专利名称：基因Ⅵb亚型新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其构建方法
技术领域：
本发明涉及应用反向遗传技术，产生一种基因VIb亚型新城疫病毒致弱株VI bl4，用于制造疫苗。
背景技术：
反向遗传操作技术(Reversegenetics manipulation technique)是指在体外通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项石开究技术[Leyrer S，Neubert WJ, SedlmeierR. Rapid and efficient recovery of Sendaivirus from cDNA:factors influencing recombinant virus rescue. J Virol Methods1998，75(1) :47-58.]，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。由于最 终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因插入、基因敲除(缺失)、等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防制策略的研究，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路[Engel-Herbert I, Werner O, Teifke JP, et al. Characterization of arecombinant Newcastle disease virus expressing the green fluorescent protein.JVirol Methods. 2003, 108(I):19-28.]。鴻新城疫(NewcastleDisease)是由鴻 I 型副黏病毒(pigeon paramyxovirus I,PPMV-I)引起鸽的一种高度接触性，高发病率和高死亡率都很高的急性传染病，其症状同鸡新城疫相似。PPMV-I属于禽副黏病毒科、腮腺炎病毒属，通常被认为是鸡新城疫病毒(NDV)的变异株，基因组为单股负链RNA，长度为15kb，基因组序列为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，分别编码6种蛋白核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)。此外，P基因转录过程中，在484位会插入一或两个额外的非模板鸟嘌呤核苷酸(G碱基)，发生RNA编辑现象而产生V和W蛋白，它们和P蛋白含有相同的N端，但是具有不同的C端[15]。其中F和HN两种糖蛋白位于病毒囊膜表面，是分子生物学研究的首选基因。[Steward M, Vipond I B, Millar, et al. RNA editing inNewcastle disease virus. Journal of General Virology,1993，74:2539-2547.]。Dorina Ujvari 等[Ujvari D, Wehmann E, Kaleta EF,et al. Phylogeneticanalysis reveals extensive evolution of avian paramyxovirus type I strains ofpigeons(Columba livia)and suggests multiple species transmission. 2003, 96(1-2):63-73.]在1978 2002年对16个国家的鸽源新城疫分离株进行序列比对发现，绝大多数属于VIb亚型。有研究表明VIb亚型NDV大多数是从鸽群中分离得到[Kim LM, KingDJ, Guzman H, et al. Biological and phylogenetic characterization of pigeonparamyxovirus serotypes I circulating in wild North American pigeons anddoves. 2008,46(10) : 3303-3310.]，由此可见，VI b亚型NDV对鸽子具有较强的宿主特异性。近几年来，我国养鸽业发展迅速，该病在国内亦呈上升趋势，甚至一些养鸽场呈暴发流行，给养鸽业带来较大的经济损失，并且常常引起鸡新城疫的流行。近年来，基因II型疫苗株LaSota已在鸽场得到了广泛使用，但免疫鸽群中仍可发生VIb亚型NDV的感染与流行，表明当前疫苗株并不能有效预防VI b亚型NDV的感染。该类病毒的F蛋白含有典型的强毒裂解位点，有些对鸽致病力较强而对鸡却属于弱或中等毒力。VIb亚型NDV感染鸽后，体内带毒时间较长，排毒明显高于其他基因型，吴双等[吴双王伟伟，曹军平，等.不同基因型新城疫病毒对美国白羽王鸽的致病性研究.中国预防兽医学报2010，32:424.]对白羽王鸽的致病性试验中，发现相对于JS-5-05-Go(VII d亚型)，WX-10-07-Pi(VI b亚型)感染组鸽的泄殖腔棉拭子在感染后第5d至15d内均可检测到排毒，而且排毒率明显高于JS-5-05-GO感染组。加上鸽的活动范围较广，使得该类病毒在鸽群中传播迅速，家鸽和野鸽与家禽的偶然接触也增加了其他家禽感染的风险。鸽源NDV通过鸡或鸡胚传代后毒力增强的现象也多次被报道[Dortmans JC, Rottier PJ, Koch G, etal. Passaging of a Newcastle disease virus pigeon variant in chickens results inselection of viruses with mutations in the polymerase complex enhancing virusreplication and virulence. 2011，92 (2) : 336-345.]。因此，鴻源 NDV—旦突破了这种宿·主特异性而传染给其他家禽，将会给养禽业带来巨大的威胁。鸽源NDV被认为是鸡源NDV的变异株，其在抗原性上与鸡源疫苗毒株存在明显的差异[Dortmans JC, Koch G，RottierPJ,et al. A comparative infection study of pigeon and avian paramyxovirustypelviruses in pigeons:evaluation of clinical signs, virus shedding and seroconversion. 2011，40 (2) : 125-130]。研究证实，使用与流行株基因型一致的疫苗株能有效降低免疫禽群中NDV强毒的携带量及感染率(Hu S，Ma H, Wu Y, et al. A vaccine candidate ofattenuated genotype VII Newcastle disease virus generated by reverse genetics.Vaccine2009, 27(6) :904-910.)。鸽新城疫的预防应该使用专门的鸽源新城疫疫苗。一个好的疫苗候选毒株需同时具有毒力弱、繁殖滴度高和遗传稳定性好的特点，而目前国内外分离到的PPMV-I普遍存在强毒裂解位点、效价低和容易发生变异等缺点。大部分PPMV-IF蛋白裂解位点序列为强毒特征，在CEF上可以形成空斑，但对鸡的致病力较弱，推测这种毒力的差异可能由于病毒的复制能力的差异而引起。Dortmans，J. C等将PPMV-I弱毒株AV324与强毒株Herts的NP、P、M和L基因互换，利用反向遗传技术拯救出重组病毒，测定重组毒的ICPI、空斑试验，生物学特性试验结果表明NP、P、L蛋白对病毒的复制能力和毒力有直接影响[Dortmans JCj Rottier PJj Koch G，et al. The viralreplication complex is associated with the virulence of Newcastle disease virus. 2010，84(19): 10113-10120·]。2007年王伟伟等在发病的鸽群中，成功分离到了基因VIb亚型鸽源新城疫JS/07/04/Pi株，并进行了全基因组测序，登录号为FJ766526 (王伟伟.江苏省新城疫病毒分子流行病学研究及鸽源分离株基因组序列的分析.扬州大学硕士论文.扬州，扬州大学，2009. )。2012年，朱艳梅等构建出了 JS/07/04/Pi株的全长表达克隆[朱艳梅，胡增鱼，宋庆庆，等.鴻源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救.病毒学报.2012，28 (I)，67-72·]。2005年姚春峰等从发病鹅群中分离到基因VII型NDV毒株JS-5-05-GO，其尿囊液的HA价为81og2明显高于JS/07/04/Pi株(姚春峰.我国部分地区新城疫病毒的部分生物学特性鉴定及分子流行病学研究.扬州大学硕士学位论文.扬州，2007，6. ),2011年胡增磊等构建出该毒株的全长表达克隆pNDV/14，并成功将其致弱，致弱后的NDV/AI4,效价高达 101og2 [Hu Z, Hu S，Meng C，et al. Generation of a genotypeVII Newcastle disease virus vaccine candidate with high yield in embryonatedchicken eggs. Avian Dis2011, 55(3):391-397.]。
发明内容
本发明的第一个目的在于发明一种基因VI b亚型鸽源新城疫病毒致弱株，从而解决当前所用疫苗株与鸽新城疫流行株基因型不一致的问题。本发明基因VIb亚型新城疫病毒致弱株VI bI4，于2012年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)，其保藏号CGMCC No 61490·
本发明的第二个目的在于提供一种基因VIb亚型鸽源新城疫病毒致弱株VIbI4的构建方法本发明利用已建立的鸽源新城疫病毒的反向遗传操作平台，将JS/07/04/Pi株的F裂解位点突变致弱后，将繁殖性能较高的新城疫病毒rNDV/I4的NP、P和L基因片段替换转录载体ApTVT/071204上的对应部分构建出重组质粒ApTVT/ VI bI4，该重组质粒与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后，获得了具有较高繁殖性能的基因VI b亚型鸽源新城疫致弱株VIbI4,适合于疫苗的大规模生产。另外，该致弱毒株为基因VI b亚型与当前我国鸽新城疫流行株的基因型相一致，因此，同常规疫苗(基因I和II型)相比，致弱株VI bI4在控制当前鸽新城疫的发病和流行方面显示出了广阔的应用前景。本发明包括以下具体步骤I)新城疫病毒JS/07/04/Pi株的F蛋白致弱突变构建阳性质粒APF 分别从JS/07/04/Pi株基因组的4107nt 4903nt，4871ηΓ5676η 位置通过Overlap PCR克隆出部分F基因片段，在质粒pCR2. I载体中相连，获得阳性质粒APF ；分别将APF与P34用Afl II和Bsu36 I进行双酶切后，回收目的片段，连接构建成AP34 ;将质粒AP34与P58用BstB I和Xba I双酶切，回收目的片段后连接成中间质粒AP38，最后将AP38用Age I和Mlu I双酶切后替换到pTVT/071204的对应序列，构建出重组质粒ApTVT/071204，具体的构建模式见图I。两对突变引物分别是APFl 5’GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3’ (SEQ ID No. I)APF2 5’ATAAGGCGCCCTTGCCTCCCTCCTCCTGATGTGGACA3’ (SEQ ID No. 2)APF3 5，ACATCAGGAGGAGGGAGGCAAGGGCGCCTTAT3，(SEQ ID No. 3)APF4 5’TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3’ (SEQ ID No. 4)2)重组病毒VI bI4株的拯救由于rNDVI4和JS/07/04/Pi病毒基因组的2880bp和9520bp位置均有相同的单酶切位点Age I和FspA I，所以将pNDV/14和ApTVT/071204用Age I和FspA I双酶切后，回收ApTVT/071204小片断、pNDV/14大片段，连接成重组质粒ApTVT/VI bI4。具体的构建模式见图2。将质粒ApTVT/ VI bI4与pCI_NP、pCI-P和pCI_L三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，转染18h后加入终浓度为10%的SPF鸡胚尿囊液，转染60h后将转染样品接种扩11日龄SPF鸡胚，即获得基因VI b亚型新城疫病毒致弱株VI bI4。上述基因VI b亚型新城疫病毒致弱毒株VI bI4的构建方法，其特征在于步骤I)中通过APF1+APF2和APF3+APF4两对突变弓I物分别扩增APFa和APFb两个片段，凝胶电泳回收APFa和APFb，用弓I物APFl和APF4将以上两个扩增片段通过Overlap PCR方法相连，得到裂解位点产生突变的扩增片段APF，将其替换中间质粒P34的对应部分得到质粒AP34，该质粒AP34和P58相连得到AP38，利用AP38中含有的Age I和Mlu I，替换转录载体pTVT/071204上的对应部分从而获得了突变后的质粒ApTVT/071204。
图I重组质粒ApTVT/071204构建模式图。图2重组质粒ApTVT/ VI bI4构建模式图。图3重组质粒ApTVT/ VI bI4的Afl II和Xho I酶切鉴定。其中
I.ApTVT/ A/I bI4digested with Afl II ;2· ApTVT/ A/I bI4digested with Xho I ；M. DNAMarker 图4F蛋白裂解位点突变模式图(方框中为突变序列)。图5致弱株VI bI4的RT-PCR鉴定。图6致弱株VI bI4灭活苗免疫鸽后诱导抗体的产生情况(以鸽源毒株070422作为检测抗原)。
具体实施例方式本发明构建的基因VI b亚型鸽源新城疫病毒致弱毒株VI bI4于2012年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址中国科学院微生物研究所，其保藏号CGMCC No :6149，其长度为15192bp。构建步骤一鸽新城疫病毒致弱全长表达克隆构建生物材料准备新城疫病毒JS/07/04/Pi株的全长表达克隆pTVT/071204，及其中间质粒P34、P58 [朱艳梅，胡增垒，宋庆庆，等.鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救.病毒学报.2012，28 (1),67-72.]由扬州大学农业部畜禽传染病实验室构建、保存。申请人承诺自申请日起向公众发放二十年。pCR2. I 载体购自 Invitrogen 公司。I、F裂解位点的突变设计2对引物用于突变扩增JS/07/04/Pi株基因组F基因4107nt 5676nt约1569bp大小的片段。两对突变引物分别是APFl 5’ GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3’
APF2 5’ ATA\(,.GCGCmTGCCTCCr TCCTCCTGATGTGGACA’r 和APF3 5' ACATCAGGAGCA (；GGAGGC4A(,，(；GCGCdTAT 3'APF4 5’ TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3’突变碱基由斜体标注，重叠部分有下划线标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反应以转录载体pTVT/071204为模板配制如下PCR反应体系
10><Expand Buffer2.5 μ
I .M Primer ( 50 μ mol/ L)0.5μι,·
I:游 Primer (50 μ mol/ L)0.5llL
dNTPs(10mmol/L)0.5 μL
Expand High Fidelity Polymerase(3.5 υ/μ )0.1 μL
模板 cDNA (1:500 稀释)Ιμ
MgS04i.uL
s\\18.9μ PCR反应循环参数94°C预变性2min ；94°C 20s，56°C 30s，72°C延伸，延伸时间为lmin/kb, 20 循环后 72°C延伸 10min,4°C保存。用引物APFl和APF2扩增病毒基因组的4107nt 4903nt区域，用引物APF3和APF4扩增基因组的4871nt 5676nt区域。Overlap PCR反应体系及条件
I OxReaction Buffer2.5 μL
PrimerAPFl ( 50pmol/iiL)0.5liL
Primer APF4(50pmol,^L)0.5‘uL
dNTPs( I Ommol/ L)0.5 μL
Expand High Fidelity Polymerase (3.5 U/pL.)0.1 pL
APF〗和APF2扩增片段(APFa)Ιμ
APF3 和 APF4 扩增片-段(APFb)Ιμ ,
SW18.9‘liLPCR /乂应循环参数94 °C预变性4min ;50°C退火lmin，72°C延伸5min，之后再94°C 20s, 56°C 30s，72。。延伸 2min30s，20 循环后 72°C延伸 10min，4°C保存。用引物APFI和APF4将以上两个扩增片段通过Overlap PCR方法相连(Overlap部分在上述引物中以下划线标注)，得到裂解位点发生4个氨基酸突变的F基因片段，突变模式见图4。2、全长致弱质粒的构建PCR产物经回收纯化后与pCR2. I载体相连，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒，质粒提取后送南京金斯瑞生物有限公司进行测序验证，阳性质粒命名为APF，分别将APF与P34用Afl II和Bsu36 I进行双酶切后，回收目的片段，连接构建成AP34 ;将质粒AP34与P58用BstB I和Xba I双酶切，回收目的片段后连接成中间质粒AP38。最后将目的片段AP38经Age I和Mlu I酶切后替换转录载体pTVT/071204上的对应序列。重组质粒用PCR方法鉴定，阳性克隆命名为ApTVT/071204。(见图I)。步骤二 重组病毒VI bI4株的拯救生物材料准备pNDV/14 [Hu Z, Hu S，Meng C，et al. Generation of a genotype VII Newcastledisease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.Avian Dis2011, 55(3):391-397.]由扬州大学农业部畜禽传染病实验室构建、保存。pCI-NP、pCI-P、pCI_L真核表达质粒(胡顺林.鹅源新城疫病毒反向遗传技术平 台的建立及其应用.扬州扬州大学；2007)由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。BSR-T7/5 细胞[Romer-Oberdorfer, A.，et al. , Generat ion ofrecomb inant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J GenVirol, 1999. 80(11) :2987-2995.]由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。基因II型疫苗株Lasota由扬州大学农业部畜禽传染病实验室保存。VI b亚型070422株由扬州大学农业部畜禽传染病实验室于2007年发病鸽中分离并保存。以上生物材料申请承诺自申请日起向公众提供20年。I、NP、P、L基因的替换将pNDV/14 和 ApTVT/071204 用 Age I 和 FspA I 双酶切后，回收 ApTVT/071204 小片断、pNDV/14大片段，连接成重组质粒ApTVT/VI bI4。见图2.2、重组质粒ApTVT/ VI bI4的酶切鉴定质粒ApTVT/ VI bI4经Afl II酶切电泳后将出现2. 2kb、6. 3kb、9. 4kb大小的条带，而经Xho I酶切后出现I. 7kb、l. 8kb、6. 3kb和8. 4kb大小的条带，由于I. 7kb和I. 8kb相差太小，电泳仅呈现一条带。(见图3)。3、重组病毒VI bI4株的拯救将5X 105BSR-T7/5细胞接种于35_ dish中，用含lmg/mL G418和10%小牛血清的DMEM培养过夜，约60°/Γ80%铺满时用于转染。将pCI-NP、pCI_P和pCI_L3个真核表达质粒与含有NDV基因组cDNA全长的转录载体(ApTVT/ VI bI4)共转染BSR-T7/5细胞，18_24h后加入10%SPF胚尿囊液，60h后将转染样品用封口膜(paraf ilm)封好，转移到_70°C低温冰箱反复冻融2次，然后将转染细胞轻轻刮下，与细胞上清充分混合后接种扩11日龄SPF鸡胚，每个样品接种3枚，0. 4mL/枚，37°C孵育。定时照胚，弃去24h内死亡胚。取出24h后死亡胚置于4°C充分冷却，待鸡胚血管收缩后收集尿囊液。收集的尿囊液均按OIE标准所测HA效价为91og2，与母本VI b亚型毒株JS/07/04/Pi相比上升了 2个滴度。4、新城疫病毒致弱毒株VI bI4的RT-PCR鉴定将HA和HI检测均为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传两代后，收集尿囊液，抽提RNA用于RT-PCR反应，利用引物APFl和APF4扩增F基因长度约为1500bp左右大小的片段，回收目的片段进行测序鉴定，扩增片段的测序结果显示F基因的裂解位点已突变成功(图5)。用于扩增新城疫病毒致弱毒株VI bI4中F基因的引物序列为APFl 5’ GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3’
APF4 5’ TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3’步骤三、致弱毒株的生物学特性鉴定1、MDT 与 ICPI 的测定用灭菌生理盐水分别连续10倍(10_3、10_4……10_7)递增稀释致弱病毒VI bI4，每个稀释度接种5只9 11日龄SPF鸡胚，37°C孵育5d，按OIE标准方法计算病毒的MDT ;致弱病毒的尿囊液以灭菌生理盐水10倍稀释后经脑内接种10只I日龄的SPF鸡，按OIE标准方法计算病毒的ICPI。病毒5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有发生死亡，说明该毒株的MDT值大于120h ;尿囊液经脑内接种I日龄SPF鸡后，ICPI的测定值仅为O. 15，表明获救病毒的毒力完全符合弱毒株的标准。2、致弱毒株的免疫原性试验 将30只40日龄非免疫肉鸽分为3组，每组10只。第I组和第2组按O. 5ml/只的量，经肌肉注射基因II型Lasota (IV系苗，市售)和本发明致弱疫苗株VI bI4制成的油苗，第3组免疫相同剂量PBS做皮下注射。免疫后分别于第I周、第2周、第3周、第4周采血分离血清，分别用基因VI b亚型病毒JS-07-22-Pi (由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离保存，基因组序列登录号FJ766526)和基因II型LaSota为4单位抗原，测定6组鸽在第1-4周内的抗体水平。结果灭活苗组VI bI4同LaSota免疫组于第4周免疫鸽抗体水平均可达到61og2以上，同时PBS免疫组一直为O并且用VI b亚型毒株做抗原时。VI bI4灭活苗组的抗体水平比LaSota组高2个滴度，表明VI bI4灭活苗在预防鸽新城疫方面明为优于LaSota (图6)。
权利要求
1.基因VIb亚型鸽源新城疫病毒致弱株VIbI4，它的保藏号CGMCC No :6149。
2.权利要求I所述基因VIb亚型新城疫病毒致弱株VIbI4株的构建方法，其特征在于对含有鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi基因组全长的转录载体pTVT/071204中的F基因进行致弱突变后，得到F基因致弱后的转录载体ApTVT/071204，再利用基因重组的方法将新城疫病毒rNDV/I4的NP、P和L基因片段替换ApTVT/071204基因组的对应部分，得到重组质粒ApTVT/ VI bI4，该质粒与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后获得重组病毒VI bI4。
3.根据权利要求2所述基因VIb型新城疫病毒致弱株VI bI4的构建方法，其特征在于包括以下具体步骤 1)新城疫病毒JS/07/04/Pi株的F蛋白致弱突变 构建阳性质粒APF :分别从JS/07/04/Pi株基因组的4107 nt 4903 nt，4871 nt 5676nt位置通过Overlap PCR克隆出部分F基因片段，在质粒pCR2. I载体中相连，获得阳性质粒 APF ； 分别将APF与P34用J/7 II和fci/36 I进行双酶切后，回收目的片段，连接构建成AP34 ；将质粒AP34与P58用I和油a I双酶切，回收目的片段后连接成中间质粒AP38，最后将AP38用J职1和#々/ I双酶切后替换pTVT/071204的对应序列，构建出重组质粒ApTVT/071204, 两对突变引物分别是 APFl 5’ GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT 3’APF2 5’ ATAAGGCGCCCTTGCCTCCCTCCTCCTGATGTGGACA 3’ APF3 5’ ACATCAGGAGGAGGGAGGCAAGGGCGCCTTAT 3’ APF4 5’ TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG 3’ 2)重组病毒VIbI4株的拯救 由于rNDV/I4和JS/07/04/Pi病毒基因组的2880bp和9520bp位置均有相同的单酶切位点A供I和Fspk I，因此，将含有rNDV/I4基因组的转录载体pNDV/I4和ApTVT/071204以乂职I和I同时进行双酶切后，回收ApTVT/071204小片断、pNDV/I4大片段，连接成重组质粒ApTVT/VI bI4 ； 将质粒ApTVT/ VI bI4与pCI-NP、pCI-P和pCI_L三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，转染18h后加入终浓度为10%的SPF鸡胚尿囊液，转染60h后将转染样品接种9 11日龄SPF鸡胚，即获得基因VI b亚型新城疫病毒致弱株VI bI4。
4.根据权利要求3所述基因VIb亚型新城疫病毒致弱毒株VI bI4株的构建方法，其特征在于步骤I)中通过APF1+APF2和APF3+APF4两对突变引物分别扩增APFa和APFb两个片段，凝胶电泳回收APFa和APFb，用引物APFl和APF4将以上两个扩增片段通过OverlapPCR方法相连，得到裂解位点产生突变的扩增片段APF，将其连接到中间质粒中得到AP38，利用AP38中含有的J职I和#7 I，替换转录载体pTVT/071204上的对应部分从而获得了突变后的质粒ApTVT/071204。
全文摘要
本发明涉及基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其构建方法。所述基因Ⅵb亚型鸽源新城疫病毒致弱株ⅥbI4，它的保藏号CGMCCNo6149。本发明涉及应用反向遗传技术，利用含有鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi基因组全长的转录载体pTVT/071204，对其F基因进行致弱突变后获得转录载体ApTVT/071204，再将新城疫病毒rNDV/I4的NP、P和L基因片段替换ApTVT/071204上的对应部分，得到重组质粒ApTVT/ⅥbI4，该质粒与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后成功拯救出重组病毒ⅥbI4。该病毒在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。
文档编号C12N15/85GK102776156SQ201210240399
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者刘秀梵, 朱艳梅, 王晓泉, 胡增垒, 胡顺林 申请人:扬州大学