为疏水层，以醋酸纤维素制备致密亲水层的复合膜，利用过滤的方法将脂肪酶截留并沉积在亲水层和疏水层的结合面上和疏水层的膜孔中。通过对复合膜结构(如亲水层与疏水层的厚度、孔径等)的调节对脂肪酶固定化环境进行优化。酶的负载量通过改变脂肪酶溶液的浓度和过滤体积来控制。
下面结合具体实施例进一步理解本发明。
实施例1采用平均孔径0.1μm，孔隙率50％，厚度为85μm的聚四氟乙烯膜作为疏水层。亲水层制膜液的质量分数为15％，控制醋酸纤维素亲水层厚度为65μm，在温度25℃，湿度40％条件下挥发20分钟，然后浸入去离子水凝胶浴固化成膜。将脂肪酶溶解在0.05M，pH7.5的磷酸钠缓冲溶液中，得到酶蛋白浓度为167mg/L的脂肪酶溶液。将面积为26cm2膜装入过滤器，加入15ml脂肪酶溶液，在0.6MPa下进行过滤。复合膜对脂肪酶的一次过滤截留率为20％，得到脂肪酶蛋白负载量为0.0201mg/cm2的固定化脂肪酶膜。
将固定化酶膜装入两相酶膜反应器，油相采用0.05-1.0M(酯键浓度)橄榄油的异辛烷溶液，水相采用0.05M，pH7.0的磷酸钠缓冲溶液，在37℃下，两相流量为15ml/min，两相循环进行活力测定4h，得到固定化脂肪酶膜的动力学曲线，如图4所示。其中底物浓度为0.5M时，活力为1.24μmol-FFA/min cm2。
实施例2采用平均孔径0.1μm，孔隙率50％，厚度为85μm的聚四氟乙烯膜作为疏水层。亲水层制膜液的质量分数为15％，控制醋酸纤维素亲水层厚度为135μm，在温度25℃，湿度40％条件下挥发20分钟，然后浸入去离子水凝胶浴固化成膜。将脂肪酶溶解在0.05M，pH7.5的磷酸钠缓冲溶液中，得到酶蛋白浓度为167mg/L的脂肪酶溶液。将面积为26cm2膜装入过滤器，加入15ml脂肪酶溶液，在0.6MPa下进行过滤。复合膜对脂肪酶的一次过滤截留率为22％，得到脂肪酶蛋白负载量为0.0212mg/cm2的固定化脂肪酶膜。
将固定化酶膜装入两相酶膜反应器，油相采用0.05-1.0M(酯键浓度)橄榄油的异辛烷溶液，水相采用0.05M，pH7.0的磷酸钠缓冲溶液，在37℃下，两相流量为15ml/min，两相循环进行活力测定4h，得到固定化脂肪酶膜的动力学曲线，如图4所示。其中底物浓度为0.5M时，活力为0.875μmol-FFA/min cm2。
实施例3采用平均孔径0.1μm，孔隙率50％，厚度为85μm的聚四氟乙烯膜作为疏水层。亲水层制膜液的质量分数为10％，控制醋酸纤维素亲水层厚度为65μm，在温度25℃，湿度40％条件下挥发20分钟，然后浸入去离子水凝胶浴固化成膜。将脂肪酶溶解在0.05M，pH7.5的磷酸钠缓冲溶液中，得到酶蛋白浓度为84mg/L的脂肪酶溶液。将面积为26cm2膜装入过滤器，加入10ml脂肪酶溶液，在0.3MPa下进行过滤。复合膜对脂肪酶的一次过滤截留率为14.3％，得到脂肪酶蛋白负载量为0.0046mg/cm2的固定化脂肪酶膜。
将固定化酶膜装入两相酶膜反应器，油相采用橄榄油的异辛烷溶液，水相采用0.05M，pH7.0的磷酸钠缓冲溶液，在37℃下，两相流量为15ml/min，两相循环进行活力测定4h，底物浓度为0.5M时，得到固定化脂肪酶膜活力为0.25μmol-FFA/min cm2。
实施例4采用平均孔径0.1μm，孔隙率50％，厚度为65μm的聚四氟乙烯膜作为疏水层。亲水层制膜液的质量分数为20％，控制醋酸纤维素亲水层厚度为65μm，在温度25℃，湿度40％条件下挥发20分钟，然后浸入去离子水凝胶浴固化成膜。将脂肪酶溶解在0.05M，pH7.5的磷酸钠缓冲溶液中，得到酶蛋白浓度为167mg/L的脂肪酶溶液。将面积为26cm2膜装入过滤器，加入15ml脂肪酶溶液，在0.6MPa下进行过滤。复合膜对脂肪酶的一次过滤截留率为20％，得到脂肪酶蛋白负载量为0.0201mg/cm2的固定化脂肪酶膜。
将固定化酶膜装入两相酶膜反应器，油相采用橄榄油的异辛烷溶液，水相采用0.05M，pH7.0的磷酸钠缓冲溶液，在37℃下，两相流量为15ml/min，两相循环进行活力测定4h，底物浓度为0.5M时，得到固定化脂肪酶膜活力为1.27μmol-FFA/min cm2。
实施例5采用平均孔径1.0μm，孔隙率65％，厚度为85μm的聚四氟乙烯膜作为疏水层。亲水层制膜液的质量分数为15％，控制醋酸纤维素亲水层厚度为65μm，在温度25℃，湿度40％条件下挥发20分钟，然后浸入去离子水凝胶浴固化成膜。将脂肪酶溶解在0.05M，pH7.5的磷酸钠缓冲溶液中，得到酶蛋白浓度为84mg/L的脂肪酶溶液。将面积为26cm2膜装入过滤器，加入20ml脂肪酶溶液，在0.6MPa下进行过滤。复合膜对脂肪酶的一次过滤截留率为16.8％，得到脂肪酶蛋白负载量为0.0108mg/cm2的固定化脂肪酶膜。
将固定化酶膜装入两相酶膜反应器，油相采用橄榄油的异辛烷溶液，水相采用0.05M，pH7.0的磷酸钠缓冲溶液，在37℃下，两相流量为15ml/min，两相循环进行活力测定4h，底物浓度为0.5M时，得到固定化脂肪酶膜活力为0.51μmol-FFA/min cm2。
权利要求
1.一种利用亲水/疏水复合膜中的微结构固定化脂肪酶的方法，该方法按如下步骤进行1)将亲水性膜材料醋酸纤维素溶解在二甲基甲酰胺中，制备得到质量分数为10％-20％的膜液，静置脱除气泡；2)将疏水性聚四氟乙烯膜平铺在玻璃板上，将步骤1)制备的亲水性膜液刮涂在其表面，利用干—湿相转换法使其成膜，制备得到由致密亲水层和多孔疏水层组成的复合膜；3)将脂肪酶溶解在磷酸钠缓冲溶液中，充分溶解后滤去溶液中的不溶物，得到酶蛋白浓度为84-167mg/L的脂肪酶溶液；4)将步骤2)制备的亲水/疏水复合膜装入一个死端过滤器，使其疏水层向上，将不同体积步骤3)制备的脂肪酶溶液注入过滤器，在0.3-0.6Mpa压力下进行过滤，实现脂肪酶的固定化。
2.根据权利要求1所述的利用亲水/疏水复合膜中的微结构固定化脂肪酶的方法，其特征在于步骤1)中所述的醋酸纤维素的质量分数为15％。
3.根据权利要求1或2所述的利用亲水/疏水复合膜中的微结构固定化脂肪酶的方法，其特征在于步骤2)中所述的干—湿相转换法成膜是在温度25℃，湿度40％条件下挥发20分钟，然后浸入去离子水凝胶浴固化成膜。
4.根据权利要求1或2所述的利用亲水/疏水复合膜中的微结构固定化脂肪酶的方法，其特征在于步骤2)中所述的致密亲水层的厚度为65-135μm。
5.根据权利要求1所述的利用亲水/疏水复合膜中的微结构固定化脂肪酶的方法，其特征在于步骤2)中采用的疏水性聚四氟乙烯膜的孔径0.1-1.0μm，厚度65-85μm，孔隙率50％-65％)。
6.根据权利要求1所述的利用亲水/疏水复合膜中的微结构固定化脂肪酶的方法，其特征在于步骤3)中所述的磷酸钠缓冲溶液为0.05M，pH7.3～7.7。
全文摘要
一种利用亲水/疏水复合膜中的微结构固定化脂肪酶的方法，属于生物工程中的酶固定化领域。本发明先将亲水性膜材料醋酸纤维素溶解在二甲基甲酰胺中，制成亲水性膜液，再将疏水性聚四氟乙烯膜平铺在玻璃板上，将亲水性膜液刮涂在其表面，利用干－湿相转换法制备得到由致密亲水层和多孔疏水层组成的复合膜，并通过过滤的方法，利用其微结构实现脂肪酶的固定化。本发明与现有的脂肪酶膜固定化方法相比，具有以下优点利用物理的方法实现了脂肪酶的固定化，方法简单，成本低；脂肪酶在固定化过程中活力损失小，制备得到的固定化脂肪酶膜活力及其活力回收率高；酶的负载量容易控制；固定化酶膜的使用稳定性较好；载体可以再生重复使用，降低了成本。
文档编号C12N11/00GK1800341SQ20051012636
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月9日 优先权日2005年12月9日
发明者王玉军, 徐坚, 骆广生, 戴猷元 申请人:清华大学