编码产黄青酶苯乙酸羟化酶的基因及其应用的制作方法

专利名称：编码产黄青酶苯乙酸羟化酶的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的分离的多核苷酸，具体地说涉及来自产黄青霉的新的编码苯乙酸羟化酶的基因(pahB)。
本发明还涉及该基因编码的多肽。
本发明还涉及含有该基因的表达载体。
本发明也提供了新基因在提高产黄青霉菌的青霉素产量中的应用。
背景技术：
以青霉素和头孢菌素为代表的β-内酰胺类抗生素作为最重要的抗菌药物，占据了世界抗感染药物市场的2/3，是目前已知的抗生素中毒性最低，品种最多，临床应用最广的一类抗生素。
青霉素由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)生产，由于广大的市场需求，人们对青霉素生产菌的改良投入了巨大的精力。基于传统的诱变筛选技术，现在的工业生产菌株的生产水平达到了相当高的水平。而分子生物学技术的发展为我们揭示β-内酰胺类抗生素的生物合成机制提供了帮助。
研究表明，青霉素的生物合成步骤由三个前体氨基酸，α-氨基己二酸、半胱氨酸、缬氨酸开始，经三肽合成酶(ACVS)催化缩合成LLD-ACV三肽，在异青霉素N合成酶作用下环化形成异青霉素N，最终在乙酰辅酶A6-氨基青霉烷酸酰基转移酶(AAT)催化下侧链交换得到青霉素。生物合成相关的三个关键酶的编码基因都已克隆(Ingolia&Queener，Med.Res.Rev.9245-264，1989；Aharonowitz，et al.，Ann.Rev.Microbiol.46461-495，1992)。
在青霉素的工业生产中，苯乙酸(Phenylacetic acid，PA)被用来作为青霉素G的侧链前体。在发酵过程中，苯乙酸首先被活化为辅酶A硫脂，再在AAT作用下经转酰基作用，替代异青霉素N的L-α-氨基己二酰侧链，形成青霉素G。由于AAT具有较宽的底物范围，因此在发酵过程中添加苯乙酸可以促进青霉素G的生物合成。作为青霉素G的侧链前体，其利用效率很大程度上取决于它的毒性以及青霉菌对其的氧化能力。苯乙酸在生产成本中占有相当的比重，提高苯乙酸的利用效率是青霉素菌种改良过程中非常重要的内容。
在Pseudomonas fluorescens(Kunita，N.，Med.J.Osaka Univ.3703-708，1955)，Aspergillus niger(Kluyver，A.J&J.C.M.van Zijp.，Antonie vanLeeuwenhoek1747-55，l951)，Nocardia salmonicolor(Sariaslani，F.S.et al.Biochem.J.14031-45，1974)，以及 Aspergillus nidulans(Mingot，J.M.et al.J.Biol.Chem.274，14545 14550，1999)，Penicillium chrysogenum(Wisconsin Q-176(Isono，M J.，Agric.Chem.Jpn.27297-301，1953；Nishikida，T.，J.Antibiot.4299-300，1951)等微生物中，苯乙酸的代谢是2位羟化形成2-OHPA，然后依次形成尿黑酸(homogentisic acid)、马来酰乙酰乙酸(maleylacetoacetic acid，)富马酰乙酰乙酸(fumarylacetoacetic acid)最后水解成延胡索酸和乙酰乙酸进入三羧酸循环。
作为青霉素产生菌之一的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)能够在苯乙酸为唯一碳源的培养基上生长，其苯乙酸代谢的第一步2位羟化由一个P450单加氧酶催化，该酶由phacA基因编码，该基因的失活导致了青霉素产量提高了5倍，同时使苯乙酸的代谢能力部分丧失(Mingot，J.M.et al.J.Biol.Chem.274，14545 14550，1999)。在产黄青霉中，相应的P450单加氧酶由pahA基因编码。PahA与PhacA氨基酸序列的一致性为84％。研究表明，pahA基因的表达受苯乙酸诱导，而其表达水平则与菌种的青霉素生产能力成负相关。传统的诱变及分离筛选，造成高产产黄青霉中该酶的苯乙酸氧化能力显著下降，青霉素生产能力的提高。序列分析发现高产菌株PahA序列的181位发生的L→F突变是造成该酶功能降低的原因(Rodriguez-Sáiz，M.et al.J.Bacteriol.183，54655471，2001)。
尽管如此，在工业发酵条件下，发酵液中仍能够检测到相当数量的2-羟苯乙酸(2-OHPA)的存在，这表明即使在工业菌株中，仍有相当部分的侧链前体被代谢掉了。是非特异的氧化、PahA的突变仅部分丧失了其氧化活性、还是在产黄青霉中存在其他的氧化机制尚不得而知。深入研究苯乙酸的氧化机制，发现新的苯乙酸氧化关键基因，可为青霉菌生产菌种的选育提供基因改造的靶点，对提高产量、降低发酵成本意义重大。

发明内容
本发明的一个目的在于提供新的编码产黄青霉苯乙酸羟化酶的基因，定名为pahB。
本发明的另一个目的在于提供上述基因编码的多肽。
本发明的再一个目的在于提供含有上述基因序列的表达载体。
根据本发明的一方面，编码产黄青霉谷苯乙酸羟化酶的基因，来源于产黄青霉菌(Penicillin chrysogenum)，定名为pahB。该基因ORF长为1551bp，编码517个氨基酸的蛋白，与PahA(516aa，AAF21759)、PhacA(518aa，CAB43093)长度相近，推测分子量为57.7kDa。其氨基酸序列和PahA、PhacA的一致性分别为44％和42％。在其442-451位是P450蛋白家族保守的半胱氨酸血红素-铁配体信号序列-YGMGYRMCAG-([FW]-[SGNH]-x-[GD]-{F}-[RKHPT]-{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD]，Prosite database entry PS00086)，与PahA(-YGAGSRMCAG-)、PhacA(-YGAGSRMCAG-)一样，苯丙氨酸残基(F)为酪氨酸(Y)所取代。基因表达研究表明，pahB的表达同样明显受到苯乙酸的诱导。
具体地说，本发明提供了新的分离的多核苷酸，其含有下述序列之一(1)序列表中的SEQ ID No1所示的序列或SEQ ID NO1的第43位～1593位核苷酸的序列；(2)编码序列表中SEQ ID No2所示蛋白质序列的多核苷酸序列。
上述涉及的多核苷酸还包括取代、缺失、和插入变体以及等位变体、剪接变体、片段、衍生物等，其中可以通过取代、缺失、插入或衍生一个或多个核苷酸。优选的这些多核苷酸是那些编码具有生物学活性的苯乙酸羟化酶的多核苷酸。
本领域技术人员可以理解的是，上述的分离的多核苷酸也包括那些与SEQID NO.1所示序列或SEQ ID NO1的第43位～1593位核苷酸的序列具有较高同源性的序列，例如同源性大于90％、甚至95％、甚至98％的序列；还包括那些在严谨条件下可与SEQ ID NO.1所示序列或SEQ ID NO1的第43位～1593位核苷酸的序列杂交的序列；或者可与上述序列互补的序列。
根据本发明的另一方面，提供新的多肽，其含有上述核苷酸序列所编码的氨基酸序列，即含有SEQ ID NO.2所示的序列，编码蛋白为产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的苯乙酸羟化酶，其具有序列表中SEQ ID No2的氨基酸残基序列的蛋白质或将SEQ ID No2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No2相同活性的由SEQID No2衍生的蛋白质。
根据本发明的另一方面，本发明亦提供包括一种或多种上述多核苷酸的重组载体，以及包含上述多核苷酸的载体的基因工程宿主细胞。在优选的实施方案中，这种重组载体包括上述的多核苷酸，它编码含SEQ ID NO2的多肽，其含SEQ ID NO1的序列或SEQ ID NO1的第43位～1593位核苷酸的序列所示的多核苷酸。
本发明也涉及到包括任何一种上述重组载体的宿主细胞。在已经构建载体之后，可以插入全部或部分载体至适合的宿主细胞，以便扩增和/或多肽表达。宿主细胞可以是原核生物宿主细胞(例如E.coli)或者真核生物宿主细胞(例如丝状真菌细胞、酵母细胞，昆虫细胞，或脊椎动物细胞)。
本发明还提供了新的基因在提高产黄青霉青霉素产量上的应用，由于pahB为苯乙酸分解代谢途径的关键基因，因此可以通过降低pahB的表达来提高青霉素生产工艺中的苯乙酸的利用效率，从而提高青霉素的产量。
本发明从产黄青霉中成功地分离获得了新的编码产黄青霉苯乙酸羟化酶的基因，并证明了苯乙酸能显著诱导该基因的表达，本发明为利用基因工程手段改造产黄青霉菌从而提高青霉素产量提供了方向和靶点，对于青霉素的生产具有重要意义。
附图的简要说明

图1为pahB基因的结构图。
发明的
具体实施例方式
下面结合附图，通过对本发明较佳实施例的描述，详细说明本发明。
在下面使用的试剂材料如无特别说明，均为市售分析纯试剂，购自天津试剂公司。
实施例1pahB基因克隆将产黄青霉菌Wis54-1255(ATCC28089)在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养基中培养24h，过滤收菌丝，取0.1g湿菌丝液N2研磨，加1ml Trizol试剂(Invitrogen公司，15596-026)抽提产黄青霉总RNA，将所得产黄青霉总RNA溶解于DEPC水中，-70℃下保存备用。
为去除可能的DNA污染，取产黄青霉总RNA 5μg，在100μl反应体系内，力加入5μl RQ1 RNase-Free DNase(Promega公司，M6101)，10μl RQ1 RNase-FreeDNase反应缓冲液(10×)，37℃保温30分，用酚氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于10μl DEPC水。取5μl去除DNA的RNA样品，用随机引物(RandomHexamers，Promega公司，C1181)进行反转录，得到cDNA，所用反转录酶为SuperScriptTM II RNase H-(Invitrogen公司，18064-022)。
以5’-tatatatcaacgtcaagatctatc-3’和5’-taccccaaatagataccaccaatg-3’为引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR条件为94℃，5分；94℃1分，60℃1分，72℃2分-40循环；72℃7分；4℃保存。将RT-PCR产物按常规方法克隆测序，测序结果表明RT-PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，长度为1629bp。通过序列分析和GenBank数据库检索，表明该序列的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)为自5’端的第43到第1593位碱基，长度为1551bp。在ORF起始密码子ATG前15bp处，同相位有终止密码子TAA，由此说明我们得到了该基因的全长序列，定名为pahB。
该基因ORF片段的读码框编码517个氨基酸，推测分子量为57.7kDa，如序列表中SEQ ID NO.2所示。该氨基酸序列与与产黄青霉苯乙酸羟化酶PahA(516aa，AAF21759)、构巢曲霉苯乙酸羟化酶PhacA(518aa，CAB43093)长度相近。其氨基酸序列和PahA、PhacA的一致性分别为44％和42％。。在其442-451位是P450蛋白家族保守的半胱氨酸血红素-铁配体信号序列-YGMGYRMCAG-([FW]-[SGNH]-x-[GD]-{F}-[RKHPT]-{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD]，Prosite database entry PS00086)，与PahA(-YGAGSRMCAG-)、PhacA(-YGAGSRMCAG-)一样，苯丙氨酸残基(F)为酪氨酸(Y)所取代。
同时以提取的Wis54-1255菌株的基因组DNA为模版进行PCR扩增，引物及反应条件同上，得到1860bp的扩增产物，将其与RT-PCR产物序列比较，确认pahB基因有3个内含子，长度分别为97bp、67bp、67bp。
实施例2pahB基因的表达受苯乙酸的诱导将产黄青霉菌Wis54-1255(ATCC28089)按2×106分生孢子/ml接种到种子培养基，在26℃下培养24小时，种子培养基配方为(g/l)葡萄糖，30；乳糖，10；棉籽饼粉，10；酵母粉，10；玉米浆，10；(NH4)2SO4，2； KH2PO4，1；CaCO3，5；pH 5.8。然后将种子培养物以5％接种量接种到发酵培养基，26℃下培养。发酵培养基为(g/l)乳糖，120；棉籽饼粉，30；玉米浆，20；(NH4)2SO4，5；KH2PO4，1；K2SO4，5；CaCO3，10；pH6.5。
实验分为2组，一组每天正常补加苯乙酸前体，另一组为对照，不加苯乙酸，72小时后收取菌体提取总RNA，提取及处理方法见实施例1。
用SYBR Green试剂作实时定量PCR检测pahB基因的表达，仪器为ABIPRISM 7000定量PCR仪。根据pahB基因的cDNA序列，利用Primer Express软件设计定量PCR引物，AS0065′-GCTGAACAGTGAGGAGTTGAC-3′AA0065′-CGCAAGAACCTTCGACAGAG-3′。以产黄青霉γ-actin基因(AF056975)为内标，act15′-CTCGCTGAGCGTGGTTACAC-3′act25′-TTGATGTCACGGACGATTTCA-3′。引物由上海生工合成。定量PCR试剂为SYBRPremix Ex TagTM试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)。反应条件为95℃，1分钟；95℃，15秒，60℃，1分钟，40循环。对定量PCR的结果CT进行换算，采用2-ΔΔCT法(Livak K.J. and T.D.SchmittgenMethods 25402-408，2001)。结果，在不添加苯乙酸的情况下，pahB的表达水平非常低，苯乙酸能显著诱导pahB基因的表达，以不添加苯乙酸的表达量为1，则添加苯乙酸时pahB的表达提高了580倍(下表)。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，只要未脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求所定义的范围。
05P101406.ST25.txtSEQUENCE LISTING<110>华北制药集团新药研究开发有限责任公司<120>编码产黄青酶苯乙酸羟化酶的基因及其应用<130>05P101406<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1629<212>DNA<213>产黄青霉菌(Penicillin chrysogenum)<220>
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1.一种分离的多核苷酸，含有下述核苷酸序列之一(1)SEQ ID No1所示的序列或SEQ ID NO1的第43位～1593位核苷酸的序列；(2)编码SEQ ID No2所示的蛋白质序列的多核苷酸序列。
2.一种分离的多核苷酸，含有与权利要求1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
3.由权利要求1所述的核苷酸序列编码的多肽。
4.权利要求3所述的多肽，其具有SEQ ID NO.2所示的序列，具有苯乙酸羟化酶活性。
5.含有权利要求1所述的多核苷酸的表达载体。
6.含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。
7.权利要求1所述的分离的多核苷酸在提高产黄青霉菌的青霉素产量中的应用。
全文摘要
本发明涉及来自产黄青霉的新的编码苯乙酸羟化酶的基因(pahB)，该基因编码的多肽及含有该基因的表达载体，并证明了苯乙酸能显著诱导该基因的表达。本发明为利用基因工程手段改造产黄青霉菌从而提高青霉素产量提供了方向和靶点，对于青霉素的生产具有重要意义。
文档编号C12N15/63GK1978651SQ200510126158
公开日2007年6月13日 申请日期2005年11月30日 优先权日2005年11月30日
发明者王富强, 任志红, 刘静, 戴梦, 郑桂珍, 王泽建, 赵颖, 王红怡, 贾茜, 贺建功 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司