专利名称：硫化叶菌病毒脱氧尿苷焦磷酸酶和编码这种酶的多核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于硫化叶菌病毒的脱氧尿苷焦磷酸酶，以及编码此酶的多核苷酸。
背景技术：
脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)是一种重要的DNA修饰酶，广泛存在于各种生物有机体中，可特意水解dUTP产生dUMP和ppi，dUMP经甲基化变为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸(dTTP)，而dTTP又是合成DNA的主要成分之一。因此，dUTPase在生物体中具有双重基本功能(I)降低细胞中的dUTP / dTTP比例，防止DNA复制过程中dUTP浓度过高而引起错误掺入，提供DNA复制的稳定性；(2)为DNA的合成提供必需病毒编码的原料dTTP。dUTPase具有种属特异性，且与病毒的毒力和高效复制密切相关。 英国学者McGeoch在比较了不同来源的脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)的氨基酸序列后发现，来源于任何物种的dUTPase，虽然分子量大小不一，但其氨基酸序列中都有含有dUTPase的5个典型的高度保守的基序，分别为motif I (AGFDL)、rnotif 2 (GKSS)、motif 3 (GIIDFGYTG)、motif 4(GQKFAQL)和 motif 5 (RGDKGFGS)。其中 motif 3 被认为是dUTPase的酶活性催化中心。McGeehan根据dUTPase的性质、结构可将其分为三个亚类1型包括除大多数疱疹病毒外几乎所有来源的dUTPase (包括细菌、真菌、植物和后生动物以及一系列的病毒痘病毒、逆转录病毒，腺病毒以及无脊椎动物、鱼类和两栖动物的疱疹病毒)；11型则包括哺乳动物和禽类的疱疹病毒所编码的dUTPase。I型和II型虽然都有5个相似的保守motif，特异性底物都为dUTP，但它们在基因长度、motif排列、空间结构上有较大的差别。I型dUTPase通常为150个氨基酸残基，天然晶体结构由三个亚单位构成的同源三聚体(homotrimer)组成,五个保守motif排列顺序为I. 2. 3. 4. 5 ;而II型dUTPase氨基酸残基数则是I型的两倍,天然晶体结构为单体(monomer),并且其motif■排列顺序为3. I. 2. 4. 5。此外，研究表明，线虫等少数生物上编码的dUTPase在结构上与前两者有很大的不同，没有5个明显的保守motif，而且其水解底物除了 dUTP还包括dUDP，暂归属于III型。分析和了解dUTPase的分类及结构特性有助于通过分类及结构特点实现结构蛋白到功能蛋白的研究的深入。所有生物都有相当数量的基因编码脱氧尿苷焦磷酸酶，主要是由于此酶是一种重要的DNA修饰酶，降低细胞中的dUTP / dTTP比例，防止DNA复制过程中dUTP浓度过高而引起错误掺入，提供DNA复制的稳定性，因此脱氧尿苷焦磷酸酶具有基础和应用研究价值。
发明内容
本发明旨在提供一种嗜酸热硫化叶菌STSV2病毒的脱氧尿苷焦磷酸酶，该脱氧尿苷焦磷酸酶由分离自腾冲热海的嗜酸热硫化叶菌病毒STSV2所编码，其是含有SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列的多肽、多肽类似物或衍生物。本发明中所述多肽类似物或衍生物的氨基酸序列具有与SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列至少90%的相同性。本发明的另一个目的是提供一种编码权利要求I所述脱氧尿苷焦磷酸酶的多核苷酸，其具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列或其互补序列、或与SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的多核苷酸及其互补序列。本发明的另一个目的是提供编码脱氧尿苷焦磷酸酶的多核苷酸的表达载体及其表达方法。本发明的有益效果如下
此酶是一种重要的DNA修饰酶，能防止DNA复制过程中dUTP浓度过高而引起错误掺入，提供DNA复制的稳定性，因此脱氧尿苷焦磷酸酶可以作为DNA扩增体系的添加物，以提高DNA扩增效率和保真性。
图I是本发明脱氧尿苷焦磷酸酶基因保守结构域分析示意图。图2是本发明脱氧尿苷焦磷酸酶基因的PCR产物，其中M是Marker ;泳道I是脱氧尿苷焦磷酸酶基因PCR产物，其大小为516bp ;泳道是2为阴性对照。图3是本发明的脱氧尿苷焦磷酸酶基因PCR产物、重组质粒、及质粒酶切电泳示意图，其中=M为Marker ;泳道I为脱氧尿苷焦磷酸酶基因PCR产物，其大小为516bp ;泳道2为脱氧尿苷焦磷酸酶重组质粒经Nco I酶和Hind III酶双酶切电泳结果；泳道3为脱氧尿苷焦磷酸酶重组质粒Nco I酶切电泳结果泳道；泳道4为脱氧尿苷焦磷酸酶重组质粒Hind III酶切电泳结果；泳道5为脱氧尿苷焦磷酸酶重组质粒电泳结果；泳道6为pET32a质粒电泳结果。图4是本发明脱氧尿苷焦磷酸酶纯化示意图，其中M为Marker ;泳道I，2，3，4分别脱氧尿苷焦磷酸酶从镍柱上依次洗脱下来的洗脱液电泳分析图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。实施例I :STSV2病毒脱氧尿苷焦磷酸酶的克隆和表达
I、STSV2病毒脱氧尿苷焦磷酸酶基因的扩增，(以病毒STSV2 DNA为模板)
(1)STSV2病毒脱氧尿苷焦磷酸酶基因的扩增所用引物序列如下
正向引物5 ’ - CATGCCATGGACATGATTTTCAGTGATAGAG -3 ’
反向引物5 ’ - CCCAAGCTTTGAGAGCTTGGCCGGCGTCAC -3 ’
(2)扩增体系如下
表I :扩增反应体系组分__
权利要求
1.硫化叶菌病毒脱氧尿苷焦磷酸酶，其特征在于其具有SEQID NO. I所示的氨基酸序列的多肽、多肽类似物或衍生物。
2.根据权利要求I所述的硫化叶菌病毒脱氧尿苷焦磷酸酶，其特征在于多肽类似物或衍生物的氨基酸序列具有与SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列至少90%的相同性。
3.一种编码权利要求I所述脱氧尿苷焦磷酸酶的多核苷酸，其特征在于其是具有SEQID NO. 2所示的核苷酸序列或其互补序列、或与SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列具有至少80%相同性的多核苷酸及其互补序列。
全文摘要
本发明公开了一种硫化叶菌病毒STSV2脱氧尿苷焦磷酸酶和编码这种酶的多核苷酸，该脱氧尿苷焦磷酸酶由嗜酸热硫化叶菌病毒STSV2基因组DNA所编码，该脱氧尿苷焦磷酸酶在55-80℃具有较高的催化活性。脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)是一种重要的DNA修饰酶，能够降低细胞中的dUTP／dTTP比例，防止DNA复制过程中dUTP浓度过高而引起错误掺入，提高DNA复制的稳定性，可以应用于PCR扩增技术中提高DNA扩增的效率和保真度。
文档编号C12N9/16GK102766611SQ201210240789
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者季秀玲, 张琦, 朱国东, 林连兵, 陈美杉, 魏云林 申请人:昆明理工大学