专利名称：岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别引物及其鉴别方法
技术领域：
本发明涉及生物技术物种鉴别领域，尤其是涉及一种岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别引物及其鉴别方法。
背景技术：
大黄鱼{Pseudosciaena crocea),又名黄鱼、黄花鱼，隶属于S卢形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄鱼属(Pseudosciaena),是我国海洋捕捞主要经济鱼类之一，是中国海水网箱养殖产量最大的鱼类品种。我国沿海大黄鱼可大致分为岱
衢族、闽-粤东族和硇洲族3个地理种群。因岱衢族大黄鱼在体色、体型和风味方面等方面的优势，在市场上价格要比闽-粤东族大黄鱼高；岱衢族大黄鱼体色略显金黄色，闽-粤东族大黄鱼体色较淡；在体型上，岱衢族大黄鱼体型较瘦长，闽-粤东族大黄鱼则略胖；在营养价值和风味方面，岱衢族大黄鱼肌肉组织中氨基酸总量、人体必需氨基酸、鲜味氨基酸以及脂肪酸等反映肉质风味的主要营养价值指标都显著高于闽-粤东族官井洋家系大黄鱼。此外，岱衢族大黄鱼在生长速度、成活率、发病率和饵料系数等方面比闽-粤东族大黄鱼占有明显优势。在宁波、舟山地区养殖的大黄鱼绝大部分为闽-粤东族大黄鱼，其在外观上与岱衢族大黄鱼很相似，采用传统的性状观察，主观性强，也很难进行有效的区分。因此，开发岱衢族大黄鱼区别于闽-粤东族大黄鱼的鉴别方法，对于种质资源保护、良种选育和市场销售等方面都显得非常重要。现有的中国专利名称为不同种群大黄鱼的鉴别引物和鉴别方法(申请号为CN200610135259. 2)公开了岱衢族、闽粤东族和硇洲族大黄鱼的鉴别弓I物和鉴别方法，采用单引物RAPD-PCR扩增图谱就可区分岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼，然而，RAPD-PCR技术对DNA模板的质量、扩增的条件和体系都有很高的要求，RAPD技术自身存在体系不稳定、重复性低的缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定性高、重复性好的岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别引物及其鉴别方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别引物，引物序列为
JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'，
JI 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'；
J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'，
J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'。一种岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别方法，具体步骤如下
(I)大黄鱼总DNA提取及定量检测(2)配制PCR扩增体系
PCR扩增反应体系的配制如下各种成分及终浓度分别为缓冲液lOmM，dNTP O. 2mM,Mg2+ 2mM，各引物均为O. 2mM，Taq酶1U，大黄鱼模板DNA 10_50ng，用双蒸水补齐到25ul，所述的引物序列为
JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'，
Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'；
J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'，
J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'；
(3)PCR扩增反应· 在PCR仪上于95 V加热2-5min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环，94 V30sec，53-58°C 40sec,72°C 35sec，进行 27-30 个循环，最后，在 72°C保持 5min，4_16°C保存；
(4)琼脂糖凝胶电泳检测
PCR扩增反应结束后，取产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外凝胶成像系统观察、照相，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，若在图谱中300-400bp区间和600-700bp区间均出现I条条带，则判定该DNA样品来自岱衢族大黄鱼；若没有条带或者只有一个条带，则判定该DNA样品来自闽-粤东族大黄鱼。弓丨物对Jl的PCR扩增反应体系中大黄鱼模板DNAIOng,引物对J2的PCR扩增反应体系中大黄鱼DNA 40ng，PCR反应程序是95°C 3min，扩增循环94°C 30sec,55. 8°C40sec，72°C 35sec共28个循环，72°C 5min，4°C保存。可使扩增产物电泳图条带较亮。PCR反应结束后，取产物IOul用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。采用酚氯仿抽提法提取大黄鱼DNA。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别引物及其鉴别方法，使用鉴别引物对Jl和J2进行PCR反应，电泳拍照后，如果样品分型为D1-N2型(图2)、D2-1型(图3)或D2-2型(图4)，则判定其为闽-粤东族大黄鱼；如果样品OTU分型为Dl-Nl (即图1)，则判定该样品为岱衢族大黄鱼，上述鉴别方法具有稳定性高、重复性好，鉴别速度快、假阳性率低等优点。
图I为Dl-Nl型大黄鱼的PCR产物电泳图谱；
图2为D1-N2型大黄鱼的PCR产物电泳图谱；
图3为D2-1型大黄鱼的PCR产物电泳图谱；
图4为D2-2型大黄鱼的PCR产物电泳图谱。
具体实施例方式 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。具体实施例一
本发明一种岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别引物，引物序列如下
JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'，
Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'；
J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'，J2-下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'。发明的原理用大黄鱼高变异区2对扩增引物；B1上游引物5 '-AGACCTTCTAGGCTTTGCAATC -3'，BI 下游引物 5' - GGAGCTTTCTAGGGCTCATCT -3' ;B2 上游引物 5' -TTATTTTCTATTCTACACCCTGGC-3'，B2 下游引物 5' - AGAGGGAATACCCCGCTGT-3'对岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼高变异区进行PCR扩增，克隆测序后进行数据分析。采用BI扩增大黄鱼线粒体的D-Ioop区域，对该序列中的2部分序列片段结合分析，共检测出 2 个 0TU，分别为 Dl 型GGCATTTAGGCACAAGGTC 和 CTTCTGAGTTGTGCCCCC，D2 型GGCATTTAGGCACAAGGTT和TTTCTGAGTTGTGCCCCC ;在上述实验的基础上，使用引物对B2扩增大黄鱼线粒体的ND4区域，对该序列中的2部分序列片段也结合分析，检测出2个0TU，分别为 NI 型CAGGCCCCACCATACTAAT 和 GACAGGAACCGGCACCC，N2 型CAGGCCCCACCATACTAAC 和AACAGGAACCGGCACCC ;对上述的D-Ioop和ND4区域的OTU分型进行结合分析，可分为3个类型D1-N1、D1-N2和D2。岱衢族大黄鱼为Dl-Nl型；而闽-粤东族大黄鱼中可以分为2个类型D1-N2型和D2型，D2型有2种图谱再细分为D2-1和D2-2型。 引物3’末端的几个碱基对PCR扩增的效率至关重要。错配I个碱基，PCR扩增效率会出现一定的下降，而错配2个碱基，PCR扩增效率会出现大幅的下降。本发明在设计岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼鉴别引物时，在上述序列各片段3’末端倒数第2位碱基处引入一个错配。这样使得引物Jl上游引物和Jl下游引物，分别与Dl型DNA样本在3’末端倒数第2个碱基有I个错配，与D2型DNA样本在3’最末端错配2个碱基；也使得引物J2上游引物和J2下游引物，分别与NI型DNA样本在3’末端倒数第2个碱基有I个错配，与N2型DNA样本在3’最末端错配2个碱基。如图所示，使用鉴别引物Jl和J2进行PCR反应，电泳拍照后，如果样品分型为D1-N2型(图2)、D2-1型(图3)或D2-2型(图4)，则DNA样品来自闽-粤东族大黄鱼；如果样品OTU分型为Dl-Nl (即图I )，则该DNA样品来自岱衢族大黄鱼。具体实施例二
本发明一种岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别方法，具体步骤如下
(1)大黄鱼总DNA提取及定量检测
(2)配制PCR扩增体系
PCR扩增反应体系的配制如下各种成分及终浓度分别为缓冲液lOmM，dNTP O. 2mM,Mg2+ 2mM，各引物均O. 2mM，Taq酶1U，大黄鱼模板DNA 10_50ng，用双蒸水补齐到25ul，所述的引物序列为
JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'
Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'
J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'
J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'
(3)PCR扩增反应
在PCR仪上于95 V加热2-5min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环，94 V30sec，53-58°C 40sec,72°C 35sec，进行 27-30 个循环，最后，在 72°C保持 5min，4_16°C保存；
(4)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增反应结束后，取产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外凝胶成像系统观察、照相，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，若图谱中300-400bp区间，600-700bp区间的条带均出现，则该DNA样品来自岱衢族大黄鱼；若没有条带或者只有一个条带，则该DNA样品来自闽-粤东族大黄鱼。具体实施例三
本发明一种岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别方法，具体步骤如下
(1)采用酚氯仿抽提法提取大黄鱼DNA及定量检测
(2)配制PCR扩增体系
PCR扩增反应体系的配制如下各种成分及终浓度分别为缓冲液lOmM，dNTP O. 2mM,Mg2+ 2mM，各引物均O. 2mM，Taq酶1U，引物对Jl的PCR扩增反应体系中大黄鱼模板DNA10ng，引物对J2的PCR扩增反应体系中大黄鱼DNA 40ng，用双蒸水补齐到25ul，所述的引物序列为
JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'
Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'
J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'
J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'
(3)PCR扩增反应
PCR 反应程序是95°C 3min,扩增循环 94°C 30sec, 55. 8°C 40sec, 72°C 35sec 共 28个循环，72 °C 5min，4°C保存;
(4)琼脂糖凝胶电泳检测
PCR扩增反应结束后，取产物10ul，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外凝胶成像系统观察、照相，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，图谱中300-400bp区间，600-700bp区间的条带均出现，则该DNA样品来自岱衢族大黄鱼。考虑到岱衢族大黄鱼的鉴别方法的实用性和可操作性。摸索出一套简易的标准化操作步骤和条件至关重要。最为关键的是优选Jl和J2的两个PCR反应同时进行的反应程序以及退火温度。Real-time PCR技术有能实时定量出PCR扩增的产物的优点，因此本研究采用此项技术对各项条件进行优化。采用同样的反应体系进行Real-time PCR发现，在退火温度55. 8°C时，Jl比J2的Ct值大2，因此加大前者PCR反应体系中的模板DNA量至40ng，让两对引物的PCR扩增能大致同步进行，而PCR扩增循环数设为28，使得此时D1、N1型大黄鱼样品PCR扩增的条带较亮，而D2、N2型PCR扩增的产物还未能被凝胶成像系统所检测到。使用Real-time PCR对扩增条件进行优化，使得PCR扩增能有效区分开Dl与D2型、NI与N2型。对于不同退火温度、引物对和模板DNA样品的Ct值见表1，退火温度优选55.8°C。采用同样的反应体系进行Real-time PCR发现，在退火温度55. 8°C时，Jl比J2的Ct值大2，因此加大前者PCR反应体系中的模板DNA量至40ng，让两对引物的PCR扩增能大致同步进行，而循环数则优选28。因此摸索出PCR的条件，使得Dl型和NI型的条带能够扩增到可以用凝胶成像系统拍照出来，而D2型和N2型则检测不到条带，然后根据凝胶成像系统的图片来鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼。表I不同退火温度、引物对和模板DNA样品的Ct值
权利要求
1.一种岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别引物，其特征在于引物序列为 JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'， Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'； J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'， J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'。
2.一种岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别方法，其特征在于步骤如下 (1)大黄鱼总DNA提取及定量检测 (2)配制PCR扩增体系 PCR扩增反应体系的配制如下各种成分及终浓度分别为缓冲液lOmM，dNTP O. 2mM,Mg2+ 2mM，各引物均为O. 2mM，Taq酶1U，大黄鱼模板DNA 10_50ng，用双蒸水补齐到25ul，所述的引物序列为 JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'， Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'； J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'， J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'； (3)PCR扩增反应 在PCR仪上于95 V加热2-5min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环，94 V30sec，53-58°C 40sec,72°C 35sec，进行 27-30 个循环，最后，在 72°C保持 5min，4_16°C保存； (4)琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增反应结束后，取产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外凝胶成像系统观察、照相，根据电泳结果与提供的标准图谱对比，若在图谱中300-400bp区间和600-700bp区间均出现I条条带，则判定该DNA样品来自岱衢族大黄鱼；若没有条带或者只有一个条带，则判定该DNA样品来自闽-粤东族大黄鱼。
3.根据权利要求2所述的岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别方法，其特征在于引物对Jl的PCR扩增反应体系中大黄鱼模板DNA IOng，引物对J2的PCR扩增反应体系中大黄鱼 DNA 40ng，PCR 反应程序是95°C 3min，扩增循环 94°C 30sec,55. 8°C 40sec,72°C35sec 共 28 个循环，72°C 5min，4°C保存。
4.根据权利要求3所述的岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别方法，其特征在于PCR反应结束后，取产物IOul用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
5.根据权利要求3或4所述的岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别方法，其特征在于采用酚氯仿抽提法提取大黄鱼DNA。
全文摘要
本发明公开了一种岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别引物及其鉴别方法，特点是引物序列为引物对J15-GGCATTTAGGCACAAGGAC-3，5-GGGGGCACAACTCAGAGG-3；引物对J25-CAGGCCCCACCATACTAGT-3，5-GGGTGCCGGTTCCTGAC-3，鉴别方法具体如下大黄鱼总DNA提取及定量检测的步骤；配制PCR扩增体系及扩增反应的步骤；最后取产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若图谱中300-400bp区间和600-700bp区间的条带均出现，则该DNA样品来自岱衢族大黄鱼；否则来自闽-粤东族大黄鱼，优点具有稳定性高、重复性好，鉴别速度快、假阳性率低等。
文档编号C12N15/11GK102776284SQ20121024044
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者严小军, 沈锡权, 王梦林, 闫旭红 申请人:宁波大学