新城疫病毒rNDV-H₅2AH₉及其构建方法和应用的制作方法

专利名称：新城疫病毒rNDV-H₅2AH₉及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用反向遗传技术，拯救一株以新城疫病毒为载体共表达H5和H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株rNDV-H52AH9，用于研制疫苗。
背景技术：
反向遗传操作技术(Reversegenetics manipulation technique)是指通过在体外构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术[Rdmer-Oberddrfer A, Mundt E, Mebatsion T, Buchholz UJ, MettenleiterTC.Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.J GenVirol 1999.80(11):2987— 95.]，也叫“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工改造，解决了 RNA病毒基因组难以操作这一难题，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路[Nakaya T, et a1.Recombinant Newcastle disease virus as avaccine vector.Journal of Virology, 2001.75 (23):p.11868-73.] 新城疫(ND)是危害养禽业的重要疫病之一，新城疫病毒(NDV)基因组全长约15kb，其结构为3 ' -NP-P-M-F-HN-L-5丨，依次编码6种结构蛋白:核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein, NP)、憐蛋白(Phosphoprotein, P)、基质蛋白(Matrix protein, Μ)、融合蛋白(Fusion protein, F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein, HN)和大分子蛋白(Large protein, L)。从近十年来的ND流行特点来看，临床上所分离到的NDV毒株大多数属于基因VII型强毒株[LiuXF, Wan HQ, Ni XX, et al.Pathotypical and genotypical characterization of strainof Newcastle disease isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in someregions of China duringl985-2001.Archives of Virology, 2003, 148(7):1387-1403.],而常规的ND疫苗株的基因型主要为I和II型(如V4、LaSota等)，在遗传距离上与当前分离株相差较远。禽流感病毒(AvianInfluenza Virus,AIV)属于正粘病毒科(Orthomyxovoridae)中的A型流感病毒属，病毒基因组由8个负链的单股RNA片段组成。该病毒感染禽类的症状从轻度上呼吸道感染、产蛋量降低，直至急性全身致死性疾病。基因组分为8个片段，是负义的单股RNA，片段I 8由大到小依次命名为PB2、PBl、PA、HA、NP、NA、M和NS基因。根据表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同划分亚型，迄今已发现了 16种HA和9种NA亚型，HA蛋白是禽流感病毒的主要保护性抗原，它不仅诱导机体产生特异性抗体，而且诱导CTL反应。目前H5N1亚型禽流感 病毒在世界范围内对养禽业造成了巨大的损失，呈现高发病率和高死亡率，严重威胁着养禽业的健康发展，同时也威胁着人类的健康，是重要的人畜共患病病原。H9亚型禽流感病毒长期以来困扰养禽业发展，H9N2是目前亚洲的流行主型之一，广泛存在于家禽中，虽然表现低致病性，但由于传播广泛、能造成免疫抑制使宿主易发生继发感染、产蛋鸡的产蛋下降、发病率高，对养禽业造成了严重的危害，并具有重要的公共卫生意义。疫苗接种是防制这两种疾病的主要有效手段。常规疫苗具有耗时费力、成本高等缺点。重组活载体疫苗能达到一针防多病的效果，且节约成本，省时省力，适合于大规模免疫。载体病毒最重要的一个特点是能被用来迅速研制出针对新发高致病性传染病的基因工程疫苗。NDV除具备这一特点外，还具有遗传稳定性好、不存在与细胞基因组整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性强等诸多优点，可作为疫苗载体[Bukreyev A, Skiadopoulos MH, Murphy B R, et al.Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectors[J].Journal of Virology, 2006, 80 (21): 10293-10306.] 在 NDV 基因组内插入禽流感病毒HA基因后的重组病毒，可在动物体内复制并稳定持续地表达HA蛋白，用此重组病毒作为疫苗，可以诱导机体产生针对Al和ND的双重免疫保护力[Veits J, Wiesner D, FuchsWj et al.Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin gene protectschickens against Newcastle disease and avian influenza[J].Proc Natl Acad SciU S A, 2006, 103(21):8197-8202.Schroer Dj Veits Jj Grund C，et al.Vaccination withNewcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highlypathogenic H7 avian influenza virus[J].Avian Dis，2009，53 (2):190-197.]2007年，葛金英等报道了以NDV LaSota株为载体，将一株H5N1 HPAIV的HA基因插入NDV基因组的P、M基因之间，重组病毒接种鸡能够同时抵抗速发型新城疫病毒以及同源和异源高致病性禽流感病毒的攻击，接种BALB/c小鼠也能够激发抗流感保护性免疫[Ge J, Deng G, Wen Z, et al.Newcastle disease virus-based live attenuatedvaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge ofhomologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses [J].Journal ofVirology, 2007，81 (I): 150-158.]。该重组疫苗已于2005年12月23日在中国正式批准生产，对中国乃至世界禽流感和新城疫防控起到积极推动作用，对人用新型禽流感疫苗的研制也具有重要的借鉴意义。但目前尚无同时插入两个HA基因的相关报道。HA基因在NDV基因组的插入位置一般选择在P、M之间或者F、HN基因之间[Nakaya Tj Cros Jj Park M S，et al.RecombinantNewcastle disease virus as a vaccine vector[J].Journal of Virology, 2001, 75(23):11868-11873.Ramp K，Skiba M，Karger A，et al.1nfluence of insertion site of theavian influenza virus haemagglutinin(HA) gene within the Newcastle disease virusgenome on HA expression [J].J Gen Virol，2011，92 (Pt2): 355-360.]。Ramp K 等的实验数据表明NDV基因组可以同时容纳总长度超过3500bp的两个外源基因，对复制无明显不利影口向[Ramp K, Veits J，Deckers Dj et al.Coexpression of Avian Influenza Virus H5and NI by Recombinant Newcastle Disease Virus and the Impact on Immune Responsein Chickens[J].Avian Diseases，2011，55 (3):413-421.]。连接肽可以同时连接多个基因并且保证多基因的协同表达。口蹄疫病毒(Footand mouth disease virus ，FMDV) 2A是自剪切多肽的典型代表。在两个HA基因之间引入口蹄疫病毒具有自剪切功能的多肽2A序列(Self-cleaving 2A peptide)，使两个HA蛋白同步表达，且蛋白性质基本不发生改变，避免了融合基因中两基因由于空间的障碍而影响某个基因活性的可能，是构建单载体表达多蛋白的理想工具之一 [de Felipe P,Luke G A，Hughes L E, et al.Co-translational, intraribosomal cleavage of polypeptides bythe foot-and-mouth disease virus 2A peptide [J].J.Biol.Chem., 2003, 278:11441 —11448.]。2011年胡增垒等经反向遗传技术获得了基因vn型新城疫病毒致弱毒株NDV/AI4，效价高达 IOlog2 [Hu Z, Hu S，Meng C，et al.Generation of a genotype VII Newcastledisease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.Avian Dis 2011，55 (3): 391-397.]。含有H5亚型禽流感病毒流行株1117株HA基因的真核表达质粒PHW_HA[张妍等.clade2.3.2 H5N1亚型禽流感疫苗候选株的构建[J].畜牧兽医学报.2012, 43 (6):915-921.]及H9N2亚型禽流感病毒流行株SD12E均由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室保存。因此，本专利以新城疫病毒致弱株AI4为载体，构建可同时表达H5和H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株，以预防当前禽流感和新城疫流行株的感染。

发明内容
新城疫和禽流感是当前困扰我国养禽业的两大重要疫病。H5N1亚型禽流感是一种严重危害养禽业的高度致死性疾病；H9亚型禽流感虽然表现为低致病性，但发病率高，常呈混合感染，引起免疫抑制，减少产蛋鸡产蛋，给养禽业造成巨大的经济损失。因此，本发明的第一个目的在于提供一种以新城疫病毒为载体共表达H5和H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株，从而解决当前基因Vn型新城疫病毒、H5和Η9亚型禽流感病毒流行情况复杂、所用疫苗多而杂等问题，起到一针防多病的效果。一株新城疫病毒(Newcastle Disease Virus) rNDV_H52AH9,它的保藏号 CGMCC No:6654。所述新城疫病毒rNDV-H52AH9用于同时等量表达H5和H9亚型禽流感病毒的HA蛋白。新城疫病毒致弱株AI4为基因VII型，与我国当前NDV流行株的基因型一致；所插入的两个HA基因在遗传进化上均来源于H5和H9亚型AIV的流行毒株。因此，重组疫苗株rNDV-H52AH9在控制当前禽流感和新城疫的发病、流行方面显示出了广阔的应用前景。本发明的第二个目的在于提供一种以新城疫病毒为载体共表达H5和H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株rNDV-H52AH9的构建方法:是利用已建立的致弱的鹅源新城疫病毒AI4株的反向遗传操作平台，将H5N1亚型禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/1117/2011 株的 HA 基因与 H9N2 亚型禽流感病毒 A/Chicken/Shandong/12E/2010株的HA基因通过FMDV的2A序列串联在一起后插入转录载体pNDV/AI4的P、M的基因间隔区，构建出重组质粒pNDV/AI4-H52AH9，转染后，获得了具有较高繁殖性能的共表达H5和H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组疫苗株rNDV-H52AH9。具体包括以下步骤:1)H9亚型AIV流行株SD12E株HA基因与NDV AI4株M基因融合克隆的构建分别以SD12E株基因组cDNA和pNDV/AI4为模板PCR扩增H9 HA基因ORF和AI4株基因组3148 3804nt及3727 4735nt，通过Overlap PCR和分子克隆得到阳性质粒pH9M。
2)H5N1亚型AIV流行株1117株HA基因与NDV AI4株P基因融合克隆的构建分别以含有1117株HA基因的质粒PHW-HA和AI4株基因组cDNA为模板扩增HA基因(不含终止子)以及AI4株基因组部分P基因2714-3141nt。通过分子生物学方法将两者融合在一起并克隆入pGEMT-easy载体,得到质粒pPH5。3)全长克隆 pNDV/AI4_H52AH9 的获得质粒pPH5与pH9M同时用Aar I和Spe I进行双酶切，回收目的片段并连接，构建质粒PPH5H9M ;然后用Age I和Bstzl7 I对pPH5H9M进行双酶切后替换pNDV/AI4的对应序列，构建出重组NDV基因组全长克隆pNDV/AI4-H52AH9。4)重组病毒rNDV_H52AH9株的拯救将pC1-NP、pC1-P和pCI_L三个辅助质粒与转录载体pNDV/AI4_H52AH9共转染BSR-T7/5细胞，转染18h后加入终浓度为10%的SPF鸡胚尿囊液，60h后将转染细胞轻轻刮下，与细胞上清充分混合后接种9 11日龄SPF鸡胚，即获得重组病毒rNDV-H52AH9。


图1重组质粒pNDV/AI4_H52AH9构建模式图。图2重组质粒pNDV/AI4_H52AH9的EcoR I酶切鉴定图；M:500bp DNA ladder marker ；1:pNDV/AI4_H52AH9。图3 重组病毒 rNDV_H52AH9 的 RT-PCR 鉴定；1、2:H5S、H5R 引物扩增产物；M:200bp DNA ladder marker ;3、4:H9mS、H9mR 引物
扩增产物。图4重组病毒感染CHO细胞外源基因表达的检测；A-D为AI4感染组，E-H为rNDV_H52AH9感染组。A、E组以抗NDV HN的单克隆抗体为一抗，B、F组以H5N1亚型AIV高免血清为一抗，C、G组以H9N2亚型AIV高免血清为一抗，D、H组以SPF鸡阴性血清为一抗进行间接免疫荧光检测。。
具体实施例方式本发明以新城疫病毒为载体构建的共表达H5和H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株rNDV-H52AH9于2012年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；其保藏号CGMCC No:6654，分类命名为:新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)其长度为:18648bp。构建步骤一:以致弱的新城疫病毒AI4为载体共表达H5和H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的全长表达克隆的构建生物材料准备:新城疫病毒JS/5/05/Go株的致弱全长表达克隆pNDV/AI4 [Hu Z, Hu S，Meng C，etal.Generation of a genotype VII Newcastle disease virus vaccine candidatewith high yield in embryonated chicken eggs.Avian Dis 2011，55 (3):391-397.]，含有H5N1亚型禽流感病毒流行株A/Chicken/Yangzhou/1117/2011株HA基因的真核表达质粒PHW-HA[张妍等.clade2.3.2 H5N1亚型禽流感疫苗候选株的构建[J].畜牧兽医学报.2012,43(6):915-921.]，由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存；H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/12E/2010株由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离、保存。pGEMT-easy 载体:购自 Promega 公司。1、融合克隆pH9M的构建1)H9N2亚型禽流感病毒HA基因序列分析与基因突变提取H9N2亚型禽流感病毒SD12E株的总RNA，并用12nt随机引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3’，SEQ ID N0.1)进行RT-PCR反应，得到cDNA。序列分析发现需要对其ORF的31和1063位两个Spe I酶切位点进行沉默突变。设计2对突变引物，分别用于扩增 HA 基因 ORF 的 I 1076nt、1050 1683nt。两对突变引物分别是:TBlS:5' ATGGAAGTAGTATCACTAATAACTATACT G CT GTAGT 3’ (SEQ ID N0.2)TBlR:5’ CAACCAGCAAC (I AG O CCTGACCAACCTCCCTCTAT 3’ (SEQ ID N0.3)TB2S:5' AGGTTGGTCAGG Q CT O GTTGCTGGTTGGTATGGATT 3’ (SEQ ID N0.4)TB2R:5’TTATATACAAATGTTGCATC 3' (SEQ ID N0.5)突变碱基以斜体标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。用引物TBlS和TBlR扩增HA基因ORF的I 1076nt区域，得到片段TBl ;用引物TB2S和TB2R扩增其1050 1683nt区域，得到片段TB2。PCR反应:以反转录的cDNA为模板配制如下PCR反应体系:
权利要求
1.一株新城疫病毒(Newcastle Disease Virus) rNDV_H52AH9,它的保藏号 CGMCC No:6654。
2.权利要求1所述新城疫病毒rNDV-H52AH9用于同时等量表达H5和H9亚型禽流感病毒的HA蛋白。
3.权利要求1所述新城疫病毒rNDV-H52AH9的构建方法，其特征在于:以VIId亚型新城疫致弱株AI4的基因组全长转录载体pNDV/AI4为骨架，同时表达两株流行AIV毒株H5亚型 AIV A/Chicken/Yangzhou/1117/2011 和 H9 亚型 AIV A/Chicken/Shandong/12E/2010的HA基因；即将H5和H9亚型AIV的HA基因通过口蹄疫病毒2A基因串联在一起后，插入转录载体PNDV/AI4的P、M基因之间，获得重组新城疫病毒基因组全长cDNA克隆pNDV/AI4-H52AH9 ;该质 粒与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后获得重组病毒rNDV_H52AH9。
全文摘要
本发明涉及新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus)rNDV-H52AH9，保藏号CGMCC No6654。本发明以新城疫病毒致弱株AI4为载体，将H5和H9亚型禽流感病毒的HA基因通过口蹄疫病毒2A基因串联在一起后插入到含有AI4基因组全长的转录载体pNDV/AI4中，获得重组NDV基因组全长克隆pNDV/AI4-H52AH9。经反向遗传操作获得了重组病毒rNDV-H52AH9，该重组病毒在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，且能同时稳定表达H5和H9亚型禽流感病毒的HA蛋白，为AI和ND的多联重组基因工程活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。
文档编号C12N7/01GK103074306SQ20131004427
公开日2013年5月1日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者刘秀梵, 丁平云, 宋庆庆, 王晓泉, 刘晓文, 胡顺林 申请人:扬州大学