专利名称：含有lp乳酸菌的产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种应用于口腔的产品，尤其涉及一种含有LP乳酸菌 (Lactobacillus paracasei)以抑制细菌造成的牙齿疾病的产品。
背景技术：
龋齿是属于多因子所造成的疾病(multi-factorial disease)，发生原因除了 要考虑到牙齿组成元素、形态、位置、唾液组成成份、酸碱值、分泌量、粘度、 抗菌因子、饮食中碳水化合物含量、氟化物、维生物以及其物理性质，因此， 降低口腔内细菌的数量，可以减少龋齿及细菌造成的牙周病的发生率。 一般而 言，会影响到牙齿保健的细菌，都以牙菌斑(dental plaque)形式存在，其附 着于口腔内牙齿表面上的膜状物，而其外表的变化从透明的外观渐渐形成白色 的堆积物。牙菌斑内的细菌包括有各种球菌、杆菌及纤毛菌，其中最容易引发 龋齿或导致牙周发炎的主要牙菌斑细菌有Srteptococcus mwtants, Srteptococcus sanguis, actinomyces viscosus, Streptococcus sobrinus 及 Porphyromonas gingivalis。
目前多项研究结果显示特殊益生菌会改善龋齿发生率，也会降低口腔中龋 齿致病菌突变形链球菌(Streptococcus mutants)的数量，进而减少牙菌斑的形 成，就能减少牙周病致病菌滋生的温床，避免细菌产生的毒素对造成牙龈发炎 及牙龈下齿槽骨骨质的流失，减低牙周病发生率。例如日本有研究发现唾液乳 酸杆菌(Lactobacillus salivarius, LS1)可有效预防龋齿的产生。另外，荷兰 赫尔辛基大学对1 6岁儿童进行长期服用牛奶添加乳酸菌以预防龋齿，更进 一步针对青少年进行研究短期服用起司添加特殊益生菌(Probiotic)预防龋齿， 发现三周后可减少唾液中突变形链球菌的数量约20%。而在墨西哥也有研究乳 酸菌经过热杀菌处理后每周服用一次嚼锭连续服用16周，可改善龋齿并降低 蛀牙发生率约42%。
除此之外，美国专利第6,036,952号专利案中揭示数种可抑制牙菌斑形成的乳酸菌种，包括五"&tococcw s; p. 1357、丄actokzc/〃w ac^op/z//^ V20禾口 丄actococc^ /ac似1370。另外，美国专利第6,872,565号专利案中揭示一种含 有乳酸杆菌种ATTC PTA-4965及PTA-4964的产品，可用来抑制细菌造成的 龋齿。利用ATTC PTA-4965或PTA-4964和口腔粘蛋白或牙菌斑结合的抑制 效果以有效减低Streptococcus mutants的数量。另外，在美国专利第6942849 号专利案中揭示一种以乳酸菌种CNCM I-1984、CNCM I-1985、CNCM 1-1986、 CNCM 1-1987或LMG P-18997来治疗及预防龋齿、牙菌斑及牙周病的方法， 其中乳酸菌种可经基因改良以增加其对牙齿表面薄膜的粘附性。
LP乳酸菌(/^加^"7/^;^"0^/)目前被发现可促进免疫细胞释放大量 干扰素，有效改善过敏疾病。人体免疫细胞T淋巴球，由于所分泌的细胞素不 同而分成二型，第一型和第二型T淋巴球之间具有动态的平衡关系，彼此互有 消长，而且会影响到整个免疫系统对抗原的反应结果。如果第二型T淋巴球的 反应太强势，患者就会出现过敏症状。增加第一型T淋巴球的活性，或抑制第 二型T淋巴球的活性，可以防治过敏。LP乳酸菌被应用在人体肠道中，因为 其细胞壁和细胞内容物的成份不同，可以相当程度地促进第一型T淋巴球的活 性，进而抑制第二型T淋巴球的作用，因而可以成为防治过敏的利器。
综合上述所言，目前已发现多种乳酸菌具有抑制龋齿、牙菌斑及牙周病发 生的功能，而LP乳酸菌过去被应用在人体肠道中，通过肠道吸收后以改善人 体过敏症状，然而其应用在口腔中以防止牙病产生的功效并未被发现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种含有LP乳酸菌的产品，以抑制 细菌造成的牙齿疾病，例如龋齿、牙菌斑及牙周病。
本发明所揭露的含有LP乳酸菌的产品，以抑制细菌造成的牙齿疾病，此 产品包含有多个LP乳酸菌aacto6ac/〃ws/ araca^') ， LP乳酸菌可抑制牙病 细菌生长。
利用含有LP乳酸菌的食品、口腔清洁用品或口腔治疗药品等让使用者服 用或使用，令使用者口腔内的龋齿致病菌和牙周病致病菌受到LP乳酸菌的抑 制而数量减少，达到预防龋齿和牙周病等牙病的功效。
图1为LP乳酸菌的DNA指纹图2A与图2B为LP乳酸菌抑制龋齿致病菌的抑菌环实验结果；
图3A为空白组的动物实验结果；
图3B为接种致病菌& ^n'm 后的动物实验结果；
图3C为接种致病菌S. wZ)Wm^后，以氟化钠抑制致病菌的动物实验结果； 图3D为接种致病菌S. w6n'm^后，以低菌数LP乳酸菌抑制致病菌的动 物实验结果；
图3E为接种致病菌X ^^n'"^后，以高菌数LP乳酸菌抑制致病菌的动 物实验结果；
图4A为LP乳酸活菌对牙周病致病菌生长的抑制效果；及 图4B为已灭活的LP乳酸菌对牙周病致病菌生长的抑制效果。 其中，附图标记 M:分子量标示分子 S: DNA指纹图
生物材料保藏本发明的LP乳酸菌aacto6ac/〃w p"raawe/)的菌种已 经在位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏日期为2006 年11月27日，保藏号为CCTCCM 206133。
具体实施例方式
为使对本发明的目的、构造、特征、及其功能有进一步的了解，兹配合实 施例详细说明如下。以上的关于本发明内容的说明及以下的实施方式的说明用 以示范与解释本发明的原理，并且提供本发明的权利要求更进一步的解释。
一、筛选及鉴定LP乳酸菌-
先由人类肠道中存在的乳酸菌种筛选出可减缓牙病症状的机能性乳酸菌。 其为针对菌种库中乳酸菌种进行造成龋齿形成的主要致病菌变形链球菌 (5Vreptococcws )禾口表兄链球菌(iSVre/ tococcw so6Wwws)的抑菌环i式
验筛选出预防龋齿的特殊乳酸菌种。将此乳酸菌种在培养皿中于无氧条件下培 养16到24小时，培养温度为37。C。经实验分析发现此乳酸菌种为革兰氏阳 性菌(Gram-/ as7'"ve 6ac^r/a)、无芽胞厌氧菌(s/ oW"g朋aero^)及无运动性菌(non-mobility)，符合LP乳酸菌的特性。
为确认筛选出的乳酸菌种为LP乳酸菌，先对乳酸菌种进行RAPD-PCR分 析(random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction)。如图1所 示，利用RAPD-PCR技术以随意引子(arbitraryprimer)产生乳酸菌种的DNA指 纹图(DNA fingerprint) S,此DNA指纹图S经比对后发现确实符合LP乳酸 菌，并与其它乳酸菌种不同。图中M为分子量标示分子。
接着将乳酸菌种以PAF和536R引子进行核苷酸定序，将定序后的结果与 基因数据库进行比对，(网址为www.ncbi.nlm.nih.gov)，确认此乳酸菌种确 实为LP乳酸菌。其中部份核苷酸定序结果如下
AGCAGCGNGGGTTAATTAAAA
基因数据库比对结果如下
gi|55418407|gb|AY773955.11 丄actoZwc/〃wsporacase/ /so/afe 9C… gi|55418405|gb|AY773953.11 丄actofe腦7/ws/ oracase/ ^otoe 3C…
gi|55418404|gblAY773952.11丄flcto6ac,7/w; p簡c騰/ /so/她.......
最后利用API 50 CHL试剂检验此乳酸菌种的碳水化合物代谢性能。API
50 CHL试剂可用来鉴定菌株在属或种上的差异。经由分析结果确认此乳酸菌
种与LP乳酸菌的碳水化合物代谢活性相同(数据未示)。
经由上述分析结果鉴定出所筛选的可预防牙病的特殊乳酸菌种为LP乳酸菌。
二、 LP乳酸菌对龋齿致病菌的抑制效果
1. 细菌试验
依据美国临床微生物检验标准委员会(NCCLS)的方法修改后进行抗龋 齿致病菌的抑菌环实验，取一白金耳的龋齿致病菌量接种于所需培养基中，经
过37"C培养18小时使菌株达到生长对数期，并使用分光光度计(Smart Spefw 3000 Spectrophtometer)进行菌数测定，调整龋齿致病菌菌数为1.5X108 CFU/mL。将6V，/ococcw騰tora禾口 S^ptococ，涵n."船均匀涂抹在所需 的培养基上，培养基厚度为4mm，静置15分钟使涂抹菌液完全吸附于培养基 上，再取直径6mm无菌滤片纸锭沾取LP乳酸菌溶液，轻押无菌滤片纸锭使 其完全贝占附于均匀涂抹5V/^ptococcw《wwtom1禾卩5Vreptococc^ w6"'mw的培养 基上，于37。C培养72小时后判读其抑菌环大小。
同时参阅图2A与图2B为抗龋齿致病菌的抑菌环实验结果。将LP乳酸菌 与龋齿致病菌于37。C环境下共同培养培养72小时后，判读龋齿形成的主要致 病菌Streptococcus mutans (S. mutans)禾口 Streptococcus sobrinus (S. sobrinus) 的抑菌环大小，实验结果发现LP乳酸菌对于这两株致病菌均较LGG乳酸菌 (丄acto6ac/〃w r/z"m"oyw5 GGO所产生的抑菌环为大，即LP乳酸菌对于 5Vreptococcws禾口 /SVreptococcw soZ r/"w有竞争'性对抗的效果较LGG 乳酸菌佳。而LGG乳酸菌为目前广泛使用于降低蛀牙发生率的健康食品中的 乳酸菌种。因此将LP乳酸菌利用于口腔中，可使5Ve/7tococcw mwto""的数
目降低，降低蛀牙发生率，可减少龋齿及细菌造成的牙周病的发生率。
2. 动物试验
从国家实验动物中心订购Sprague-Dawley (SD)怀孕母鼠，在小鼠出生 后第18天时，以棉花棒沾0.2ml隔夜培养的对数生长的龋齿致病菌S. w^n'"附 的培养液后，于母鼠口腔内涂抹接菌。并让母鼠自由饮用10%蔗糖水溶液。 第二天重复接菌步骤。接菌后第三天以无菌棉花棒于母鼠口腔中涂抹蛀牙菌 5". w6Www后，并以含100 ti g/ml链霉素(Streptomycin)的Mitis Salivarius ±咅 养基培养，检视是否接种成功。
SD幼鼠于第20天断奶，并分组。以棉花棒沾0.2ml隔夜培养的对数生长 的龋齿致病菌S. sobrinus的培养液后，于SD幼鼠口腔内涂抹接菌。并让SD 幼鼠自由饮用10%蔗糖水溶液。第二天重复接菌步骤。接菌后第三天以无菌 棉花棒于SD鼠口腔中涂抹龋齿致病菌S. sobrinus后，并以含100y g/ml链霉
素的MitisSalivarius培养基培养，检视是否接种成功。
SD幼鼠自出生23天起至实验结束期间都自由饮用含蔗糖的水溶液。功效 试验幵始时秤体重，期间每周测量体重。5周后牺牲并观察龋齿程度。
同时参阅图3A至图3E为抗龋齿致病菌的动物实验结果。图3A为空白组 实验结果，在整个实验期间未接种龋齿致病菌，也未食用添加LP乳酸菌的蔗 糖水。图3B为接种致病菌S. so6n'm^后的实验结果。图3C为接种致病菌S. M^/m^后，饮用含0.022%氟化钠(NaF)的蔗糖水的实验结果。图3D为接 种致病菌5". ^ 6n'"船后，饮用含5 X 109 CFU/ml的LP乳酸菌的蔗糖水的实验 结果。图3E为接种致病菌S. w^'m^后，饮用含5 X 1011 CFU/ml的LP乳酸 菌的蔗糖水的实验结果。
于图3C的实验条件为接种龋齿致病菌S. w6n'm^成功后，从第23天起让 老鼠开始饮用含0.022% NaF的蔗糖水，水溶液的pH值为7，氟离子浓度为 100ppm。于图3D与图3E的实验条件为接种龋齿致病菌S. sWn'mtf成功后， 从第23天起开始喂食老鼠菌数分别为5X109 CFU/ml与5X1011 CFU/ml的 LP乳酸菌。 一天喂食一次，每只SD鼠左、右颊各喂食0.05ml共喂食0.1ml。
对上述各个实验组进行5周的试验，试验结束将老鼠牙齿进行切片并观察 龋齿形成深度。图3B的结果显示在接种Xw6n'm^培养液后，自由饮用蔗糖 水五周，龋齿深度最严重甚至侵袭到牙髄部位，如图中黑色箭头所示。但在蔗 糖水内添加Na F (如图3C所示)或是添加LP乳酸菌(如图3D与图3E所示) 仅形成较浅的龋齿，如黑色箭头所指，与空白组(如图3A所示)的龋齿形成 深度相近。此试验显示服用含有LP乳酸菌或添加Na F的蔗糖水后，预防龋 齿形成的功效相当。
三、LP乳酸菌对牙周病致病菌的抑制效果
在此实验中选用的牙周病致病菌包括有牙髓卟啉单胞(/^r/7 rawo"w g/"g/vafc)、中间普雷沃菌(/Vevo^//"/"ferwdia)、牙周蜈虫公菌(Ce"^ ecfa 户^7'^fo""/)与一个由牙周病人臼齿所取得的牙周病菌临床样品。将牙周病致 病菌及LP乳酸菌进行共同震荡培养，并于培养0、 1、 2、 4、 6与12小时后 经系列稀释10倍及100倍后分别取出5pl进行涂盘于BBAP培养基上，置于 37"C厌氧培养箱静置培养48 96小时，待菌落生成后以菌落计数器计数，测 定LP乳酸活菌及已灭活的LP乳酸菌(LP乳酸死菌)对牙周病致病菌是否有
抑菌效果。
参阅图4A为LP乳酸活菌对牙周病致病菌生长的抑制效果，由图表中显
示出LP乳酸活菌确实会产生抑制牙周病致病菌生长的现象，对致病菌 Prophyromonas gingivalis 及Centipeda periodontii 衍分另与LP乳酸活菌混合作
用一小时即达成超过80%的抑菌率，且与LP乳酸活菌作用两小时即能将此 二种致病菌完全杀死(抑菌率100%);对/Vevote//"纟"妙me^7的抑制作用， 于LP乳酸活菌混合作用一小时后产生约70%的抑菌率，最高的抑菌率发生 于与LP乳酸活菌混合作用六小时后(抑菌率80 90%);唯一测试的临床样 品为采样的牙龈下牙菌斑检体，因临床样品是混合菌丛，其共生现象会使致病 菌抵抗能力加强，同LP乳酸活菌混合作用一小时产生约50%的抑菌率，两 小时后抑菌率增高至约70%，混合作用时间延长则抑菌率无太大变化，其中， 在图4A中，+:抑菌率50% ， ++:抑菌率60 70%， +++:抑菌率80 卯％， ++++:抑菌率100%，未标示:完全抑菌后不进行检测。
参阅图4B为已灭活的LP乳酸菌对牙周病致病菌生长的抑制效果。基本 上己灭活的LP乳酸菌抑制牙周病致病菌生长的效果低于LP乳酸活菌，混合 作用一小时后，LP乳酸死菌能达成对牙周病致病菌50 70%的抑菌率。对牙 周病致病菌Po/77/7少ro附o"as g/"g/va//s及Ce"n) ecto j9en.0cto""/于 昆合〈乍用四 小时后，LP乳酸死菌能达成接近80%的抑菌率，而尸m^e/k/"欣膨&a于 混合作用四小时后，LP乳酸死菌能达成近60%的抑菌率。临床样品与LP乳 酸死菌混合作用一小时后可产生不大于50%的抑菌率，最高的抑菌率发生于 混合作用十二小时后(抑菌率约为60%)。其中，在图4B中，+:抑菌率50%， ++:抑菌率60 70%， +++:抑菌率80%。
由这部份的实验结果显示，已灭活的LP乳酸菌虽然对于牙周病致病菌的 抑制效果不如LP乳酸活菌，但仍具有抑菌效果。
四、结论
龋齿高发生率在临床上是以致病菌streptococcus mutans 的菌数大于106
CFU/ml来判断。因此由乳酸菌菌种进行龋齿致病菌streptococcus mutans和 streptococcus sobrinus的抑菌环试验筛选出预防龋齿的特殊乳酸菌株，目的是 利用乳酸菌来抑制streptococcus mutans的生长，进而降低龋齿发生率。经由 一连串的抑菌试验已确认LP乳酸菌具有抑制龋齿与牙周病致病菌的功效。
LP乳酸菌最被广为认知的保健机能是免疫增强与过敏防治，而运用本发 明制作含有LP乳酸菌的食品、口腔用品或口腔治疗药品等产品让使用者服用
或使用，不论产品中包含有LP乳酸活菌或LP乳酸死菌，都能够让使用者口 腔内的龋齿致病菌和牙周病致病菌受到LP乳酸菌的抑制，达到治疗或预防龋 齿和牙周病等牙齿疾病的功效。利用适合人类体质的机能性乳酸-LP乳酸菌来 帮助预防龋齿及减缓牙周病的症状，在使用含LP乳酸菌的产品于口腔作用时 可治疗牙齿疾病，不但不会造成人体不适应症，也不会有一般抗蛀牙的氟化物 含毒的危险。
关于含有本发明的LP乳酸菌的食品可为液态食品，例如添加LP乳酸菌 的果汁、牛奶和茶等饮品。也可为固态食品，例如添加LP乳酸菌的糖果、口 服锭、饼干、巧克力和起司。另外，也可为胶状食品，例如添加LP乳酸菌的 优格、果冻、布丁和口香糖等。这类食品适合给儿童食用，帮助儿童预防龋齿 的发生。而含有LP乳酸菌的产品也可为口腔清洁用品，例如添加LP乳酸菌 的牙膏和漱口水，以LP乳酸菌取代一般用来抑制牙病致病菌的氟化物，提供 安全而有效的牙齿保护。除此之外，含有LP乳酸菌的产品也可为口腔治疗药 品，例如添加LP乳酸菌的软膏或口含锭，以软膏涂覆于牙齿表面或长时间使 用口含锭于口腔中，使LP乳酸菌与致病菌作用时间延长，可更有效抑制致病 菌生长。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情 况下，熟悉本领域的普通技术人员当可根据本发明做出各种相应的改变和变 形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
TKXZ1192-06P1. ST25. txt SEQUENCE LISTING <110>景岳生物科技股份有限公司 〈120〉含有LP乳酸菌的产品
〈140〉 2006101459320
〈141〉 2006-11-28
<160> 1
〈170〉 Patentln version 3.4
〈210〉 1
〈211〉 500
<212〉 DNA
〈213> LP乳酸菌(Lactobacillus paracasei) 〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (1)..(500)
〈223> LP乳酸菌部分核苷酸序列
〈400〉 1
aacgagttctcgttgatgatcggtgcttgcaccgagattc犯catgg犯cgagtggcgga60
cgggtgagtaacacgtgggtaacctgccctt33gtgggggatascatttg120
ctaataccgcgaaccgcatggttcttggctg咖gatggcgtaagctatc180
gcttttggatggacccgcggcgtattsgctsgttggtgaggtaatggctcaccaaggcga240
tgat3cgtsgccgaactgag aggttgatcggccacattgggactgagacaCggCCC333C300
tCCt3Cggg3ggcagcagtaggg犯tcttccacaatggacgc貼gtctgaggagcaacgc360
cgcgtgagtgaagaaggctttxgggtcgtaaaactctgttgttgg卿ag犯tggtcggc420
agagtemctgttgtcggcgtg3Cggt3tCCaaccagaaagccacggctaactacgtgcca480
gc3gcgnggg500 。
权利要求
1.一种含有LP乳酸菌的产品，用以抑制细菌造成的牙齿疾病，其特征在于，该产品包含有多个LP乳酸菌，该LP乳酸菌可抑制造成牙齿疾病的细菌的生长。
2. 根据权利要求1所述的含有LP乳酸菌的产 一液态食品。
3. 根据权利要求2所述的含有LP乳酸菌的产 品包括果汁、牛奶以及茶。
4. 根据权利要求1所述的含有LP乳酸菌的产 一固态食品。
5. 根据权利要求4所述的含有LP乳酸菌的产 品包括糖果、口含锭、饼干、巧克力以及起司。
6. 根据权利要求1所述的含有LP乳酸菌的产 一胶状食品。
7. 根据权利要求6所述的含有LP乳酸菌的产 品包括优格、果冻、布丁以及口香糖。
8. 根据权利要求1所述的含有LP乳酸菌的产 一口腔清洁用品。
9. 根据权利要求8所述的含有LP乳酸菌的产 品为一牙膏。
10. 根据权利要求8所述的含有LP乳酸菌的产品，其特征在于，该口腔用 品为一漱口水。
11. 根据权利要求l所述的含有LP乳酸菌的产品，其特征在于，该产品为 一口腔治疗药品。
12. 根据权利要求11所述的含有LP乳酸菌的产品，其特征在于，该口腔 治疗药品为一软膏。
13. 根据权利要求11所述的含有LP乳酸菌的产品，其特征在于，该口腔 治疗药品为一口含锭。
14. 根据权利要求1所述的含有LP乳酸菌的产品，其特征在于，该LP乳 酸菌的菌种保藏号为CCTCCM 206133。，其特征在于，该产品为 ，其特征在于，该液态食 ，其特征在于，该产品为 ，其特征在于，该固态食 ，其特征在于，该产品为 ，其特征在于，该胶状食 ，其特征在于，该产品为 ，其特征在于，该口腔用
全文摘要
本发明公开了一种含有LP乳酸菌的产品，用以抑制细菌造成的牙病，此产品包含有多个LP乳酸菌，LP乳酸菌可抑制牙病细菌生长。利用含有LP乳酸菌的食品、口腔清洁用品或口腔治疗药品等让使用者服用或使用，令使用者口腔内的龋齿致病菌和牙周病致病菌受到LP乳酸菌的抑制而数量减少，达到预防龋齿和牙周病等牙病的功效。
文档编号A61K35/74GK101190239SQ20061014593
公开日2008年6月4日 申请日期2006年11月28日 优先权日2006年11月28日
发明者王樱谕, 许清祥, 谢丰钦, 赖订颖, 陈雅惠 申请人:景岳生物科技股份有限公司