专利名称：寡核苷酸引物对、寡核苷酸组合物和包括寡核苷酸组合物的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于动物病毒分子生物学技术领域，具体是一种用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的一步法RT-PCR检测方法，也涉及寡核苷酸引物对、寡核苷酸组合物和包括寡核苷酸组合物的试剂盒，适用于临床或科研中鉴别检测样品是否是PRRSV经典株感染，或者是PRRSV高致病性变异株感染，或者是两者的共同感染。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Wensvoort等人在感 染猪体内分离到欧洲型PRRSV，命名为Lelystad病毒(LV);同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为VR-2332。目前，猪繁殖与呼吸综合征已在世界范围内流行，我国自1996年以来普遍存在该病。2006年6月起，我国南方一些省份的猪场暴发了一种“高热”综合征，发病猪的体温高于41°C，病猪食欲不振甚至废绝，腹部、耳尖及后躯发红，发病率达70% 100%，死亡率达50% 100%不等。该病传播迅速，在短短的半年内几乎传遍了大半个中国，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。传统的猪繁殖与呼吸障碍综合征诊断方法有多种，如检测病原的有病毒分离、免疫组化、免疫荧光试验等方法,检测抗体的有ELISA、血清病毒中和试验、间接免疫荧光试验、免疫过氧化酶单层试验等血清学方法，但这些诊断方法不同程度地存在诸如敏感性低、特异性差、需时长等的局限性。国内外已建立了针对所有PRRSV的RT-PCR方法，但此种方法只能检测是否有PRRSV感染，无法判断是PRRSV经典株感染，或者是PRRSV高致病性变异株感染，亦或是两者共同感染。此外，已有的针对PRRSV高致病性变异株的RT-PCR检测方法，只能检测PRRSV高致病性变异株，无法判断是单一的PRRSV高致病性变异株感染，还是PRRSV经典株与高致病性变异株的共同感染。由于上述各方法的局限性，无法为我国快速有效地监控PRRS疫情提供有力的技术支持。因此，建立一种简便、快速、特异性强、敏感性高的PRRSV经典株与高致病性变异株的鉴别检测方法意义重大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术而提出寡核苷酸引物对、寡核苷酸组合物和包括寡核苷酸组合物的试剂盒及其检测方法，目的在于克服现有检测PRRSV方法的不足，该方法只需要一对引物、一次检测便能判断检测样品中是否含有PRRSV经典株，或者含有PRRSV高致病性变异株，亦或是两者共同感染，该方法简便快速、特异性强、敏感性高，并且可以同时进行大批量的样品检测，可为PRRS疫情的监测、流行病学调查及防控提供有力的技术支持，具有良好的应用前景。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是寡核苷酸引物对，其特征在于由序列为 TGAYGGGCGACAATGTCC 的上游引物 PRRSV NSP2-F 和序列为 CGCAGACAAATCCAGAVG 的下游引物PRRSV NSP2-R组成。用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的寡核苷酸组合物，其特征在于包括如上所述的寡核苷酸引物对。一种用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的试剂盒，其特征在于包括如上所述的用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的寡核苷酸组合物。应用权利要求3所述的用于检测PRRSV经典株与高致病性变异株的试剂盒进行一步法RT-PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤
1)将RT-PCR50 u L反应体系在PCR扩增仪上进行如下循环45°C 30min,94°C 5min，其扩增条件为94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 30 s ;进行30个循环后，在72°C下延伸10min，得到PCR扩增产物；所述的RT-PCR 50 y L反应体系由5 y L IOX buffer，0. 5 y L Taq polymerase (5U/U L), 0. 5 U L reverse transcriptase (5U/U L), 0. 5 U L RNaseinhibitor (40U/y L)，4 y L RNA 模板，5 y L dNTP (IOmM), I U L PRRSV NSP2-FC100 uM),I u L PRRSV NSP2-R (100 u M)和 32. 5 u L 灭菌水组成；
2)电泳称取I.2g琼脂糖放入500mL锥形瓶中，加入I XTAE电泳缓冲液lOOmL，于微波炉中熔解，再加入5 u L染色液混匀，在电泳槽模内放好梳子，倒入所得琼脂糖凝胶，待完全凝固后取出置于电泳槽中，将PCR扩增产物5 u L混合I y L上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以100-150V电压于IXTAE电泳缓冲液中电泳，通过凝胶成像系统观察结果。本发明与现有技术相比具有以下优点
1、能够对PRRSV经典株与高致病性变异株进行鉴别诊断，解决了临床样品检测中不能区分PRRSV经典株或高致病性变异株单独感染亦或共同感染的问题；
2、特异性好，针对PRRSVNSP2具有高保守区设计引物，特异性强，无假阳性出现；
3、灵敏度高,经对反应体系及循环参数进行优化,该方法的敏感性可达ITCID5(l/mL ；
4、简便快速，仅I个小时，加上核酸的提取和琼脂糖凝胶检测，共需2-3小时。
图I : 一步法RT-PCR检测PRRSV经典株与高致病性变异株电泳结果，注M. DL2000marker, I. PRRSV 经典株 CH_la，2. PRRSV 高致病性变异株 07HBEZ，3. H2O ；
图2 : —步法RT-PCR特异性试验电泳结果，注M. DL2000marker，I. PRRSV经典株CH-la, 2. PRRSV高致病性变异株07HBEZ，3.猪瘟病毒(CSFV)，4.猪伪狂犬病毒(PRV)，
5.猪圆环病毒2型(PCV2)，6.猪细小病毒(PPV)，7.日本乙型脑炎病毒(JEV)，8.猪轮状病毒(RV)；
图3 :—步法RT-PCR敏感性试验电泳结果，注左图为PRRSV经典株CH-Ia，右图为PRRSV 高致病性变异株 07HBEZ ;M. DL2000marker，I. IO3 TCID5(l/mL，2. IO2 TCID50/mL, 3. 10TCID50/mL, 4. I TCID50/mL, 5. KT1 TCID5(l/mL，6. 1(T2 TCID50/mL, 7. 1(T3 TCID50/mL ；
图4 :一步法RT-PCR检测临床样品电泳结果，注M. DL2000marker，l-4、8、ll、15、21、23、24，PRRSV高致病性变异株阳性样品；9、10、12、13、16、17，PRRSV经典株PRRSV阳性样品；7、19，PRRSV经典株与高致病性变异株共同感染阳性样品；5、6、14、18、20、22，阴性样品。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例仅用于说明本发明，不会限制权利要求书所详细描述的本发明 。本发明研究过程中用到的毒株包括猪瘟病毒(CSFV)，猪伪狂犬病毒(PRV)，猪圆环病毒2型(PCV2)，猪细小病毒(PPV)，日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪轮状病毒(RV)，均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提供。病毒特异性引物设计所述的病毒特异性引物，指的是长度为18个碱基的寡核苷酸链，与PRRSV经典株、PRRSV高致病性变异株NSP2基因高度保守区的特异性片段完全相同或者反向互补。本文所列的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。寡核苷酸引物对，其特征在于由序列为TGAYGGGCGACAATGTCC的上游引物PRRSVNSP2-F 和序列为 CGCAGACAAATCCAGAVG 的下游引物 PRRSV NSP2-R 组成。用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的寡核苷酸组合物，其特征在于包括如上所述的寡核苷酸引物对。一种用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的试剂盒，其特征在于包括如上所述的用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的寡核苷酸组合物。实施例I
一步法RT-PCR检测PRRSV经典株与高致病性变异株。I病毒株
PRRSV经典株美洲型PRRSV国内分离株CH-la，由中国科学院武汉病毒研究所提供；PRRSV高致病性变异株由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的07HBEZ(GenBank ID: FJ495082. 2)。2病毒培养
将冻存的美洲型PRRSV国内分离株CH-Ia和PRRSV高致病性变异株07HBEZ取出，加入适量含10%小牛血清的细胞培养液稀释后，接种于生长良好的Marcl45细胞单层，37°C吸附lh，加入含2%小牛血清的细胞维持液继续培养3-5d，观察细胞病变(CPE)，待出现典型细胞病变达70%时收毒，_70°C保存备用。3病毒RNA的提取
采用Trizol法提取，分别取美洲型PRRSV国内分离株CH-Ia和PRRSV高致病性变异株07HBEZ的细胞培养液各400ul，冻融2_3次，加800ulTrizol，室温作用5min ;加入200ul氯仿，室温作用IOmin ;4°C, 12000rpm,离心15min ;吸取上清液,加入等体积异丙醇，-20°C作用 IOmin ；4°C, 12000rpm,离心 15min ;弃上清液，加入 ImT,75% 乙醇，8000rpm,离心 5min ;弃乙醇，晾干，即得病毒基因组总RNA，置-20°C保存备用。4阴性对照
取灭菌的DEPC水，置-20°C保存备用。5 一步法RT-PCR检测PRRSV经典株和PRRSV高致病性变异株操作程序
50 u L 反应体系，包括5 u L 10 X buffer, 0. 5 U L Taq polymerase (5U/ U L),0.5 u L reverse transcriptase (5U/u L), 0. 5 u L RNase inhibitor (40U/u L), 4 u LRNA 模板，5 ii L dNTP (IOmM)，I u L PRRSV NSP2-F (100 uM),luL PRRSV NSP2-R (100
11]\0和32.51^灭菌水。在PCR扩增仪上进行如下循环45°C 30min, 94°C 5min ;扩增条件为 94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s ;30 个循环后，72°C 延伸 10 min。6 电泳
称取I. 2g琼脂糖放入500mL锥形瓶中，加入I X TAE电泳缓冲液lOOmL，于微波炉中熔解，再加入5 u L染色液混匀。在电泳槽模内放好梳子，倒入所得琼脂糖凝胶，待完全凝固后取出置于电泳槽中，将PCR扩增产物5 u L混合I y L上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以100-150V电压于IXTAE电泳缓冲液中电泳，凝胶成像系统观察结果。7结果判定
PRRSV经典株出现330bp扩增带、PRRSV高致病性变异株出现240bp扩增带、阴性对照无条带(引物带除外)时，实验结果有效。8 结果
所有样品的判定结果均与其背景相符合。PRRSV经典株CH-Ia扩增出330bp的目的带，PRRSV高致病性变异株07HBEZ扩增出240bp的目的带，而阴性对照DEPC水未扩增出任何目的带(见图I)。实施例2
特异性试验 I病毒毒株
PRRSV经典株CH-la，PRRSV高致病性变异株07HBEZ，猪瘟病毒(CSFV)，猪伪狂犬病毒(PRV)，猪圆环病毒2型(PCV2)，猪细小病毒(PPV)，日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪轮状病毒(RV)。2 方法
用一步法RT-PCR检测6株其它猪源病毒毒株6份，I份PRRSV经典株CH_la，I份PRRSV高致病性变异株07HBEZ，以考查该方法检测不同样品的特异性。3 结果
用一步法RT-PCR检测6株其它猪源病毒毒株，结果均为阴性，PRRSV经典株CH_la，PRRSV高致病性变异株07HBEZ均扩增出目的条带(见图2)。实施例3 敏感性试验
I病毒
PRRSV 经典株 CH-la (TCID50=IO5-6), PRRSV 高致病性变异株 07HBEZ (TCID5tl=IO5 8X2 方法
将 PRRSV 经典株 CH-la (TCID50=IO5-6), PRRSV 高致病性变异株 07HBEZ (TCID50=IO5-8)分别稀释为103-10_3 TCID50/mL,各取100 u L病毒液，提取RNA，一步法RT-PCR扩增每个稀释度样品。、3 结果
用一步法RT-PCR检测不同稀释度样品的结果见图3。结果表明该一步法RT-PCR的敏感性为I TCID50/mL (见图3)。实施例4临床样品的检测 I材料
临床收集的血清样品24份。2 方法
分别取各血清样品100 u L，采用Trizol法提取RNA，一步法RT-PCR扩增每个样品。3 结果
一步法RT-PCR扩增临床样品24份，结果PRRSV经典株阳性样品6份，PRRSV高致病性变异株阳性样品10份，PRRSV经典株与高致病性变异株共同感染阳性样品2份，阴性样品6份(见图4)。
权利要求
1.寡核苷酸引物对，其特征在于由序列为TGAYGGGCGACAATGTCC的上游引物PRRSVNSP2-F 和序列为 CGCAGACAAATCCAGAVG 的下游引物 PRRSV NSP2-R 组成。
2.用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的寡核苷酸组合物，其特征在于包括如权利要求I所述的寡核苷酸引物对。
3.一种用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的试剂盒，其特征在于包括如权利要求2所述的用于同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的寡核苷酸组合物。
4.应用权利要求3所述的用于检测PRRSV经典株与高致病性变异株的试剂盒进行一步法RT-PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤 1)将RT-PCR50 ii L反应体系在PCR扩增仪上进行如下循环45°C 30min,94°C 5min，其扩增条件为94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 30 s ;进行30个循环后，在72°C下延伸10min，得到PCR扩增产物；所述的RT-PCR 50 y L反应体系由5 y L IOX buffer，0. 5 y L Taq polymerase (5U/U L), 0. 5 U L reverse transcriptase (5U/U L), 0. 5 U L RNaseinhibitor (40U/y L)，4 y L RNA 模板，5 y L dNTP (IOmM), I U L PRRSV NSP2-FC100 uM),I u L PRRSV NSP2-R (100 u M)和 32. 5 u L 灭菌水组成； 2)电泳称取I.2g琼脂糖放入500mL锥形瓶中，加入I XTAE电泳缓冲液lOOmL，于微波炉中熔解，再加入5 u L染色液混匀，在电泳槽模内放好梳子，倒入所得琼脂糖凝胶，待完全凝固后取出置于电泳槽中，将PCR扩增产物5 u L混合I y L上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以100-150V电压于IXTAE电泳缓冲液中电泳，通过凝胶成像系统观察结果。
全文摘要
本发明涉及寡核苷酸引物对、寡核苷酸组合物和包括寡核苷酸组合物的试剂盒及其检测方法，由序列为TGAYGGGCGACAATGTCC的上游引物PRRSVNSP2-F和序列为CGCAGACAAATCCAGAVG的下游引物PRRSVNSP2-R组成。本发明与现有技术相比具有以下优点1、能够对PRRSV经典株与高致病性变异株进行鉴别诊断，解决了临床样品检测中不能区分PRRSV经典株或高致病性变异株单独感染亦或共同感染的问题；2、特异性好，针对PRRSVNSP2具有高保守区设计引物，特异性强，无假阳性出现；3、灵敏度高，该方法的敏感性可达1TCID50/mL；4、简便快速。
文档编号C12Q1/68GK102747079SQ20121024020
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者刘泽文, 周丹娜, 杨克礼, 段正赢, 田永祥, 袁芳艳, 郭锐 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所