本发明涉及一种病毒冻干制剂的制备方法，特别是涉及一种新城疫病毒冻干制剂的制备方法。
背景技术：
新城疫病毒属于动物副粘科病毒，目前生产新城疫病毒冻干制剂的方法是将新城疫病毒LaSota株、clone30株、HBi株、F株或N79株等标准病毒液，接种于10日龄的鸡胚尿囊腔内，37℃孵化繁殖。定时收取合格的鸡胚尿囊液，与适量冷冻干燥添加剂混合均匀，定量分装于无菌西林瓶内，经预冻真空加热干燥制成冻干制剂。
用上述方法生产冻干制剂的过程中存在以下几个问题：1、冻干制剂保质期较短；2、冻干制剂的生物活性不稳定。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种保质期较长的新城疫病毒冻干制剂。
—种病毒冻干制剂的制备方法，包括新城疫病毒原液及冷冻干燥添加剂，所述冷冻干燥添加剂基本上由人血白蛋白和羟乙基淀粉组成。为了更好地维持和保护原液生物的活性，所述冷冻干燥添加剂中还含有抗坏血酸钠、精氨酸。所述冷冻干燥添加剂各组分的重量体积比为：
所述的新城疫病毒原液与所述冷冻干燥添加剂的比例是新城疫病毒原液：冷冻干燥添加剂＝1:1～5:1。
—种生产病毒冻干制剂的方法，包括以下步骤：
(1)将新城疫病毒原液过0.45ym滤芯，经过浓缩、纯化后加入冷冻干燥添加剂混匀无菌过滤，分装于西林瓶中，半加塞，其中，所述冷冻干燥添加剂基本上由人血白蛋白和羟乙基 淀粉组成；
⑵将西林瓶放入冷冻干燥器内，分别在4.8～5.2C、0.2～0.8C、-5.8～-6.2C各平衡1小时；
⑶快速冻结，将制品温度降至-48～-52C维持2.5～3.5小时；
(4)真空干燥；
(5)加热干燥，在制品温度达到25.5～37.5C条件下持续2.5～3.5小时；
(6)全部加塞，压封铝盖。
所述病毒原液是将新城疫病毒接种于10日龄鸡胚尿囊腔内，36℃孵化繁殖，收取鸡胚尿囊液。所述冷冻干燥添加剂中还有抗坏血酸钠、精氨酸。
所述冷冻干燥添加剂各组分的重量体积比为：
所述病毒原液与所述冷冻干燥添加剂的比例是新城疫病毒原液：冷冻干燥添加剂＝1:1～5:1。
本发明由于采用了上述技术方案，因此具有以下优点：
1.在冻干制剂的减压一升温一干燥过程中，适宜的升温程序对维持生物制品的生物活性、制剂的外观形态是重要的。将升温干燥的终点控制在30C并持续3小时，使制品中的残余水分以定量非共价键形式存在，以维持原液的形态、活性的稳定，减少成品冻干制剂在保存过程中的效价急速回落，并延长保存时间。
2、本发明的冷冻干燥添加剂与新城疫病毒原液具有极佳的生物相容性。羟乙基淀粉是一种水溶性变性淀粉，属于多糖，既能够很好的保护病毒活性，又是一种很好的冻干赋形剂；精氨酸是一种很好的蛋白保护物质；抗坏血酸钠是抗细胞膜氧化的维生素；特别是当加入人血白蛋白时，它们共同构成了适合于新城疫病毒原液的仿生体系，有利于原液的休眠与复苏，本发明的冻干制剂在4C条件下至少可以保存14个月。
3、微生物在液体冻结过程中，即液体降温一结冰一形成玻璃化晶态的过程中会发生从宏观到微观的适应性变形，以保持其生物活性。在冻干制剂生产的冻结过程中采用5C、0C、-6C 各平衡1小时，有利于原液对温度的适应性变形，对维持冻干制剂的生物效价是必要的。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
具体实施方式
实施例1、生产本发明冻干制剂
本发明新城疫病毒冻干制剂的生产包括以下步骤：
1、生产用种毒为clone30株；
2、孵化：取受精蛋，按照《中华人民共和国生物制品质量标准》(以下简称《标准》)中的方法37C孵育10日。用生理盐水稀释种毒，使病毒效价为91og2,每鸡胚尿囊腔接种该种毒0.1ml，置36C孵育72小时；
3、收获原液：弃去24小时前死亡的鸡胚，剩余的鸡胚置4C冷藏过夜。在无菌条件下吸取尿囊液，混匀过滤，密闭保存；
4、将收获的原液用0.45ym滤芯过滤，用超滤器浓缩，用层析柱纯化；
5、配制添加剂
(1)取抗坏血酸钠108.7克、羟乙基淀粉198.2克、精氨酸19.6克，溶于600毫升蒸馏水中，加入20％人血白蛋白20ml，过滤，115℃消毒40分钟；
⑵将第⑴溶液，用10％无菌磷酸氢二钠调节溶液的pH值至6.8±0.1，补加蒸馏水至1000毫升，混匀；
6、配制冻干制剂液：将效价调整为9log2的原液与添加剂溶液以1:1的比例混勻，注入西林瓶中，半加塞；
7、冻结：将分装好的冻干制剂液放入冷冻干燥工作箱内，预置降温程序，分别在5C、0°C、-6C各平衡1小时，启动快速冻结程序，将物料温度降至-50C，维持3小时；
8、真空干燥：启动真空工作程序，待冷冻干燥器内相对压力降至5Pa，预设升温程序，以每次升温15C维持30分钟，持续减压升温至30C并维持3小时；
9、全部加塞，压封铝盖。
成品冻干制剂按《标准》所列方法检定，合格。
实施例2、本发明冻干制剂在2～8C保存条件下的保质期
在2～8C条件下分别测定了3个批次用本发明方法制备的冻干制剂在不同时期的半数感染率(EID50)，结果如表1所示：
表1:冻干制剂在2～8C保存条件下的EID50
表2:冻干制剂在2～8C保存条件下的病毒滴度
从表中的结果可以看出，本发明的冻干制剂在2～8C条件下至少可以保存14月。
实施例3、冻干制剂在高温、高湿度条件下的保质期
观察在37℃、相对湿度75％的条件下不同保藏时期冻干制剂的EID5。，结果见表3。
表3:冻干制剂在37C相对湿度75％保存条件下的EID5。
从表中的结果可以看出，本发明冻干制剂的热稳定性符合美国食品与药物管理局关于新城疫病毒活冻干制剂的稳定性考核标准(FDA)的有关规定。
实施例43批样品冻干前后的变化
观察3批样品冻干前后的外观性状、pH值、病毒滴度变化以及水分、水溶情况，结 果见表4。
表4三批样品冻干试验结果
由表4可以看出将羟乙基淀粉、精氨酸、白蛋白三种基质按比例做为冻干佐剂进行的实验中，冻干样品呈现乳白色疏松团块，能够迅速溶解，并且冻干前后的血凝效价、pH都没有发生明显变化，冻干效果非常理想。
上述参照实施例对该种抗癌药物的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。