专利名称：干酪乳杆菌Zhang高密度培养方法、使用它们制备冻干菌粉的方法与所得到的冻干菌粉及 ...的制作方法
干酪乳杆菌Zhang高密度培养方法、使用它们制备 冻干菌粉的方法与所得到的冻干菌粉及其用途
技术领域：
本发明涉及微生物培养与应用技术领域。更具体地，本发明涉及干 酪乳杆菌Zhang高密度培养方法，还涉及使用所述的干酪乳杆菌Zhang 发酵液制备冻干菌粉的方法，还涉及釆用所述冻干菌粉制备方法所得到 的冻干粉以及它们的用途。背景技术：
众所周知，作为一种益生菌，乳杆菌以其所具备的优良益生特性， 诸如耐酸性、耐受胆汁酸、在消化道中定殖生长以及缓解乳糖不忍耐 症、抗变异突变、降低血清胆固醇、抗肿瘤、抑制肠道病原菌和抗 //e// ^ "er/^/on\改善肠道菌群和提高机体免疫功能等已经被广泛应用 于食品发酵、动物饲料及医疗保健等领域中。
高密度培养技术(High Cell Density Culture)也就是人们知道的高密度 发酵技术。由于各个菌种所能达到的最高菌体浓度相差较大，所以现有 文献并没有对高密度培养作出确切的定义。 一般而言，高密度培养是指 应用一定的培养技术或装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较传统培 养方式有显著的提高，从而达到减少培养体积，还可以缩短生产周期， 最终提高特定产物的比生产速率，减少设备投资从而降低生产成本，提 高在巿场上的竟争力。HayakawaK等人(J^em7e^5/oe"g, 1990, 70(6): 404-408)对乳酸菌高密度培养研究采用专门设计的生物发酵器，釆用膜技
术与发酵罐耦联，不断过滤除去乳酸，截留菌体返回发酵罐实现菌体细 胞循环培养，最高菌体密度可高达10"CFU/mL，该方法需耗费大量培养 基，且仅限于实验室水平，很难扩大到生产应用规模，因此不适于推广 使用。例如CN 200510094737.5涉及一种细胞培养方法及其生物反应装 置，尤其涉及一种细胞高密度循环式或连续式培养方法及其生物反应装 置。其特征是在生物反应器上加装无机膜过滤组件及补料罐，并通过一定的控制回路将三者连接为一个可用于细胞循环式高密度培养或高密度
连续式培养的生物反应器系统。CN200710004941.2涉及乳酸菌的一种高 密度培养方法，以植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和乳酸片球菌为菌种， 使用专门的乳酸菌培养基3 %大豆蛋白胨、2 %酵母浸提粉、0.5 %乙酸钠、 复合微量元素液、复合维生素液等，调节起始pH值为7.0-7.2;并在培养 过程中流加Na2C03、 KOH、 NaOH或氨水使培养液的pH值稳定在 6.0-6.8。获得高活性、高浓度的乳酸菌培养液，培养液中乳酸菌活菌数达 到9.0xl09-1.0xl0'。cfu/ml。黄良昌等人(中国乳品工业，2002，30(l): 12-15)、 靳志强等人(现代食品科技，2006， 22(2): 4-8)仍主要釆用培养基成分的 优化基础上的分批培养方式，此方法简单，容易实现规模放大，但所得 到的菌体密度不高，通常109CFU/mL。
随着发酵剂的商业化生产和应用的迅速增加，工业发酵的基本目标 自然转向了以最小的代价获得最大的产值和利润，而实现这 一 目标的工 程手段是针对每个特定过程建立相应的高效发酵模式。因此，进行工业 化生产，大规模培养非遗传修饰菌和工程菌的技术和工艺就显得日趋重 要。乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的 培养。
本发明针对一株从内蒙古传统功能性发酵乳一一酸马奶中分离，并 经过体外耐酸性试验、耐胆酸盐试验、降胆固醇试验等一系列试验筛选 得到的具有潜在益生作用的干酪乳杆菌(丄acto6ac/〃M co e/Zhang )，通 过优化液体培养基以及对培养条件的控制等方法实现高密度发酵，该高 密度发酵液经离心收集菌体、添加保护剂后冷冻干燥得到冻干菌粉，这 些可以冻干菌粉应用于益生菌发酵剂和益生菌制剂中，改善益生菌发酵 剂和益生菌制剂品质，扩大应用范围。
发明内容对时间t作图,得到斜率为pmax。
1、 中和剂的选择
研究了四种不同碱液(6mol/L NaOH, 6mol/L KOH， 25%氨水和30 %Na2C03)做中和剂进行的发酵试验，其结果见附图1。不同中和剂对 于丄.co^' Zhang的生长影响不同，使用氨水的效果最好，菌体发酵的 pmax、菌体密度和活菌数都高于用其他三种中和剂的发酵效果；Na2C03 的效果稍逊于氨水，但两者统计学差异不显著(PO.05), NaOH溶液的 效果最差。后续实验釆用氨水作为中和剂。
2、 培养基缓冲盐含量优化
在培养基中含有20g/L—水合葡萄糖、10.4g/L酵母粉、10.4g/L大豆 蛋白胨、1.0 g/L MgS04.7H20、 54mg/L MnS04.5H20与吐温80 1.0g/L与 缓冲盐，它含有3.6g/L K2HP04、 15g/L乙酸钠和2.4g/L柠檬酸钠，将该 缓冲盐用量记为"lbuffer"，减少培养基中缓冲盐用量至一半(0.5 buffer) 和1/4(0.25 buffer)及不添加缓冲盐(Obuffer)进行发酵，结果见附图2， 减少或不加缓冲盐的培养基发酵效果不及原培养基的发酵效果好。虽然 添加不同浓度缓冲盐的发酵液最终菌体密度(drycells)相差不大，但pmax 和活菌数却存在显著差异(尸<0.05)。随着缓冲盐添加量的减少，^max和 活菌数都随之降低。
3、 不同pH条件对发酵的影响
研究了丄.ca"/ Zhang在pH 5.3-6.8范围内的生长情况，根据附图3 所示，活菌数在pH5.6-6.5的范围内变化不大，但高于或低于此pH范围 后活菌数显著降低(尸<0.05), ^ax在pH5.9时达到最高，高于或低于此 pH值，生长速率呈显著降低(尸<0.05)。
4、 不同碳源浓度下丄.ca化/Zhang的生长
在pH5.9条件下，对于培养基中葡萄糖的浓度进一步研究，从附图 4可以看出，葡萄糖浓度由20g/L提高至100g/L时，菌体密度和活菌数 随葡萄糖浓度提高而提高，最高达到3.5 x i01QCFU/mL，再提高葡萄糖浓度至更高时，菌体密度不再增加，在150g/L葡萄糖浓度培养时菌体死亡 增加，活菌数显著下降。p,皿随着葡萄糖浓度增加而显著降低(p<0.05)， 高浓度葡萄糖对菌体的生长有一定抑制作用，但在葡萄糖浓度50-100g/L
的范围内h丽变化不大。
5、 不同通气条件的影响
从附图5可见，不同通气条件对于Zhang的生长存在一定影 响。总体上厌氧条件培养效果略优于通气培养。但釆用不同的通气方式 进行的厌氧发酵，效果不同，间歇通氮气条件下发酵得到的菌体密度、 活菌数和比生长速率高于连续通氮气发酵。间歇通空气(微通氧状态) 下发酵效果略逊于间歇氮气，优于连续通氮气的效果，其他通气条件发 酵效果不佳。
6、 培养方式
在发酵6h时开始向发酵液中流加新鲜培养基，实现补料分批培养， 从附图6中可以看出，以100mL/h速度补料，发酵至12h和14h时活菌 数和菌体密度相继达到最大，继续培养则活菌数和菌体密度开始下降。 100mL/h补料分批发酵与分批培养(培养基葡萄糖浓度80g/L )的发酵效 果无显著差异(尸<0.05)。当补料速度增加至200mL/h时，发酵在8h就 达到峰值，继续补料出现了稀释效应，菌体密度和活菌数下降。
由此可见，葡萄糖浓度调整为80-100g/L,发酵过程中流加氨水中和 发酵产生的乳酸，使pH保持在偏酸性(pH 5.9)，通过间歇通氮气(每 2h通气2min)的方法保持环境厌氧，分批培养方式下37。C保温发酵 10-12h，菌体密度比优化前(4.8xl09CFU/mL)提高7倍以上，细胞干重 达到7g/L,活菌数3.5xl(TCFU/mL。能够满足益生菌制品生产所要求的 高菌体密度。
e.终止发酵
所述发酵介质的pH不再降低与中和剂流加停止时，就终止发酵，于 是得到所述的干酪乳杆菌Zhang活菌数达l(Tcfu/ml以上的干酪乳杆菌高
密度发酵液。
所述干酪乳杆菌Zhang活菌数的测定方法是釆用本技术领域的技术人员熟知的平板倾注的测定方法，例如用MRS培养基倾注平板计数。
本发明还涉及一种干酪乳杆菌Zhang冻干菌粉的制备方法，其特征 在于该方法的步骤如下
a. 所述干酪乳杆菌Zhang高密度发酵液的浓缩 使用在前面描述的干酪乳杆菌Zhang的高密度培养方法制备的干酪
乳杆菌Zhang高密度发酵液在室温下在5000-12000g条件下离心5-30分 钟，得到干酪乳杆菌Zhang菌体浓缩液。
所述的干酪乳杆菌Zhang菌体浓缩液是发酵液经离心除去上清液后 得到的产物。
b. 添加保护剂
往步骤a)得到的干酪乳杆菌Zhang菌体浓缩液添加以重量计5-10倍 的浓度18-40的保护剂水溶液，得到干酪乳杆菌Zhang菌体悬液。
在本发明的意义上，所述的保护剂应该理解是保护菌体在冷冻干燥 过程中免受或减轻低温冷冻干燥对菌体的破坏作用。
所述的保护剂选自脱脂乳粉、甘油、维生素C、谷氨酸、山梨醇、海 藻糖或乳糖。
优选地，所述的保护剂选自脱脂乳粉、维生素C、谷氨酸、海藻糖或 乳糖。
更优选地，所述的保护剂选自脱脂乳粉、维生素C、谷氨酸或乳糖。 所述保护剂水溶液的浓度是18-40重量％。优选地，18-35%。更优 选地20-35%。
c. 干燥将上述步骤b)得到的所述干酪乳杆菌Zhang菌体悬液在温 度-10--50°(:下进行冷冻干燥,得到所述的干酪乳杆菌211肌8冻干菌粉。
所述的冷冻干燥是本技术领域的技术人员已知的。 一般而言，所述 的冷冻干燥是在温度-10-5(TC与真空1.3-13帕下进行的，在所述的冷冻 干燥后应该达到冻干菌粉的水分含量不高于8%。
所述干酪乳杆菌Zhang菌体悬液冷冻干燥使用设备是北京天利深冷 设备股份有限公司以商品名大型药用真空冷冻干燥机销售的或杭州创意 真空冷冻干燥设备厂以商品名真空冷冻干燥机销售的设备。这种设备的特征在于控制在低温真空条件下，是水份以升华实现干燥，能很好低保 护菌体的活力少受破坏。
本发明还涉及釆用上述方法得到的干酪乳杆菌Zhang冻干菌粉，其 特征在于它含有10"cfU/ml以上的所述干酪乳杆菌Zhang总活菌数。所述 干酪乳杆菌Zhang总活菌数是釆用本技术领域的技术人员熟知的平板倾 注的测定方法，例如用MRS培养基倾注平板计数。
本发明还涉及所述的酪乳杆菌Zhang冻干菌粉在益生菌发酵剂或益 生菌制剂中的用途。
所述的益生菌发酵剂例如可以是一种或多种选自嗜酸乳杆菌、保加 利亚乳杆菌、嗜热链球菌或双歧杆菌的益生菌发酵剂。 一般地，可以按 照1-30%量直接地把本发明的酪乳杆菌Zhang冻干菌粉均匀地加到所 述的益生菌发酵剂中，或者采用其它方式加到所述的益生菌发酵剂中。
所述的益生菌制剂例如可以是一种或多种选自嗜酸乳杆菌、干酪乳 杆菌或双歧杆菌的益生菌制剂。 一般地，可以按照1-30%量直接地把本 发明的酪乳杆菌Zhang冻干菌粉均匀地加到所述的益生菌制剂中，或者 釆用其它方式加到所述的益生菌制剂中。
本发明的千酪乳杆菌Zhang是从酸马奶中分离得到的耐酸和耐胆盐 的益生菌。在未经过高密度培养研究前在普通MRS培养基中常规培养其 活菌数仅108cfu/mL,远不能满足益生菌发酵剂和益生菌制剂对高活菌数 的要求。而采用本发明的方法经高密度培养后得到的干酪乳杆菌Zhang 冻干菌粉可直接加到一些益生菌制剂或益生菌发酵剂，该干酪乳杆菌 Zhang不但保持其充分的活性，而且因干酪乳杆菌Zhang含量高可以发挥 其将胆固醇、增强免疫等诸多益生功效。
有益效果
本发明的干酪乳杆菌Zhang对酸和胆盐耐受能力强，并且具有降胆 固醇、抑制肿瘤、提高免疫力等多种益生功能，釆用本发明高密度发酵 方法可以获得101Gcfu/mL以上的所述干酪乳杆菌Zhang总活菌数发酵液， 较常规MRS培养基中培养，培养时间可以缩短5 10小时，活菌数(4.8 x 108 cfu/mL)提高50倍以上，高密度发酵液经冷冻干燥可得到10"cfli/mL活菌数的高活力的冻干菌粉，可以满足对于益生菌发挥益生功 效所需的高活力的要求，直接应用于益生菌制剂或益生菌发酵剂。
图i不同中和剂对生长的影响
图2不同缓冲盐浓度对于丄.owe/ Zhang生长的影响
图3不同pH条件下丄.cwe/ Zhang的生长情况
图4不同葡萄糖浓度下Z. cfl化/Zhang的生长情况
图5不同通气条件下丄.cwe/Zhang的生长情况
图6补料分批培养与分批培养菌体密度和活菌数变化，其中國和口分 别代表100mL/h补料分批培养的细胞干重和活菌数；*和0分别代表200 mL/h补料分批培养的细胞干重和活菌数；A和A分别代表分批培养(培养 基葡萄糖浓度80 g/L)的细胞干重和活菌数变化具体实施方式
下面实施例对本发明作进 一 步说明而不限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1:干酪乳杆菌Zhang的高密度发酵
这个实施例按照下述步骤进行
a.菌种的活化
将-4(TC冷冻保存的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)接种于 5ml MRS液体培养基中。使用由上海一恒科学仪器有限公司以商品名生 化培养箱销售的培养设备在温度37。C下培养18小时，如此传代培养2次 得到活化的菌种。
所述的MRS液体培养基组成如下10g由北京奥博星生物技术责任 有限公司以商品名蛋白胨销售的蛋白胨、10g由北京奥博星生物技术责任 有限公司以商品名牛肉浸粉销售的牛肉膏、5g由北京奥博星生物技术责 任有限公司以商品名酵母浸粉销售的酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢 二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、lg吐温80、 200mg硫酸镁、54mg硫 酸锰与1000mL蒸馏水。上述这些原料用1000mL蒸馏水溶解后，再使用 无机酸将其pH调节到6.5，然后在温度121。C下进行灭菌15min，这样得到所述的MRS液体培养基。
b. 培养基的配制
分别称取下述原料70g —水合葡萄糖、8g由厦门鑫隆达化学试剂 公司以商品名酵母浸粉销售的酵母粉、12g由厦门鑫隆达化学试剂公司以 商品名大豆蛋白胨销售的大豆蛋白胨、3.0g磷酸氢二钾、13g乙酸钠、2.0g 柠檬酸钠、1.0gMgSO4.7H2O、 0.05gMnSO4.5H2O与0.88g吐温-80;
将上述原料溶于1000重量份水中，搅拌均匀，再使用浓度1 mol/L 盐酸水溶液将其pH值调节到6.5，再在温度12rC下灭菌15分钟，这样 得到所述的培养基。
c. 菌种发酵液的制备
以使用所述的培养基重量计，按照2重量％将步骤a)得到的活化干 酪乳杆菌Zhang菌种接种于在步骤b)得到的所述培养基中，使用上海一 恒科学仪器有限公司以商品名生化培养箱销售的培养设备在温度37。C下 培养10小时，得到干酪乳杆菌Zhang菌种发酵液，釆用测600nm吸光值 方法测量该干酪乳杆菌Zhang菌种发酵液的活菌数达到108 CFU/mL以 上。
d. 发酵
以使用所述的培养基重量计，按照5重量％将步骤c)得到的所述干 酪乳杆菌Zhang菌种发酵液接种于在步骤b )得到的所述培养基中，使用 上海高机生物工程有限公司以商品名BIFO系列生物发酵罐销售的带有 控温、通气和流加组件的发酵装置，在温度37"C下进行发酵IO小时，在 所述的发酵过程中，同时通过流加浓度15%氨水将该发酵介质的pH保 持在5.9，以每隔2小时以0.04vvm的流速向发酵介质中通空气2分钟， 保持微通氧的条件。这些空气是通过0.22)im滤膜过滤净化处理的干燥空 气，以微型气泡形式均匀分散地通过所述的发酵介质。
e. 终止发酵
所述发酵介质的pH不再降低与中和剂流加停止时，就终止发酵，釆 用MRS培养基平板倾注方法测量该干酪乳杆菌Zhang菌种发酵液的活菌 数达到2.8 x 101Q CFU/mL。于是得到所述的干酪乳杆菌Zhang活菌数达2.8xl01Qcfu/ml的干酪乳杆菌高密度发酵液。
实施例2:干酪乳杆菌Zhang的高密度发酵 这个实施例按照下述步骤进行
a. 菌种的活化
将-40。C冷冻保存的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)接种于 5ml MRS液体培养基中。使用由上海一恒科学仪器有限公司以商品名生 化培养箱销售的培养设备在温度37'C下培养18小时，如此传代培养2次 得到活化的菌种。
所述的MRS液体培养基组成如下10g由北京奥博星生物技术责任 有限公司以商品名蛋白胨销售的蛋白胨、10g由北京奥博星生物技术责任 有限公司以商品名牛肉浸粉销售的牛肉膏、5g由北京奥博星生物技术责 任有限公司以商品名酵母浸粉销售的酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢 二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、lg吐温80、 200mg硫酸镁、54mg硫 酸锰与1000mL蒸馏水。上述这些原料用1000mL蒸馏水溶解后，再使用 无机酸将其pH调节到6.5,然后在温度121。C下进行灭菌15min,这样得 到所述的MRS液体培养基。
b. 培养基的配制
分别称取下述原料80g—水合葡萄糖、10g由厦门鑫隆达化学试剂 公司以商品名酵母浸粉销售的酵母粉、10g由厦门鑫隆达化学试剂公司以 商品名大豆蛋白胨销售的大豆蛋白胨、3.0g磷酸氢二钾、13g乙酸钠、2.0g 柠檬酸钠、1.0gMgSO4.7H2O、 0.054gMnSO4.5H2O与l.OOg吐温-80;
将上述原料溶于1000重量份水中，搅拌均勻，再使用浓度1 mol/L 盐酸水溶液将其pH值调节到6.5，再在温度121。C下灭菌15分钟，这样 得到所述的培养基。
c. 菌种发酵液的制备
以使用所述的培养基重量计，按照2重量％将步骤a)得到的活化干 酪乳杆菌Zhang菌种接种于在步骤b)得到的所述培养基中，使用上海一 恒科学仪器有限公司以商品名生化培养箱销售的培养设备在温度37°C下 培养10小时，得到干酪乳杆菌Zhang菌种发酵液，釆用测600nm吸光值方法测量该干酪乳杆菌Zhang菌种发酵液的活菌数达到108 CFU/mL以 上。
d. 发酵
以使用所述的培养基重量计，按照5重量％将步骤c)得到的所述干 酪乳杆菌Zhang菌种发酵液接种于在步骤b)得到的所述培养基中，使用 上海高机生物工程有限公司以商品名BIFO系列生物发酵罐销售的带有 控温、通气和流加组件的发酵装置，在温度37"C下进行发酵IO小时，在 所述的发酵过程中，同时通过流加浓度20%氨水将该发酵介质的pH保 持在6.0，以每隔2小时以0.04vvm的流速向发酵介质中通氮气2分钟， 保持微通氧的条件。这些氮气纯度99.9%的高压氮气，以微型气泡形式均 勻分散地通过所述的发酵介质。
e. 终止发酵
所述发酵介质的pH不再降低与中和剂流加停止时，就终止发酵，釆 用MRS培养基平板倾注方法测量该干酪乳杆菌Zhang菌种发酵液的活菌 数达到3.5 x 101G CFU/mL。于是得到所述的干酪乳杆菌Zhang活菌数达 3.5xl0,fo/ml的干酪乳杆菌高密度发酵液。
实施例3:干酪乳杆菌Zhang普通发酵
这个实施例按照下述步骤进行
a.菌种的活化
将-4(TC冷冻保存的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)接种于
5ml MRS液体培养基中。使用由上海一恒科学仪器有限公司以商品名生 化培养箱销售的培养设备在温度37'C下培养18小时，如此传代培养2次 得到活化的菌种。
所述的MRS液体培养基组成如下10g由北京奥博星生物技术责任 有限公司以商品名蛋白胨销售的蛋白胨、10g由北京奥博星生物技术责任 有限公司以商品名牛肉浸粉销售的牛肉膏、5g由北京奥博星生物技术责 任有限公司以商品名酵母浸粉销售的酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢 二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、lg吐温80、 200mg硫酸镁、54mg硫 酸锰与1000mL蒸馏水。上述这些原料用1000mL蒸馏水溶解后，再使用无机酸将其pH调节到6.5，然后在温度121"C下进行灭菌15min,这样得 到所述的MRS液体培养基。 b.发酵液的制备
以使用所述的MR S培养基重量计，按照2重量％将步骤a)得到的活 化干酪乳杆菌Zhang菌种接种于在所述MRS培养基中，使用上海一恒科 学仪器有限公司以商品名生化培养箱销售的培养设备在温度37。C下培养 18小时，采用MRS培养基平板倾注方法测量该干酪乳杆菌Zhang菌种 发酵液的活菌数达到4.5xi08 CFU/mL。于是得到所述的干酪乳杆菌 Zhang活菌数达4.5xl08cfb/ml的干酪乳杆菌发酵液
实施例4:干酪乳杆菌Zhang普通发酵
这个实施例按照下述步骤进行
a. 菌种的活化
将—4(TC冷冻保存的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)接种于 5ml MRS液体培养基中。使用由上海一恒科学仪器有限公司以商品名生 化培养箱销售的培养设备在温度37'C下培养18小时，如此传代培养2次 得到活化的菌种。
所述的MRS液体培养基组成如下10g由北京奥博星生物技术责任 有限公司以商品名蛋白胨销售的蛋白胨、10g由北京奥博星生物技术责任 有限公司以商品名牛肉浸粉销售的牛肉膏、5g由北京奥博星生物技术责 任有限公司以商品名酵母浸粉销售的酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢 二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、lg吐温80、 200mg硫酸镁、54mg硫 酸锰与1000mL蒸馏水。上述这些原料用1000mL蒸僧水溶解后，再使用 无机酸将其pH调节到6.5，然后在温度121。C下进行灭菌15min,这样得 到所述的MRS液体培养基。
b. 发酵液的制备
以使用所述的MRS培养基重量计，按照1重量。/。将步骤a)得到的活 化干酪乳杆菌Zhang菌种接种于在所述MRS培养基中，使用上海 一恒科 学仪器有限公司以商品名生化培养箱销售的培养设备在温度37。C下培养 20小时，采用MRS培养基平板倾注方法测量该干酪乳杆菌Zhang菌种发酵液的活菌数达到4.8xl08 CFU/mL。于是得到所述的干酪乳杆菌 Zhang活菌数达4.8xl08cfu/ml的干酪乳杆菌发酵液 实施例5:
干酪乳杆菌(丄flctok c/〃w c似d Zhang )冻干菌粉的制备 将干酪乳杆菌高密度发酵液经10000g离心得到浓缩菌体，按浓缩菌 体与保护剂脱脂乳粉溶液比例1: IO加入保护剂溶液，混合均匀后入冷 冻干燥机中冷冻干燥36小时，得到干酪乳杆菌冻干菌粉。菌粉的活菌数 可达10"cfu/g以上，可直接应用于益生菌发酵剂或益生菌制剂。 实施例6:
干酪乳杆菌U"cto^c///^cme/Zhang)冻干菌粉应用于益生菌发酵
剂
将干酪乳杆菌冻干菌粉按10重量％加入到由保加利亚乳杆菌和嗜热 链球菌混合直投型发酵剂中，混合均匀即可得到含干酪乳杆菌 (丄acto^c/〃^ca化/Zhang)的益生菌发酵剂。此发酵剂可用于发酵酸奶 或发酵乳饮料的生产加工。
实施例7:
干酪乳杆菌冻干菌粉应用于益生菌制剂
将干酪乳杆菌冻干菌粉按10重量％加入到双歧杆菌医用益生菌制剂 基质中，混合均匀后制成胶囊或压片，即可得到含干酪乳杆菌101Q cfu/g 的益生菌胶囊或益生菌片剂
权利要求
1、一种干酪乳杆菌Zhang的高密度培养方法，其特征在于该方法步骤如下a. 菌种活化将冷冻保存的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)CGMCC 1697接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18-24小时，如此传代培养1-2次得到所述的活化干酪乳杆菌Zhang菌种；b. 培养基的配制首先，分别称取下述原料60-90重量份一水合葡萄糖、8-12重量份酵母粉、8-12重量份大豆蛋白胨、3.0-3.5重量份磷酸氢二钾、13-15重量份乙酸钠、2.0-2.5重量份柠檬酸钠、0.8-1.0重量份MgSO4.7H2O、0.04-0.08重量份MnSO4.5H2O与0.8-1.0重量份吐温-80；然后，将上述原料溶于1000重量份水中，搅拌均匀，再使用中和剂将其pH值调节到6.4-6.6，再在温度120-122℃下灭菌15分钟，这样得到所述的培养基；c. 菌种发酵液的制备以使用所述的培养基重量计，按照1-3重量％将步骤a)得到的活化干酪乳杆菌Zhang菌种接种于在步骤b)得到的所述培养基中，在温度37℃下培养8-10小时得到干酪乳杆菌Zhang菌种发酵液；d. 发酵以使用所述的培养基重量计，按照4-10重量％将步骤c)得到的所述干酪乳杆菌Zhang菌种发酵液接种于在步骤b)得到的所述培养基中，在温度35-37℃下进行发酵8-16小时，在所述的发酵过程中通过流加中和剂将该发酵介质的pH保持在5.8-6.5，同时保持微通氧或厌氧的条件；e. 终止发酵所述发酵介质的pH不再降低与中和剂流加停止时，就终止发酵，于是得到所述的干酪乳杆菌Zhang活菌数达1010cfu/ml以上的干酪乳杆菌高密度发酵液。
2.根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述的中和剂是一种或多种选自NaOH、 KOH或氨水的中和剂，所述中和剂的浓度是15-40重量％。
3. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于在所述的发酵过程中通过 流加中和剂将该发酵介质的pH保持在5.8-6.2。
4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于所述干酪乳杆菌Zhang菌种 发酵液接种于在步骤b)得到的所述培养基中，在温度37'C下进行发酵10 小时。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的微通氧是通空气 0.02-0.05vvm或每两小时以0.03-0.1vvm量通空气一次。
6. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述的厌氧发酵是通氮气 0.02-0.05vvm或每两小时以0.03-0.1vvm量通氮气一次。
7. —种干酪乳杆菌Zhang冻干菌粉的制备方法，其特征在于该方法的 步骤如下a. 所述干酪乳杆菌Zhang高密度发酵液的浓缩让根据权利要求1-6中任一项权利要求所述方法制备的干酪乳杆菌 Zhang高密度发酵液在室温下在5000-12000g条件下离心5-30分钟，得到 干酪乳杆菌Zhang菌体浓缩液；b. 添加保护剂往步骤a)得到的干酪乳杆菌Zhang菌体浓缩液添加以重量计5-10倍的 浓度18-25重量％的保护剂水溶液，得到干酪乳杆菌Zhang菌体悬液；c. 干燥将上述步骤b)得到的所述干酪乳杆菌Zhang菌体悬液在温 度-l(TC ~-WC下进行冷冻干燥，得到所述的干酪乳杆菌Zhang冻干菌粉。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的保护剂选自脱脂乳 粉、甘油、维生素C、谷氨酸、山梨醇、海藻糖或乳糖。
9. 根据权利要求7或8所述方法得到的干酪乳杆菌Zhang冻干菌粉， 其特征在于它含有10"cfu/ml以上的所述干酪乳杆菌Zhang总活菌数。
10. 根据权利要求9所述的酪乳杆菌Zhang冻干菌粉在益生菌发酵剂 或益生菌制剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及一株具有益生功效的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的高密度发酵技术，包括增殖培养基和发酵工艺条件优化控制，和该菌株的高活力冻干菌粉的制备技术。通过本发明可以得到10<sup>11</sup>cfu/mL以上活菌数的干酪乳杆菌的冻干菌粉，能够直接应用于该菌株益生菌发酵剂和益生菌制剂的制备和应用。
文档编号C12N1/20GK101418270SQ20081017585
公开日2009年4月29日 申请日期2008年11月6日 优先权日2008年11月6日 公开号200810175856.发明者张和平, 妍 李, 赵文静, 高鹏飞 申请人:内蒙古农业大学 被以下专利引用 (3),