专利名称：干酪乳杆菌菌株用于制备抑制肥大细胞活化之组合物的用途的制作方法
干酪乳杆菌菌株用于制备抑制肥大细胞活化之组合物的用
途本发明涉及预防和治疗肥大细胞参与的慢性或急性疾病(例如变态反应和某些 自身免疫病)的领域。更确切地，本发明涉及益生菌用于抑制肥大细胞活化的用途。众所周知，肥大细胞是变态反应的主要参与者。变态反应主要依赖于IgE抗体。肥 大细胞表达高亲和力IgE受体(Fe ε RI)，在体内一定比例的所述受体被IgE抗体所占据。 当多价变应原与IgE抗体结合使得Fc ε RI在细胞表面聚集时，Fc ε RI转导活化信号从而导 致肥大细胞活化。活化的肥大细胞释放并分泌多种炎性分子。这些包括储存于肥大细胞颗 粒中预先形成的血管活性胺和酶(Miller和Pemberton，2002)，新形成的衍生自脂质的前 列腺素、血栓烷和白三烯(Triggiani等，1995)，新转录的细胞因子(Galli等，1991)、生长 因子和趋化因子(Kaplan，2001)。这些介质具有广泛的生物学效应。它们增加血管通透性， 触发平滑肌收缩，吸引并活化大量炎性细胞。总之，它们在几分钟内同时产生急性反应，接 着在数小时内产生后期反应，在数天内产生慢性反应，以及在数月内产生组织重构(tissue remodelling)。肥大细胞不仅表达IgE受体，还表达IgG受体(Fe y R) (Benhamou等，1990 ；Daeron 等，1980)。这些包括活化性受体(小鼠中的Fc y RIIIA，人的Fc y RIΙΑ)和抑制性受体(人 和小鼠中的Fc y RIIB)。当通过IgG免疫复合物聚集时，活化性Fc γ R引发与Fc ε RI同样 的生物学应答(Daeron等，1992 ；Hazenbos等，1996 ；Latour等，1992)。当通过免疫复合物 与Fc ε RI或与活化性Fc γ R共聚集时，Fc γ RIIB负调控由IgE或IgG抗体诱导的肥大细胞 活化(Daeron等，1995a ；Daeron等，1995b)。最近发现，在自身免疫性关节炎(Lee等，2002) 和脑炎(Robbie-Ryan等，2003)的鼠模型中，肥大细胞在IgG依赖的组织特异性自身免疫 性炎症中扮演关键角色。这些病理症状的临床表现在肥大细胞缺陷的小鼠中得以消除。此 外，这些疾病的发病严格地依赖于肥大细胞上活化性Fc γ R与抑制性Fc γ R之间的比例，并 依赖于它们与IgG抗体的结合(Nigrovic等，2007 ；Robbie-Ryan等，2003)。除了在炎症中的作用，最近发现肥大细胞与微生物相互作用并有助于针对病原体 的保护。它们存在于几乎所有组织中，特别是那些与外部环境交界的部位(皮肤、舌、胃、 肠、肺等)。它们表达Toll样受体(Toll-like Receptors,TLR)以及能使它们与细菌和微 生物来源之可溶性分子(包括内毒素、CpG核苷酸、肽聚糖和脂肽)相互作用的其它受体。 当与其配体结合后，大多数这些受体可转导还导致促炎介质分泌的信号(Arock等，1998)。 此外，肥大细胞可吞噬细菌(Arock等，1998)。由盲肠结扎和穿刺引起的小鼠腹膜炎模型清 楚地表明肥大细胞在细菌感染中的保护作用此种攻击导致发生严重的腹膜炎后，大多数 野生型小鼠仍存活，而大多数肥大细胞缺陷的小鼠则死亡(Shelley等，2003 ；Supajatura 等，2001)。基于以上的数据，肥大细胞可作为固有免疫系统的细胞，又因为它们表达FcR，所 以它们可借助抗体来参与获得性免疫。因此，它们很好地适用于固有免疫和获得性免疫中， 从而使两者相互协作。因此，本发明人研究肥大细胞中固有免疫和获得性免疫之间可能的 相互影响。特别地，他们选择研究益生菌是否以及如何干预IgE和IgG诱导的肥大细胞活
4化。现已发现某些益生菌菌株对某些炎性疾病(包括某些变态反应)具有有益作用。 但是，迄今所有发表的实验均关注导致变态反应或其它炎性疾病的免疫应答之诱导。例如， Kim等人描述，在用卵清蛋白初次致敏2周前，为小鼠口服施用益生菌7周，抑制了该模型中 变态反应应答的诱导(Kim等，2005)。然而，免疫应答(如变态反应应答)可分为两个阶段，即诱导阶段和应答阶段。迄 今，尚不知道益生菌菌株对应答阶段(其需要肥大细胞的活化)的作用。如以下实验部分所举例地，本发明人出人意料地发现，某些益生菌能够抑制肥大 细胞活化，从而对某些人类炎性疾病(包括自身免疫病和变态反应)具有保护性作用。重 要的是，本发明人得到的结果显示，这些益生菌甚至能阻止已被致敏之对象或已发生自身 免疫病之对象中的致病性免疫应答。由于可根据下文描述的发明来治疗已发生炎性疾病的 患者，因此这些益生菌开辟了一条治疗新途径。因此，本发明的第一方面是干酪乳杆菌(Lcasei)菌株和/或短双歧杆菌 (Bifidobacterium breve)菌株在制备用于抑制肥大细胞活化之组合物中的用途。取决于临床情况和施用途径，根据本发明制备的组合物可抑制IgE和/或IgG诱 导的肥大细胞活化。因此，它们可用于预防、缓解和/或治疗由抗原存在时抗体活化肥大细 胞引起的任何炎性症状。特别地，当IgE诱导的活化被抑制时，这些组合物可用于预防、缓解和/或治疗变 态反应或变应性表现。本文涉及的变态反应由IgE抗体所引起，所述IgE抗体与肥大细胞结 合并且当识别特异性抗原时触发肥大细胞活化。重要地，这些组合物可用于预防、治疗或缓 解变应性表现(例如哮喘(athma)、鼻炎或枯草热、变应性湿疹(aczema)、过敏性休克等)， 甚至是已被抗原致敏或已被诊断为对该抗原过敏的对象中的变应性表现。例如，患有枯草 热多年的人可通过施用根据本发明制备的组合物来预防症状复发。许多抗原均可引起变态 反应，其可表现为多种临床症状。常引起变态反应的抗原的非限制性实例有环境变应原，例 如螨(如Der ρ 2)、蟑螂抗原、桦树花粉(如Bet V 1)、草的花粉、动物毛皮屑抗原(如猫 的Fel d 1)、蜂毒(如磷脂酶)或食物变应原(如乳(尤其是牛乳)、花生、虾、大豆、蛋、谷 类制品和水果等)。根据不同的情况和个体，临床症状可以是局部的(例如在变应性鼻炎、 结膜炎或耳炎中的情形)、区域性的(例如，哮喘、皮炎、胃肠病症和昆克水肿(Quincke' s oedema))或普遍性的(例如，过敏性休克)。有些疾病有时也被认为是“变态反应”，但它们 并不依赖于上面提及的机制。例如，迟发型过敏反应就是一个这样的例子。当根据本发明得到的组合物抑制IgG诱导的肥大细胞活化时，该组合物可有利地 用于预防、缓解或治疗自身免疫病，例如类风湿性关节炎、脑脊髓炎、多发性硬化症、大疱性 类天疱疮、急性播散性脑脊髓炎(acute disseminated enc印halomyelitis，ADEM)、强直性 脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid antibody syndrome，APS)、自身免疫性肝 炎、自身免疫性卵巢炎、腹腔疾病(celiac disease)、克罗恩病(Crohn' s disease)、妊娠 ti^l^^i^ (gestational pemphigoid)、月市出in肾(Goodpasture' s syndrome)、 格雷夫斯病(Graves' disease)、吉-巴综合征(Guillain_Barr6syndrome，GBS，也称“急性 炎性脱髓銷性多神经病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy)，，、“急性 特发性多神经根神经炎(acute idiopathic polyradiculoneuritis) ”、“急性特发性多神
5经炎(acute idiopathic polyneuritis)，，禾口“兰德里上 亍性麻搏(Landry ‘ s ascending paralysis)”)、桥本病(Hashimoto ‘ s disease)、特发性凝血细胞减少性紫癜、川崎病 (Kawasaki ‘ s disease)、红斑狼疮、重症肌无力、视性眼阵挛-肌阵挛综合征(Opsoclonus myoclonus syndrome， OMS)、视神经炎、Ord 甲状腺炎(Ord' s thyroiditis)、天;) 、赖
特尔综合征(Reiter' s syndrome)、舍格伦综合征(Sj6gren’S syndrome)、高安动脉炎
(Takayasu arteritis)、颞动脉炎(也称为“巨细胞动脉炎(giant cell arteritis)”)以 及韦格纳肉芽肿病(Wegener' s granulomatosis)。重要地，由于本发明的组合物对这些 疾病的应答阶段具有作用，因此已患有自身免疫病的患者可受益于这些组合物。依赖于肥 大细胞被抗体活化的任何其它自身免疫病也可通过本发明获得的组合物进行预防或治疗。根据本发明制备的组合物还可用于预防、缓解和/或治疗2型糖尿病，这是因为最 近报道来自肠道菌群的LPS引起慢性炎症，其倾向于发生2型糖尿病(Cani等，2007)。在一个优选的实施方案中，本发明所用的干酪乳杆菌菌株是干酪乳杆菌副干酪亚 种(L.casei ssp. paracasei)，例如1994年12月30日以编号1-1518保藏于CNCM(法国国 家培养物禾口微生物保藏中心，Collection Nationale de Culture de Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, Paris)的菌株。在另一实施方案中，本发明所用的短双歧杆菌菌株是1999年5月31日以编号 1-2219保藏于CNCM的菌株。根据本发明的一个特定实施方案，由干酪乳杆菌制备的所述组合物是食物补充剂 和/或功能性食品。在本文中，“食物补充剂”是指由通常用于食品中的化合物制得的产品， 但是其采用片剂、粉末剂、胶囊剂、药水或通常与食物无关的任何其它形式，并且其对人的 健康具有有益的作用。“功能性食品”也是对人的健康具有有益作用的食物。特别地，食物 补充剂和功能性食品可具有生理作用——预防或治疗疾病(例如，慢性疾病)。根据本发明制备的一种特定组合物是发酵乳制品。本发明获得的组合物还可包含至少一种其它细菌菌株，其选自乳杆菌属 (Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)和链球菌属(Str印tococcus)，例如选自嗜热 链球菌(Streptococcus thermophilus)禾口 呆;！]口禾[I亚季Llflii (Lactobacillus bulgaricus) 的至少一种细菌菌株。根据另一实施方案，根据本发明制备的组合物是医药产品。根据本发明，所述细菌(尤其是干酪乳杆菌)可以完整细菌(可以是活的或死的) 的形式使用。例如，可使用完整的经辐射干酪乳杆菌。或者，可使用细菌裂解物形式的细 菌，或者可使用细菌级分形式的细菌；可选择适于此用途的细菌级分，例如，通过测试其抑 制IgE诱导之肥大细胞活化的性质来选择，例如通过下文实验部分中公开的任一测定来进 行。细菌级分是尤其优选的，例如，采用靶向鼻粘膜、鼻窦粘膜和肺粘膜的配方。在一个优选的实施方案中，本发明获得的组合物被配制成使肥大细胞与细菌、细 菌裂解物和/或细菌级分(可能是部分降解的)直接接触。干酪乳杆菌以及较小程度上的短双歧杆菌对肥大细胞活化的抑制作用也可在其 它细菌菌株中观察到。应当筛选细菌菌株(尤其是已知益生菌)文库来鉴定能够抑制肥大 细胞活化的其它菌株。因此，本发明还涉及用于鉴定能用以制备抑制肥大细胞活化(特别是被抗体活化)之组合物的细菌菌株的筛选方法，所述组合物尤其用于预防、缓解或治疗选自变态反 应、自身免疫病和2型糖尿病的疾病。根据本发明方法的第一变型形式(第一方法)，所述方法包括以下步骤(a)将肥大细胞与待筛选之细菌孵育至少一小时；(b)任选地，除去所述细菌；(c)向肥大细胞添加活化剂；以及(d)测量肥大细胞的活化。必要时，在步骤(b)与(C)之间以及步骤(C)与(d)之间进行清洗步骤。在上述方法中，步骤(c)中使用的活化剂可以是例如PMA、钙离子载体(calcium ionophore)(例如离子霉素)、LPS、毒胡萝卜素(thapsigargine)、预先形成的IgG/抗原复 合物，或上述两种或更多种的混合物。根据本发明方法的第二变型形式(第二方法)，所述方法包括以下步骤(a)将肥大细胞与待筛选细菌孵育至少一个小时；(b)任选地，除去所述细菌；(c)将肥大细胞与IgE抗体孵育；(d)向肥大细胞添加特异性抗原；以及(e)测量肥大细胞的活化。此时，如有必要，可以在上述方法的步骤之间进行清洗步骤。可例如通过下文实验部分中所述的任一技术(即通过测量肥大细胞释放的 β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)和/或TNF-α的水平)来测量肥大细胞的活 化。当然，本领域技术人员可使用任何其它的肥大细胞活化标记物，例如Galli等(Nature immunol. 2005)所述的那些。根据所用活化剂的性质和量，还根据在测量步骤(d)或(e)中所用的技术，将肥大 细胞与所述活化剂孵育(所述第一方法的步骤c)或与特异性抗原孵育(所述第二方法的 步骤d)几分钟(例如，5 30分钟)或更长的时间(多达数小时)。例如，测量存在于肥 大细胞颗粒中的化合物(例如β-氨基己糖苷酶)只需要几分钟的孵育，然而如果测量细 胞因子(例如TNF- α )，则步骤c)中的孵育须持续至少一个小时(1 5小时)。还可测量由肥大细胞释放或分泌的任何其它产物和/或与肥大细胞活化有关的 任何细胞变化。以下的附图和实验部分将进一步举例说明本发明，但不限制其范围。
图 Ia 骨髓来源肥大细胞(Bone Marrow derived Mast Cells, BMMC)的表型。在0°C将BMMC与10 μ g/ml 2. 4G2预孵育10分钟以防止抗体的非特异性结合。然 后，在 0°C将其与 10μ g/ml FITC 抗小鼠 Fc ε RIa 或 333ng/ml PE 抗小鼠 CD19 或 133ng/ ml PE 抗小鼠 CDllb 或 100ng/ml PE 抗小鼠 Ly_6G 或 200ng/ml APC 抗小鼠 Fc ε RI α 孵育 30分钟，然后进行清洗。利用流式细胞术评估细胞荧光。图lb :B匪C的TLR蛋白表达。在0°C将BMMC与10 μ g/ml 2. 4G2预孵育10分钟以防止抗体的非特异性结合。然后，在0°c将其与2 μ g/ml经生物素标记的抗小鼠TLR4/MD2单克隆抗体或2 μ g/ml经生物 素标记的抗小鼠TLR2单克隆抗体孵育30分钟，然后进行清洗。随后，在0°C将其与2μ g/ ml经R-藻红蛋白缀合的亲和素、中性链亲和素(neutravidin)孵育30分钟。利用流式细 胞术评估细胞荧光。图Ic =BMMC的TLR转录物表达。使用RNeasy小量试剂盒从BMMC提取RNA，并使用oligodT和AMV逆转录酶进行逆 转录。使用特异性针对 TLRl、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、MD2、MyD88、CD14 和 GAPDH 的引物， 通过PCR来分析所得的cDNA。将扩增片段在2%琼脂糖中进行电泳。图2a 暴露于益生菌之BMMC中的β -氨基己糖苷酶释放。在37°C将MMC暴露于PBSUO-7M ΡΜΑ+1(Γ6Μ离子霉素或经辐射的细菌(以1000个 细菌/细胞的比例)20分钟。使用酶比色法评估氨基己糖苷酶的释放。图2b 暴露于益生菌之B匪C的TNF- α分泌。在37°C将MMC暴露于PBSUO-7M ΡΜΑ+1(Γ6Μ离子霉素或经辐射的细菌(以1000个 细菌/细胞的比例)3小时。使用L929生物测定来评估TNF- α的分泌。图3a 在致敏和用抗原攻击前暴露于益生菌的BMMC的β -氨基己糖苷酶释放。在37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育过 夜。然后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，随后清洗3次。接着，在37°C 使用lOng/ml DNP-BSA攻击细胞20分钟。使用酶比色法评估β-氨基己糖苷酶的释放。图3b 在致敏和用抗原攻击前暴露于益生菌的BMMC的TNF- α分泌。在37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育过 夜。然后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，随后清洗3次。接着，在37°C 使用10ng/ml DNP-BSA攻击细胞3小时。使用L929生物测定来评估TNF-α分泌。图4a 在致敏和用抗原攻击前暴露于活干酪乳杆菌的BMMC的β -氨基己糖苷酶 释放。在37°C将BMMC与PBS或活细菌(以0. 5、5、50个细菌/细胞的比例)预孵育过 夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，随后清洗3次。 接着，在37°C使用所示浓度的DNP-BSA攻击细胞20分钟。使用酶比色法评估β-氨基己糖 苷酶的释放。图4b 在致敏和用抗原攻击前暴露于活干酪乳杆菌的BMMC的TNF- α分泌。在37°C将BMMC与PBS或活细菌(以0. 5、5、50个细菌/细胞的比例)预孵育过 夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，随后清洗3次。 接着，在37°C使用10ng/ml DNP-BSA攻击细胞3小时。使用L929生物测定来评估TNF- α 的分泌。图5 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的腹膜细胞来源肥大细胞 (Peritoneal Cell-derived Mast Cells, PCMC)的 β-氨基己糖苷酶释放。在37°C将PCMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育过 夜。然后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，随后清洗3次。接着，在37°C 使用lOng/ml DNP-BSA攻击细胞20分钟。使用酶比色法评估β-氨基己糖苷酶的释放。图6a 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞(Rat Basophil Leukemia, RBL)的β-氨基己糖苷酶释放。在37°C将RBL细胞与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵 育过夜。然后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，随后清洗3次。接着，在 37°C使用所示浓度的DNP-BSA攻击细胞20分钟。使用酶比色法评估β-氨基己糖苷酶的 释放。图6b 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的RBL的TNF- α分泌。在37°C将RBL细胞与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵 育过夜。然后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，随后清洗3次。接着，在 37°C使用10ng/ml DNP-BSA攻击细胞3小时。使用L929生物测定来评估TNF-α的分泌。图7 在用PMA-离子霉素攻击前暴露于干酪乳杆菌的BMMC的TNF- α分泌。在37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育 过夜，然后清洗3次。随后，在37°C使用10_7M PMA+10_6M离子霉素攻击细胞3小时。使用 L929生物测定来评估TNF- α的分泌。图8a 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌并在不存在细菌下孵育3小时的 BMMC的β -氨基己糖苷酶释放。在37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育过 夜，然后清洗3次。随后，于37°C在细菌不存在下孵育细胞0或3小时，在37°C用1 μ g/ml 抗DNP IgE使细胞致敏1小时，然后清洗3次。接着，在37°C使用所示浓度的DNP-BSA攻击 细胞20分钟。使用酶比色法评估氨基己糖苷酶的释放。图8b 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌并在不存在细菌下孵育不同时 间的BMMC的β -氨基己糖苷酶释放。在37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育过 夜，然后清洗3次。随后，于37°C在不存在细菌下孵育细胞0或24小时，在37°C用1 μ g/ml 抗DNP IgE使细胞致敏1小时，然后清洗3次。接着，在37°C使用所示浓度的DNP-BSA攻击 细胞20分钟。使用酶比色法评估氨基己糖苷酶的释放。图9 暴露于干酪乳杆菌之BMMC的碘化丙啶(PI)/膜联蛋白V(AnneXin V)标记。在37°C将B匪C与PBS、250ng/ml星形孢菌素(staurosporine)或经辐射的细菌 (以1000个细菌/细胞的比例)预孵育过夜，然后清洗3次。接着，在0°C使用0.5 μ g/ml PI和0. 5 μ 1膜联蛋白V-APC (BD Biosciences)孵育细胞30分钟。利用流式细胞术评估细 胞荧光。图IOa 暴露于干酪乳杆菌之B匪C的Fc ε RI表达。在37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育过 夜，然后清洗3次。随后，在0°C用10 μ g/ml 2. 4G2孵育细胞10分钟以防止抗体的非特异 性结合，在0°C用10 μ g/ml FITC抗小鼠Fc ε RI α抗体孵育细胞30分钟，接着清洗细胞。 利用流式细胞术评估细胞荧光。图IOb 暴露于干酪乳杆菌之BMMC的IgE结合。在37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育 过夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，然后清洗3 次；接着，在0°C使用30 μ g/ml经FITC标记的山羊抗小鼠Fab' 2孵育细胞30分钟，然后
9进行清洗。利用流式细胞术评估细胞荧光。图Ila:在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌不同时间的BMMC的β-氨基己 糖苷酶的释放。将BMMC在37°C与PBS预孵育4小时或者与经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞 的比例)预孵育1、2、3、4小时，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞 致敏1小时，随后清洗3次。接着，在37°C使用所示浓度的DNP-BSA攻击细胞20分钟。使 用酶比色法评估氨基己糖苷酶的释放。图lib 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌不同时间的BMMC的TNF- α分 泌。将BMMC在37°C与PBS预孵育4小时或者与经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞 的比例)预孵育1、2、3、4小时，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞 致敏1小时，随后清洗3次。接着，在37°C使用lOng/ml DNP-BSA攻击细胞3小时。使用 L929生物测定来评估TNF- α的分泌。图12 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌但用膜分隔开的BMMC的TNF- α 分泌。在transwell存在或不存在下，于37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000 个细菌/细胞的比例)预孵育过夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使 细胞致敏1小时，随后清洗3次。接着，在37°C使用lOng/ml DNP-BSA攻击细胞3小时。使 用L929生物测定评估TNF- α的分泌。图13a 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的TLR-2/TLR-4缺陷型BMMC的 β-氨基己糖苷酶释放。在37°C将来自野生型和TLR-2/TLR-4缺陷型小鼠的BMMC与PBS或经辐射的细菌 (以1000个细菌/细胞的比例)预孵育过夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗 DNP IgE使细胞致敏1小时，然后清洗3次。接着，在37°C使用所示浓度的DNP-BSA攻击细 胞20分钟。使用酶比色法评估氨基己糖苷酶的释放。图13b 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的TLR-2/TLR-4缺陷型BMMC的 TNF-α分泌。在37°C将来自野生型和TLR-2/TLR-4缺陷型小鼠的BMMC与PBS或经辐射的细菌 (以1000个细菌/细胞的比例)预孵育过夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗 DNP IgE使细胞致敏1小时，然后清洗3次。接着，在37°C使用lOng/ml DNP-BSA攻击细胞 3小时。使用L929生物测定评估TNF-α的分泌。图14a 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的MyD88缺陷型BMMC的β -氨 基己糖苷酶释放。在37°C将来自野生型和MyD88缺陷型小鼠的BMMC与PBS或经辐射的细菌(以 1000个细菌/细胞的比例)预孵育过夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，然后清洗3次。接着，在37°C使用所示浓度的DNP-BSA攻击细胞20 分钟。使用酶比色法评估氨基己糖苷酶的释放。图14b 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的MyD88缺陷型BMMC的TNF- α 分泌。
在37°C将来自野生型和MyD88缺陷型小鼠的BMMC与PBS或经辐射的细菌(以 1000个细菌/细胞的比例)预孵育过夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，然后清洗3次。接着，在37°C使用lOng/ml DNP-BSA攻击细胞3小 时。使用L929生物测定评估TNF-α的分泌。图15a 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的N0D2缺陷型BMMC的β -氨 基己糖苷酶释放。在37°C将来自野生型和N0D2缺陷型小鼠的MMC与PBS或经辐射的细菌(以1000 个细菌/细胞的比例)预孵育过夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使 细胞致敏1小时，然后清洗3次。接着，在37°C使用所示浓度的DNP-BSA攻击细胞20分钟。 使用酶比色法评估氨基己糖苷酶的释放。图15b 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的NOD2缺陷型BMMC的TNF- α 分泌。在37°C将来自野生型和N0D2缺陷型小鼠的MMC与PBS或经辐射的细菌(以1000 个细菌/细胞的比例)预孵育过夜，然后清洗3次。然后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使 细胞致敏1小时，然后清洗3次。接着，在37°C使用lOng/ml DNP-BSA攻击细胞3小时。使 用L929生物测定评估TNF- α的分泌。图16 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的Fc γ RIIB缺陷型BMMC的 β-氨基己糖苷酶释放。在37°C将来自野生型和Fc y RIIB缺陷型小鼠的BMMC与PBS或经辐射的细菌(以 1000个细菌/细胞的比例)预孵育4小时，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，然后清洗3次。接着，在37°C使用所示浓度的DNP-BSA攻击细胞20 分钟。使用酶比色法评估氨基己糖苷酶的释放。图17a 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的BMMC的细胞内信号传导蛋白 的表达和磷酸化。在37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育 过夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，然后清洗3 次。接着，用10ng/ml DNP-BSA攻击细胞0、3、10或30分钟，并裂解细胞。通过SDS-PAGE 以及随后的使用抗PLAT抗体、抗LAT抗体、抗pPLC γ 1抗体、抗PLC γ 1抗体、抗pERK抗体、 抗ERK抗体、抗pAkt抗体和抗Akt抗体的Western印迹来分析细胞裂解物。图17b 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的BMMC的转录因子活化。在37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育过 夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，然后清洗3次。 接着，用10ng/ml DNP-BSA攻击细胞0、3、10或30分钟，并裂解细胞。通过SDS-PAGE以及 随后的使用抗PNF κ B抗体、抗NF κ B抗体、抗ρ κ Ba抗体、抗I κ Ba抗体的Western印 迹来分析细胞裂解物。图18 在致敏和用抗原攻击前暴露于干酪乳杆菌的BMMC的钙流入。在37°C将BMMC与PBS或经辐射的细菌(以1000个细菌/细胞的比例)预孵育 过夜，然后清洗3次。随后，在37°C用lyg/ml抗DNP IgE使细胞致敏1小时，随后清洗3 次。接着，在室温使用5 μ M钙指示染料Fluo3AM标记30分钟，清洗3次，然后在37°C使用
1110ng/ml DNP-BSA攻击细胞。利用流式细胞术评估细胞刺激后的细胞荧光变化。图19 干酪乳杆菌抑制人嗜碱性粒细胞活化。将来自正常供者的剔除红细胞的血细胞与PBS或数量递增的经辐射干酪乳杆菌
(A)或者与PBS或1000个经辐射干酪乳杆菌/细胞(B)孵育过夜，然后与抗人IgE抗体 的F(ab' )2片段孵育。对鉴定为FceRI+⑶203+细胞的嗜碱性粒细胞设“门”，并监测刺 激前后所设门细胞中⑶203的表达。示出了来自PBS或干酪乳杆菌处理组之数据的ρ值 (Student' s t 检验)。图20 活干酪乳杆菌抑制由IgE和IgG诱导的腹膜细胞来源肥大细胞(PCMC)活 化。将PCMC与PBS或活干酪乳杆菌(以100个细菌/细胞的比例)孵育过夜。然后， 用IgE使肥大细胞致敏，用抗原攻击细胞(A)或者用预先形成的IgG免疫复合物攻击细胞
(B)0刺激20分钟后，测量上清液中的β-氨基己糖苷酶。图21 活干酪乳杆菌不诱导骨髓来源肥大细胞(BMMC)活化。用IgE和抗原(Α、
C)或用活干酪乳杆菌(B、D)刺激BMMC的β-氨基己糖苷酶释放(Α、Β)和TNF-α产生(C、
D)。用IgE使BMMC致敏并用抗原进行攻击，或者将BMMC与不同细菌/细胞比例的细菌孵 育。分别在刺激20分钟和3小时后测量上清液中的β-氨基己糖苷酶和TNF-α。图22 活嗜热链球菌(S. thermophilus)不抑制IgE诱导的B匪C活化。将B匪C 与PBS、活嗜热链球菌或活干酪乳杆菌(以100个细菌/细胞的比例)孵育过夜。然后，用 IgE使肥大细胞致敏并用抗原进行攻击。分别在刺激20分钟和3小时后测量上清液中的 β -氨基己糖苷酶㈧和TNF- α⑶。图23 活干酪乳杆菌来源的代谢物不抑制IgE的诱导BMMC活化。将PBS或活干酪乳杆菌与培养基孵育过夜，并离心。将经0.2 μ m膜过滤的上清液、 细菌沉淀物或活细菌与BMMC孵育过夜。然后，用IgE使肥大细胞致敏并用抗原进行攻击。 分别在刺激20分钟和3小时后测量上清液中的β -氨基己糖苷酶(A)和TNF- α (B)。图24 活干酪乳杆菌对IgE诱导之BMMC活化的抑制需要细胞与细菌的直接接触。 在普通培养孔(Α、C)或双室transwell (孔径0. 4μ m) (B、D)中，将BMMC与PBS或活干酪 乳杆菌孵育过夜。然后，用IgE使肥大细胞致敏并用抗原进行攻击。分别在刺激20分钟和 3小时后测量上清液中的β-氨基己糖苷酶(C、D)和TNF-α (A、B)。图25 活干酪乳杆菌抑制BMMC中由IgE诱导的钙应答。将BMMC与PBS或活干酪 乳杆菌(以100个细菌/细胞的比例)孵育过夜，并用IgE使细胞致敏。然后，用Fluo-3 对肥大细胞进行加载(A)或不加载(B)，并用抗原进行攻击。利用流式细胞术监测细胞内相 对Ca2+浓度作为时间的函数(A)。刺激20分钟后测量上清液中的氨基己糖苷酶(B)。图26 活干酪乳杆菌抑制BMMC中由IgE诱导的细胞内信号传导。将BMMC与PBS 或活干酪乳杆菌(以100个细菌/细胞的比例)孵育过夜。然后，用IgE使肥大细胞致敏， 并用抗原攻击细胞所示的时间。将细胞裂解物进行电泳，然后用所示抗体进行Western印 迹。图27 活干酪乳杆菌抑制PMA和离子霉素诱导的B匪C活化。将B匪C与PBS或活 干酪乳杆菌(以100个细菌/细胞的比例)孵育过夜，并用PMA+离子霉素刺激。分别在刺 激20分钟和3小时后测量上清液中的β -氨基己糖苷酶(A)和TNF- α (B)。
12实施例使用如下材料和方法进行下文所述的实验细胞培养收集股骨骨髓细胞，并培养在添加了 10% FCS,0. 2% 2_巯基乙醇、100IU/ml青霉 素、100μ g/ml链霉素(完全Opti-ΜΕΜ)和分泌鼠IL-3的X63转染体的4%上清液(Dr. P.Dubreui1, Institut de Cancerologie et d ‘ Immunologie, Marseille, France)的 Opti-MEM+GlutaMAX-I中。通过用新鲜培养基重悬沉淀细胞(以3X105/ml的浓度)对培 养物每3天传代一次。从经腹膜内注射了 2ml RPMI 1640的小鼠收集腹膜细胞。将细胞以1 X 106/ml接种 在添加了分泌鼠SCF之CHO转染体的4%上清液(Dr. P. Dubreui 1)的完全Opti-MEM中。24 小时后，将非贴壁细胞除去，并向贴壁细胞添加新鲜培养基。3天后，收集用胰蛋白酶-SDTA 回收的非贴壁细胞和贴壁细胞，进行沉淀，并以3X105/ml的浓度用新鲜培养基重悬细胞。 同样的步骤每周重复两次。将3 9周的培养物用于实验。培养试剂均来自Invitrogen Life Technologies。在添加了10% 05、100叨/1111青霉素和10(^8/1111链霉素的1^]\01640+611^3獻父-1 中培养大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞。在添加了10% FCSUOOIU/ml 青霉素和 100 μ g/ml 链霉素的 DMEM+GlutaMAX-I 中 培养Raw 264. 7细胞。细胞预孵育在添加了 10 % FCS和分泌鼠IL-3之X63转染体的4 %上清液的 Opti-MEM+GlutaMAX-I中将细胞与细菌、PBS或星形孢菌素进行预孵育。细胞致敏在添加了10% FCS 和 4% HEPES 的 RPMI 1640+GlutaMAX-I 中使用抗 DNP IgE 使 细胞致敏。刺激细胞在添加了10% FCS 和 4% HEPES 的 RPMI 1640+GlutaMAX-I 中用细菌、PMA/ 离子 霉素或DNP-BSA刺激细胞。标记细胞在添加了 0. 2% FCS的PBS中将细胞与2. 4G2以及经生物素、PE、FITC、APC标记
的抗体孵育。在结合缓冲液(BD Biosciences)中将细胞与PI/膜联蛋白V-APC孵育。在添加了0. 2% pluronic 的 RPMI 1640+GlutaMAX-I 中将细胞与 Fluo3AM 孵育。实施例1 经辐射干酪乳杆菌对IgE诱导之BMMC活化的抑制所使用的模式细胞是鼠骨髓来源肥大细胞(BMMC)，其上检出了 Fc eRI、 Fc y RIIIA和Fc y RIIB的表达。它们还表达干细胞因子受体kit (⑶117)，但不表达巨噬 细胞标志物(Macl)、B细胞标志物(CD19)或粒细胞标志物(GRl)(图la)。通过使用可用 抗体进行间接免疫荧光来评估，检测不出BMMC表达膜蛋白TLR-2和TLR_4(图lb)，但是通 过RT-PCR分析评估，BMMC中包含编码TLR_1、2、4、5、6、MD-2、MyD88和CD14的转录物(图
13Ic)。当用IgE抗体致敏并用特异性抗原进行攻击时，BMMC释放β -氨基己糖苷酶并分泌 TNF- α。测试了 5种细菌菌株对肥大细胞活化的作用-干酪乳杆菌副干酪亚种，其于1994年12月30日以编号1-1518保藏于 CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes，25rue du Docteur Roux, Paris)，其在本文所述的实施例中称为“干酪乳杆菌”；-副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)DN-114120 ；-于1999年5月31日以编号1-2219保藏于CNCM的短双歧杆菌；-植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DSM 9843 ；-于2002年1月24日以编号1-2273保藏于CNCM的嗜热链球菌。首先测试这些细菌活化肥大细胞的能力。为此目的，对细菌进行辐射处理，用PBS 重悬并与BBMC(以1000个细菌/细胞的比例)孵育。当分别孵育20分钟或3小时后，所 测试的6种细菌菌株均不诱导BMMC释放β -氨基己糖苷酶或分泌TNF- α (图2a和2b)。然后，本发明人研究了预先将BMMC暴露于细菌是否会影响随后的IgE诱导之肥大 细胞生物应答。他们发现，当与BMMC孵育过夜(以1000个经辐射细菌/细胞的比例)时， 几种菌株既抑制β-氨基己糖苷酶的释放也抑制TNF-α的分泌。而其它菌株则不然。一 个菌株一干酪乳杆菌一比其它细菌明显更加有效(图3a和3b)。在同样的条件下，活干 酪乳杆菌能抑制肥大细胞活化，并且在较低的细菌/细胞比例下也诱导出相当的抑制效果 (图4a和4b)。出于实用的考虑，随后的实验中使用经辐射的细菌。所得结果如下文所述。A.干酪乳杆菌所诱导之抑制的一般特征1、干酪乳杆菌对BMMC中的IgE诱导应答以及对实验室开发的原代浆膜型成熟肥 大细胞新模型中的IgE诱导应答具有同样地影响(Malbec等，2007)(图5)，但是对肿瘤肥 大细胞系RBL-2H3无影响(图6a和6b)；2、干酪乳杆菌不仅抑制由IgE诱导的BMMC应答，还抑制由PMA+离子霉素诱导的 BMMC应答(图7)，这表明干酪乳杆菌抑制绕过膜抗体受体和细胞内信号传导早期步骤的非 特异性活化；3、抑制是暂时性的(图8a和8b)；4、干酪乳杆菌不降低肥大细胞的生存力(图9)；5、干酪乳杆菌略微下调B匪C中Fc ε RI的表达，IgE抗体对B匪C的致敏作用未受影响。B、发生抑制的实验条件1、通过预先与干酪乳杆菌进行孵育而抑制肥大细胞应答是时间依赖性的(图Ila 和 lib)；2、抑制不能归因于干酪乳杆菌上清液中存在的可溶性产物，并且其也不是由乳酸 引起的；3、支持这一发现的是，如果在孵育期间将干酪乳杆菌和BMMC用0.4μπι的 transwell膜分隔开即可阻止抑制，这表明它需要细胞与细菌之间的直接接触(图12)。C、干酪乳杆菌抑制肥大细胞活化涉及的机制1、干酪乳杆菌对源自a) TLR-2/TLR-4缺陷型小鼠(图13a和13b)、b)MyD88缺陷型小鼠(图14a和14b)、c)N0D2缺陷型小鼠(图15a和15b)禾Π d)Fc γ RIIB缺陷型小鼠 (图16)之BMMC中IgE诱导应答的抑制与对来自野生型小鼠之BMMC中应答的抑制同样有 效；2、通过Western印迹评估，干酪乳杆菌降低了几种信号分子的表达(图17)；3、干酪乳杆菌抑制了早期和晚期Fc ε RI依赖性磷酸化事件(图17)；4、干酪乳杆菌增强了 NF-K B的磷酸化，但降低了 I κ B降解(其是NF-κ B核转移 所需的)(图17)；以及5、干酪乳杆菌强烈抑制IgE诱导的及离子霉素诱导的细胞内Ca2+浓度增加(图 18)。这些结果表明，将肥大细胞暴露于干酪乳杆菌数小时不仅影响了导致转录因子活 化和Ca2+应答的Fc ε RI信号传导，还影响了绕过Fc ε RI的活化信号(PMA+离子霉素)。结 果，IgE诱导的肥大细胞分泌应答(包括脱颗粒和细胞因子分泌)被显著抑制。实施例2 干酪乳杆菌抑制由IgE诱导的体内应答干酪乳杆菌的体内作用主要通过强饲将干酪乳杆菌暴露于小鼠来进行研究的。首 先研究干酪乳杆菌抑制被动局部或全身性过敏反应的能力。然后，利用来自经干酪乳杆菌 强饲之小鼠的经IgE致敏的回肠区段，研究干酪乳杆菌抑制抗原诱导的肥大细胞介质释放 的能力。最后，在鼠变态反应(变应性哮喘和食物性变态反应)模型中以及在实验室开发 的自身免疫性炎性疾病(类风湿关节炎和脑脊髓炎)模型中，研究了干酪乳杆菌强饲的效^ ο实施例3 经辐射干酪乳杆菌对人肥大细胞和嗜碱性粒细胞的体外作用在与处理小鼠肥大细胞相似的条件下，将来自正常人供体的剔除红细胞的血细胞 暴露于干酪乳杆菌，并检测它们对借助IgE之刺激的应答。结果示于图19中，其表明干酪乳杆菌抑制人嗜碱性粒细胞的活化。实施例4 干酪乳杆菌对人中变态反应和自身免疫病的作用临床试验中包括服用Actimel 或安慰剂的正常组和变态反应患者组。还包括 患有自身免疫病(类风湿关节炎、多发性硬化症或大疱性类天疱疮)之患者的单独组，以及 患有2型糖尿病之患者的组。实施例5 新的目的益生菌的筛选为了从大的益生菌文库中进行筛选，建立了在多孔板中的自动体外测定。如果该 筛选发现新的潜在目的益生菌，则使用与干酪乳杆菌同样的实验方法对这些益生菌进行检 测。实施例6 活干酪乳杆菌对肥大细胞活化的作用使用与上述实施例1中所述的相同实验方法对活干酪乳杆菌或经辐射的细菌进 行操作。结果示于图20至27中，其显示使用活干酪乳杆菌也观察到使用经辐射干酪乳杆 菌时对肥大细胞的同样作用。参考文献Arock, M. , Ross, Ε. , Lai-Kuen, R. , Averlant, G. , Gao, Ζ. , and Abraham, S. 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权利要求
干酪乳杆菌(L.casei)菌株和/或短双歧杆菌(B.Breve)菌株用于制备用以抑制肥大细胞活化之组合物的用途。
2.权利要求1的用途，其用于制备用以预防IgE诱导之肥大细胞活化的组合物。
3.权利要求2的用途，其用于制备用以预防、缓解或治疗变态反应或变应性表现的组 合物。
4.权利要求1的用途，其用于制备用以预防IgG诱导之肥大细胞活化的组合物。
5.权利要求4的用途，其用于制备用以预防、缓解或治疗自身免疫病的组合物。
6.权利要求1的用途，其用于制备用以预防、缓解或治疗2型糖尿病的组合物。
7.权利要求1至6中任一项的用途，其中所述干酪乳杆菌菌株是干酪乳杆菌副干酪亚 ft (L. casei ssp. Paracasei)
8.权利要求1至7中任一项的用途，其中所述干酪乳杆菌菌株是1994年12月30日以 编号1-1518保藏于CNCM的菌株。
9.权利要求1至8中任一项的用途，其中所述短双歧杆菌菌株是1999年5月31日以 编号1-2219保藏于CNCM的菌株。
10.权利要求1至9中任一项的用途，其中所述组合物是食物补充剂和/或功能性食品。
11.权利要求1至10中任一项的用途，其中所述组合物是发酵乳制品。
12.权利要求1至11中任一项的用途，其中所述组合物还包含至少一种选自乳杆菌属 (Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)禾口链球菌属(Streptococcus)的另夕卜菌株。
13.权利要求12的用途，其中所述组合物包含至少一种选自嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)禾口保力口利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)的细菌 菌株。
14.权利要求1至9、12和13中任一项的用途，其中所述组合物是医药产品。
15.根据权利要求1至14中任一项的用途，其中所述细菌以存活形式被应用。
16.根据权利要求1至15中任一项的用途，其中所述细菌以完整死细胞的形式被应用。
17.根据权利要求1至15中任一项的用途，其中所述组合物包含所述细菌的细菌裂解 物或细菌级分。
18.根据权利要求1至17中任一项的用途，其中所述组合物被配制成使得摄入该组合 物导致肥大细胞与所述组合物中包含的细菌、细菌裂解物和/或细菌级分直接接触。
19.用于鉴定细菌菌株的筛选方法，所述细菌菌株能用于制备用以抑制肥大细胞被抗 体活化的组合物，其中所述方法包括以下步骤(a)将肥大细胞与待筛选的细菌孵育至少一个小时；(b)任选地，除去所述细菌；(c)向肥大细胞添加活化剂；以及(d)测量肥大细胞的活化。
20.权利要求19的筛选方法，其中用于步骤(c)中的活化剂选自预先形成的IgG/抗原 复合物、钙离子载体、LPS、PMA、离子霉素、毒胡萝卜素以及上述两种或更多种的混合物。
21.用于鉴定细菌菌株的筛选方法，所述细菌菌株能用于制备用以抑制肥大细胞被抗 体活化的组合物，其中所述方法包括以下步骤(a)将肥大细胞与待筛选的细菌孵育至少一个小时；(b)任选地，除去所述细菌；(c)将肥大细胞与IgE抗体孵育；(d)向肥大细胞添加特异性抗原；以及(e)测量肥大细胞的活化。
22.根据权利要求19至21中任一项的筛选方法，其中步骤(d)或(e)通过测量由所述 肥大细胞释放的β “氨基己糖苷酶和/或TNF-a的水平、和/或由肥大细胞释放或分泌的 任何产物、和/或与肥大细胞的活化有关的任何细胞变化来进行。
全文摘要
本发明涉及预防和治疗肥大细胞参与的慢性或急性疾病(例如变态反应和某些自身免疫病)的领域。更确切地，本发明涉及包含干酪乳杆菌(L.casei)菌株和/或短双歧杆菌(B.breve)菌株的益生菌用于抑制肥大细胞活化的用途。本发明还涉及用于鉴定能用以制备所述益生菌之细菌菌株的筛选方法。
文档编号G01N33/573GK101909643SQ200880124467
公开日2010年12月8日 申请日期2008年12月1日 优先权日2007年11月30日
发明者塞西尔·希弗-曼尼维, 拉斐尔莱·布尔代-西卡尔, 桑德里纳·萨姆森, 马克·达埃龙 申请人:巴斯德研究所;达能日尔维公司