专利名称：一株高抑菌活性的乳酸片球菌及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乳酸片球菌，特别是涉及一株高抑菌活性的乳酸片球菌及应用。背景介绍目前饲料和畜禽养殖中滥用抗生素、化学合成药物、激素导致一系列问题和后果，包括:畜禽产品中药物残留严重，直接危害人体健康，甚至产生“三致”，并使我国的畜禽产品品质下降，缺乏市场竞争力和信任感；细菌耐药性增强、耐药菌株增多，结果用药无效，威胁人类安全等。世界卫生组织专家认为，畜禽产生的各种抗药性病菌，可以通过食品传给人，并产生很难治愈的疾病，危害人类健康。同时，金霉素等药物、马杜霉素等易残留和毒性较大的抗生素及合成抗菌药物的大量使用，导致药物残留增加，耐药菌株扩散，动物菌群失调，动物的免疫力受到抑制，继发二次感染。而乳酸片球菌，产酸，调节胃肠道菌群，维持肠道微生态平衡。在动物体内对病原微生物有颉颃作用，可竞争性地抑制病原微生物，增强动物机体的免疫功能，产生有益的代谢产物，激活酸性蛋白酶的活性，参与机体的新陈代谢，防止有害物质产生。鉴于上述饲料和畜禽养殖中存在的诸多问题和可开拓的空间，中国已启动“饲料安全工程”并禁用了一批毒性和残留较大的药物。加快新型饲料添加剂的开发与生产，特别是是替代抗生素的饲料添加剂的生产。因此，微生态制剂作为一个绿色的饲料添加剂成为产业化发展的新型热点，是替代抗生素的主要产品之一。作为消化道内固有菌群，乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、抑制有害菌生长、增强免疫力等作用。市面上微生态制剂大多采用乳酸菌或乳酸菌于其他益生菌复配的形式，在提高畜禽采食量、防止腹泻等方面有显著作用。但乳酸菌作为微生态制剂产品也存在以下一些缺陷:乳酸菌干粉的活菌数相对较低，活菌存活时间短，抗菌谱广同时抑菌效果好的菌种少,生产成本相对较高。
发明内容
本发明的目的是提供了一株广谱高抑菌活性的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)vscc-lCGMCC N0.6055。从牛乳中分离得到一株广谱高抑菌活性的乳酸片球菌，经16S rDNA鉴定为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) vscc-Ι,并于2012年4月26日送中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC N0.6055，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所邮编:100101电话:86-10-64807596。1、一株高抑菌活性的乳酸片球菌及应用，其特征在于:该菌为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) vscc-lCGMCC N0.6055,具有较强的抑菌活性。2、根据权利要求1所述的一株高抑菌活性的乳酸片球菌及应用，其特征在于所述的抑菌范围活性是指对大肠杆菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用。3、所述的一株高抑菌活性的乳酸片球菌的抑菌活性是指指示菌的抑菌圈直径达到 20mm-30mm。
4、一种含高抑菌活性的乳酸片球菌的微生态制剂，其特征在于所述的微生态制剂是以乳酸片球菌为主要原料，其具体生产工艺如下:I)菌种选择:所用菌种为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) vscc-1CGMCCN0.6055 ；2)斜面培养:将-80°C甘油管保藏的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)vscc-lCGMCC N0.6055接种于固体斜面培养基，30°C培养24h ；3)种子培养:将斜面培养的菌种接种至液体培养基中，30°C静置培养8h ；4)发酵罐培养:将一级种子液按I %接种量接种于发酵罐培养液中，30°C，150-250rpm 发酵 10_20h ；上述培养基成分为:鹿糖2-8g/L，胃蛋白胨10-18g/L，酵母膏2-lOg/L，磷酸二氢钾3-14g/L，氯化钠l-10g/L，七水合硫酸镁0.1-1.5g/L，pH调至7.0-7.35 ;斜面培养基另添加1.5%琼脂粉。5)菌体富集:将发酵液通入管式离心机中，16000-21000rpm离心收集菌体。6)冷冻干燥:将离心后的菌泥与等体积的10% D-山梨醇溶液混合均匀后，置于冷冻干燥机内冻干。
7)冻干菌粉的后处理:以葡萄糖为载体，与冻干菌粉混合，使混合后的微生态制剂活菌数达到0.8万亿cfu/g。5、一种含高抑菌活性的乳酸片球菌在微生态制剂作为饲料添加剂中的用量如下:对于正常种禽，添加量为饲料重的0.2% ；对于腹泻种禽，添加量为饲料重的0.1 % ;对于正常仔猪，添加量为饲料重的0.2% ;对于腹泻仔猪，添加量为饲料重的0.4%。本发明具有以下优点:所述菌种抗菌谱广、抑菌活性高；所述微生态制剂活菌数为目前市售的乳酸菌类微生态制剂中最高；生产工艺简单，周期短，生产成本低。
图1 是乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) vscc-lCGMCC N0.6055 对藤黄微球菌的抑菌效果，其图中是两个相同实验剂量组；实验剂量组是乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici) vscc-lCGMCC N0.6055 的培养液的上清液。
具体实施例方式实施例一:乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici) vscc-lCGMCC N0.6055 的高抑菌活性1.培养液上清的制备将斜面培养的乳酸片球菌接种于液体培养基中，30°C静置培养16h,取ImL菌液12000rpm离心Imin,取上清液。2.抑菌活性检测平板的制备将15mL完全溶化的LB琼脂培养基倒入培养皿中，待其凝固后垂直放上牛津杯；另取一完全溶化的LB琼脂培养基，待其冷却到55°C时加入指示菌混匀，取IOmL混有指示菌的培养基倒入放有牛津杯的培养皿中，待完全凝固后拔出牛津杯，制成检测平板。3.抑菌活性的测定取200 μ L培养液上清加入检测平板的孔中，4°C放置24h后放入37°C培养箱中培养20h，测量抑菌圈大小20mm-30mm。实施例二:高活菌数微生态制剂制备工艺I)菌种选择:所用菌种为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)vscc-lCGMCCN0.6055。2)斜面培养:将-80°C甘油管保藏的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)vscc-lCGMCC N0.6055接种于固体斜面培养基,30°C培养24_30h。3)种子培养:将斜面培养的菌种接种至液体培养基中，30°C静置培养8h。4)发酵罐培养:将种子液按I %接种量接种于发酵罐培养液中，30°C，IOOrpm发酵20h。上述培养基成分为(g/L):蔗糖4，胃蛋白胨12，酵母膏4，磷酸二氢钾5，氯化钠2，七水合硫酸镁0.2，pH调至7.0 ;斜面培养基另添加1.5%琼脂粉5)菌体富集:将发酵液通入管式离心机中，20000rpm离心收集菌体。6)冷冻干燥:将离心后的菌泥与等体积的10% D-山梨醇溶液混合均匀后，置于冷冻干燥机内冻干。7)冻干菌粉的后处理:以葡萄糖为载体，与冻干菌粉混合，使混合后的微生态制剂活菌数达到I万亿cf u/g。
权利要求
1.一株高抑菌活性的乳酸片球菌及应用，其特征在于:该菌为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) vscc-1 CGMCC N0.6055,具有较强的抑菌活性。
2.根据权利要求1所述的一株高抑菌活性的乳酸片球菌及应用，其特征在于所述的抑菌范围活性是指对大肠杆菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用。
3.根据权利要求1所述的一株高抑菌活性的乳酸片球菌及应用，其特征在于所述的抑菌活性是指指示菌的抑菌圈直 径达到20mm-30mm。
全文摘要
本发明涉及一株广谱高抑菌活性的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)vscc-1 CGMCC No.6055，以及利用该菌通过高密度液体深层发酵、离心富集、真空冷冻干燥处理得到粉状微生态制剂。该乳酸菌抗菌谱广，对于革兰氏阳性菌及阴性菌都有较好抗菌作用；抗菌活性高。该菌制成的微生态制剂工艺简单、生产周期短、成本低廉，每克干粉所含活菌数近万亿cfu以上。
文档编号C12N1/20GK103173373SQ20121024022
公开日2013年6月26日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者姚宏明, 刘玉荣, 董建辉, 催栩 申请人:北京伟嘉人生物技术有限公司, 北京伟嘉盛邦生物技术有限公司, 北京联合盛邦生物技术有限公司