专利名称：一种铁皮石斛多糖提取物、其药物组合物和其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物，具体涉及一种铁皮石斛多糖提取物和其制备方法及其应用。
本发明还涉及一种药物组合物，具体涉及一种含有所述铁皮石斛多糖提取物的药物组合物及其制备方法。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobium candidum wall.ex lindl.)是石斛属植物(兰科)，收载于《中华人民共和国药典》2000版一部，是我国重要的传统中药材，药用价值为历代所推崇，而铁皮石斛为石斛之上品，因其特殊的生存环境和卓著的滋补功效而名列“中华九大仙草”之首。铁皮石斛的主要成分为多糖类和生物碱，研究表明，多糖成分与铁皮石斛的药效，如增强提高机体的免疫能力、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、降血糖等，有着密切的关系。目前市场上铁皮石斛产品均为铁皮石斛的复方制剂，且铁皮石斛提取工艺简单，有些则干脆打粉入药，这些都存在作用成分不明确、质量不可控、生物利用度低、不易被人体所吸收等弊端。在专利200410066941.1，200310113916.X中铁皮石斛有效成分的提取工艺也仅仅是简单的水提醇沉，不符合中药现代化的要求，而且制剂中无铁皮石斛相关的质量控制标准。目前市面上也未见有关于铁皮石斛多糖的药物或药物组合物出现。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种生物利用度高，具有增强机体免疫功能、强身抗衰作用的铁皮石斛多糖提取物。
本发明的另一目的是提供一种上述铁皮石斛多糖提取物的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种含有上述铁皮石斛多糖提取物的药物组合物。
本发明还提供一种上述含有铁皮石斛多糖提取物的药物组合物的制备方法。
本发明进而提供了上述铁皮石斛多糖提取物在制备辅助治疗免疫力低下引起的疾病的药物中的应用。
本发明所述的铁皮石斛多糖提取物，是以铁皮石斛为原料提取的，其分子量为1-30万，多糖含量不低于25％(重量)。并且其多糖分子量优选的为10～30万，其多糖含量优选为25％～50％(重量)。
本发明还提供了一种铁皮石斛多糖提取物的制备方法，其包括以下步骤(1)脱脂将铁皮石斛粉碎成粗粉后，用10-30倍有机溶剂回流1-4次，制得药渣；(2)提取加水煎煮上述药渣1-4次，每次1-4小时，每次加水10-30倍，得到煎煮液；(3)浓缩合并上述煎煮液，浓缩到每ml相当于含生药0.2-2g，得到浓缩液；(4)醇沉向上述浓缩液中加入适量乙醇进行沉淀，使得乙醇含量达50％-80％(体积百分比)，将醇液静置过夜；(5)干燥将上述醇液过滤，所得沉淀加2-3倍有机溶剂洗涤后，抽干，减压干燥，得到多糖含量不低于25％(重量)的铁皮石斛多糖提取物。
其中，所述步骤(1)中的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯或80％-95％的乙醇水混合物所述步骤(2)中的提取温度为50-100℃，优选的温度在80～100℃。
所述步骤(5)中的有机溶剂为石油醚、丙酮、无水乙醇、甲醇、乙醚、氯仿或其混合物，优选无水乙醇。
所述的制备方法还可以进一步纯化，具体纯化步骤如下(1)溶解将上述方法获得的铁皮石斛多糖提取物加20-100倍水，加热搅拌使其充分溶解，所得液体高速离心，取上清液；(2)脱蛋白将上述上清液，用水稀释到0.01-0.05g/ml，加入1/5体积的sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)萃取1-4次，离心除去沉淀，得上清液；(3)超滤将上述上清液用分子量为10K的超滤膜浓缩，得到浓缩液；(4)柱层析将上述浓缩液过DEAE-52(DEAE二乙胺基乙基纤维素)树脂柱，用蒽酮硫酸法在线检测，并依次用洗脱剂洗脱。其中可分别收集第一流出液(即铁皮石斛多糖提取物A)和第二流出液(即铁皮石斛多糖提取物B)；(5)干燥将上述洗脱液减压浓缩后冻干，即得到纯化的铁皮石斛多糖。
其中，所述浓缩纯化步骤(4)中的洗脱液为去离子水和盐溶液，所述盐溶液优选为0.05M-0.5M NaCl溶液。
上述得到的多糖，其含量测定采用蒽酮硫酸法，所得多糖含量为25％-50％(重量)。所述多糖分子量采用液相高效凝胶色谱渗透法测定。
本发明还提供了一种含有铁皮石斛多糖提取物的药物组合物，其包括治疗有效量的以铁皮石斛为原料的铁皮石斛多糖提取物和药物学上可接受的载体，其中所述铁皮石斛多糖提取物的分子量为1-30万，在所述铁皮石斛提取物中多糖含量不低于25％(重量)。
其中所述的铁皮石斛多糖提取物可以通过本发明的上述铁皮石斛多糖提取物的制备方法来制备。
所述的含有铁皮石斛多糖提取物的药物组合物，由所述铁皮石斛多糖提取物作为活性组分，以药用有效量，再加入常规药用载体及其他常规药学上可接受的辅剂，例如稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、和/或缓冲剂等制备成用于辅助治疗因免疫力低下而引起的疾病的药物组合物。其中，所述填充剂如淀粉、甘露醇、糊精、蔗糖、乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油，一定浓度的乙醇；崩解剂如甲基淀粉钠、羟基纤维素、交联羟甲基纤维素、琼脂和碳酸氢钠；表面活性剂如滑石粉，硬脂酸钙、硬脂酸镁，微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在所述药物组合物中加入其他辅料，如香味剂，甜味剂等。
所述的含有铁皮石斛多糖提取物的药物组合物可以为多种剂型，优选剂型为口服固体制剂、口服半固体制剂、口服液体制剂或注射剂。
其中，所述口服固体制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、滴丸剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、固体分散剂、散剂、微颗粒剂、微丸剂、微囊剂、微球剂、或者其他药学上可接受的口服固体制剂；所述口服液体制剂为口服液或者其他药学上可接受的口服液体制剂；所述注射剂为注射液、注射用冻干制剂、注射用无菌分装制剂、氯化钠注射液、葡萄糖注射液或者其他药学上可接受的注射剂。
优选地，所述口服固体制剂为颗粒剂、所述口服液体制剂为口服液，所述注射剂为注射液或注射用冻干粉剂。
本发明的药物组合物可通过口服、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种疗效的患者，用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等，制成液体制剂如水或油悬浮剂其他液体制剂如糖浆、合剂、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、粉针、水或油性悬浮剂等。本发明优选的形式是粉针、注射剂和片剂、胶囊、颗粒剂。
本发明进一步提供了一种含有铁皮石斛多糖提取物的药物组合物的制备方法，其由通过上述方法制备而成的铁皮石斛多糖提取物或其纯化提取物与药物学上可接受的载体，根据本领域的常规方法混合制备而成。
本发明还提供了一种铁皮石斛多糖提取物在制备辅助治疗免疫力低下引起的疾病的药物中的应用。通过本发明上述方法制备而成的铁皮石斛多糖提取物还用于制备多种用于辅助治疗因免疫力低下引起的疾病的药物。
本发明人经过大量的研究探索，研制出一种铁皮石斛多糖提取物及含有其的药物组合物。其制备方法便于操作与工业化生产，并且制备出的铁皮石斛多糖提取物及含有其的药物组合物生物利用度高，能显著增强机体免疫功能，具有强身抗衰的保健作用。
本发明的铁皮石斛多糖提取物及其药物组合物，含有的多糖水溶性显著增强，不易降解，质量可控，且本发明制备方法的整个生产过程操作简单，容易进行规模化生产，成本低。此外，本发明药物组合物用于辅助治疗免疫力低下而引起的疾病疗效可靠，并且几乎无不良反应。
图1为本发明中的铁皮石斛多糖的分离提取工艺流程图。
图2为本发明中的铁皮石斛多糖的浓缩纯化工艺流程图。
图3为本发明中制备的铁皮石斛多糖对CD4/CD8的影响。
图4为本发明中制备的铁皮石斛多糖对小鼠骨髓细胞数的影响。
图5为本发明中制备的铁皮石斛多糖对小鼠胸腺的影响。
图6为本发明中制备的铁皮石斛多糖对小鼠体重的影响。
为证明其效果，本发明者按下述具体实施方式
中实施例2中提供的方法制备得到的铁皮石斛多糖提取物A和B，研究了其对免疫低下小鼠免疫功能的影响，实验结果如下1、实验材料实验动物昆明种小鼠，雄性，18-20g，共100只实验药品环磷酰胺，香菇菌多糖，铁皮石斛多糖A、B
2、实验分组及步骤将实验小鼠随机分为16组，每组6只。普通饲料喂食，5g/只/天，共14天，各组除正常组外，第7、9、11、13天，每只小鼠每天腹腔注射60mg/kg环磷酰胺。正常组小鼠则注射生理盐水为对照。
(1)正常组每天以0.5％羧甲基纤维素钠溶液灌胃，0.1ml/10g，连续灌胃14天。
(2)模型组第7、9、11、13天，每只小鼠每天腹腔注射60mg/ml环磷酰胺，同时每天以0.5％羧甲基纤维素钠溶液灌胃，0.1ml/10g，连续灌胃14天。
(3)铁皮石斛多糖B口服组取铁皮石斛多糖B制成0.5mg/ml口服溶液，以0.1ml/10g灌胃给药。
(4)铁皮石斛多糖B注射组取铁皮石斛多糖B制成0.1mg/ml注射溶液，以0.1ml/10g腹腔给药。
(5)铁皮石斛多糖A口服组取铁皮石斛多糖A制成0.5mg/ml口服溶液，以0.1ml/10g灌胃给药。
(6)香菇多糖组(阳性对照组)取香菇菌多糖片剂(含香菇多糖10mg/片)共一片，碾磨后，溶于20ml含0.5％羧甲基纤维素钠的蒸馏水中，制成0.5mg/ml混悬液，以0.1ml/10g给药。
3、实验结果铁皮石斛多糖提取物对小鼠免疫功能的影响结果见表1。
表1铁皮石斛多糖提取物对小鼠免疫功能的影响
(1)对CD4/CD8的影响结果见图3，显示铁皮石斛多糖B口服给药和注射给药均能明显提高小鼠CD4/CD8的比值。与正常组和模型组比较，铁皮石斛多糖B口服给药和注射给药均能明显提高小鼠CD4/CD8的比值；且比香菇多糖作用明显。提示铁皮石斛多糖B、A有增强小鼠免疫力的作用。
(2)对骨髓细胞抑制作用的影响结果见图4，显示与正常组和模型组比较，铁皮石斛多糖B口服给药和注射给药，铁皮石斛多糖A口服给药均能明显对抗环磷酰胺造成的骨髓细胞抑制作用。且比香菇多糖作用明显。提示铁皮石斛多糖B有增强小鼠免疫力的作用。
(3)对胸腺的影响结果见图5，显示铁皮石斛多糖B注射和铁皮石斛多糖A口服给药均能增加小鼠的胸腺重量。与正常组和模型组比较，铁皮石斛多糖A口服给药能明显加胸腺的重量，与香菇多糖组比其作用亦比较明显；但铁皮石斛多糖B口服给药仅比模型组作用较明显。提示铁皮石斛多糖B、A有增强小鼠免疫力的作用。
(4)体重的影响结果见图6，显示与模型组比较，铁皮石斛多糖B注射给药，铁皮石斛多糖A口服给药能明显增加正常小鼠和免疫低下小鼠的体重；铁皮石斛多糖B口服给药仅比模型组作用明显。提示铁皮石斛多糖B、A有增强小鼠免疫力的作用。
以上实验数据和结果可以表明，本发明药物组合物具有显著增强免疫力的功能，并且基本无毒副作用。
具体实施例方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是要对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容的技术特征所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1铁皮石斛多糖提取物的制备取铁皮石斛500g，经挑拣后，粉碎成粗粉，置容器中，加入10倍量95％乙醇回流提取2次，每次1小时，滤液回收乙醇，药渣加25倍量水于80℃提取4次，每次2小时，滤液合并，过滤，减压浓缩至1000ml，加入95％乙醇3750ml，静置过夜，过滤，滤液回收乙醇，沉淀用3倍量无水乙醇洗涤，滤干，50℃下真空干燥，得铁皮石斛多糖提取物。测得其多糖含量为44.18％(或者441.8mg/g)。
实施例2铁皮石斛多糖提取物的制备取铁皮石斛500g，经挑拣后，粉碎成粗粉，置容器中，加入15倍量85％乙醇回流提取2次，每次1小时，滤液回收乙醇，药渣加25倍量水于100℃提取4次，每次2小时，滤液合并，过滤，减压浓缩至1250ml，加入95％乙醇4700ml，静置过夜，过滤，滤液回收乙醇，沉淀用2倍量无水乙醇和丙酮洗涤，滤干，50℃下真空干燥，得铁皮石斛多糖提取物。测得其多糖含量为42.73％(或者427.3mg/g)。
实施例3纯化的铁皮石斛多糖提取物的制备取实施例1的粗多糖10g加500ml水充分溶解，8000r/min离心15分钟，上清液加入1/5体积的sevage试剂萃取3次，2000r/min离心20分钟除去沉淀，上清液加适量水后用分子量为10K的超滤膜反复超滤，浓缩到200ml，将浓缩液过DEAE-52柱层析，上样体积为柱体积的1/10，分别用去离子水和0.1M NaCl溶液冲洗两倍柱体积，蒽酮硫酸法在线检测，收集得到的第一洗脱液和第二洗脱液分别透析浓缩冻干得两种多糖含量不同的铁皮石斛多糖提取物，测得其多糖含量分别为46.61％(或者466.1mg/g)和32.65％(或者326.5mg/g)，下面分别称为铁皮石斛多糖提取物A和铁皮石斛多糖提取物B。
实施例4含铁皮石斛多糖提取物的颗粒剂的制备实施例1铁皮石斛多糖提取物50g淀粉 125g糖粉 60g羟甲淀粉钠 10g硬脂酸镁 2.5g滑石粉 2.5g乙醇90％ 适量将上述除90％乙醇和硬脂酸镁外的辅料过60～80目筛后，混匀，再与实施例1所制备的铁皮石斛多糖提取物混合，向所得混合物中加入适量的95％乙醇，制成软材，挤压过20～24目筛制粒，40℃至65℃干燥1小时至4小时，过20目筛整粒，灌于胶囊中，制得1000粒。
实施例5含铁皮石斛多糖提取物的口服液的制备实施例3纯化的铁皮石斛多糖提取物A 20g苯甲酸钠 2g取实施例3中制备的铁皮石斛多糖提取物A，加苯甲酸钠，加注射用水至适量，加热溶解，放冷，再加注射用水补充到1000ml，搅拌，用0.45μm微孔滤膜过滤，灌装，封口，100℃，灭菌30分钟，即得。
实施例6含铁皮石斛多糖提取物的口服液的制备实施例3纯化的铁皮石斛多糖提取物B 15g
苯甲酸钠 1.5g取实施例3中制备的铁皮石斛多糖提取物B，加苯甲酸钠，加注射用水至适量，加热溶解，放冷，再加注射用水补充到1000ml，搅拌，用0.45μm微孔滤膜过滤，灌装，封口，100℃，灭菌30分钟，即得。
实施例7含铁皮石斛多糖提取物的注射用冻干粉剂的制备取实施例3中制备的纯化的铁皮石斛多糖提取物A20g，向其中加注射用水至适量，加热溶解，放冷，再加注射用水补充到1000ml，搅拌，调节pH至6.5-7.0，用0.22μm微孔滤膜过滤，无菌分装，冻干，即得。
实施例8含铁皮石斛多糖提取物的注射液的制备取实施例3中制备的纯化的铁皮石斛多糖提取物B15g，向其加注射用水至适量，加热溶解，放冷，再加注射用水补充到1000ml，搅拌，调节pH至6.5-7.0，用0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，封口，100℃，灭菌30分钟，即得。
权利要求
1.一种铁皮石斛多糖提取物，其特征在于所述铁皮石斛多糖提取物是以铁皮石斛为原料提取的，其分子量为1-30万，多糖含量不低于25％(重量)；其中所述铁皮石斛多糖提取物的分子量优选为10～30万，多糖含量优选为25％～50％(重量)。
2.一种铁皮石斛多糖提取物的制备方法，其特征在于其包括以下步骤(1)脱脂将铁皮石斛粉碎成粗粉后，用10-30倍有机溶剂回流1-4次，获得药渣；(2)提取加水煎煮上述药渣1-4次，每次1-4小时，每次加水10-30倍，得到煎煮液；(3)浓缩合并上述煎煮液，浓缩到每ml相当于含生药0.2-2g，得到浓缩液；(4)醇沉向上述浓缩液中加入适量乙醇进行沉淀，使得含醇量达50％-80％(体积百分比)，将醇液静置过夜；(5)干燥将上述醇液过滤，沉淀加2-3倍有机溶剂洗涤后，抽干，减压干燥，得到多糖含量不低于25％(重量)的铁皮石斛多糖提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯或80％-95％的乙醇水混合物。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的提取温度为50-100℃，优选的提取温度为80-100℃。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中的有机溶剂为石油醚、丙酮、无水乙醇、甲醇、乙醚、氯仿或其混合物，其中优选的有机溶剂为无水乙醇。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述制备方法还包括以下浓缩纯化步骤(1)溶解将所述铁皮石斛多糖提取物加20-100倍水，加热搅拌使其充分溶解，所得液体高速离心，取上清液；(2)脱蛋白将上述上清液稀释到0.01-0.05g/ml，加入1/5体积的sevage试剂萃取1-4次，离心除去沉淀，得到离心上清液；(3)超滤将得到的离心上清液用分子量为10K的超滤膜浓缩，得到浓缩液；(4)柱层析将得到的浓缩液过DEAE-52树脂柱，用蒽酮硫酸法在线检测，用洗脱液洗脱，收集多糖含量不低于25％(重量)的洗脱液；(5)干燥将上述洗脱液减压浓缩后冻干，即得到纯化的铁皮石斛多糖；其中，所述步骤(4)中的洗脱液为去离子水和盐溶液。
7.一种含有铁皮石斛多糖提取物的药物组合物，其特征在于其包括治疗有效量的以铁皮石斛为原料的铁皮石斛多糖提取物和药学上可接受的载体，其中所述铁皮石斛多糖提取物其分子量在1-30万，在所述铁皮石斛提取物中多糖含量不低于25％(重量)。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的剂型为口服固体制剂、口服半固体制剂、口服液体制剂或注射剂；其中所述口服固体制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、滴丸剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、固体分散剂、散剂、微颗粒剂、微丸剂、微囊剂、微球剂，优选的为颗粒剂；所述注射剂为注射液、注射用冻干制剂、注射用无菌分装制剂、氯化钠注射液、葡萄糖注射液，优选的为注射液或注射用冻干粉剂；所述口服液体制剂优选的为口服液。
9.一种含有铁皮石斛多糖提取物的药物组合物的制备方法，其特征在于根据权利要求1-6中任一项所述的铁皮石斛多糖提取物或其纯化的铁皮石斛多糖与药学上可接受的载体混合制备而成。
10.铁皮石斛多糖提取物在制备辅助治疗免疫力低下引起的疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种铁皮石斛多糖提取物及其制备方法，所述铁皮石斛多糖提取物分子量为1－30万，多糖含量不低于25％(重量)。本发明还涉及一种含有铁皮石斛多糖提取物的药物组合物及其制备方法以及铁皮石斛多糖提取物在制备辅助治疗免疫力低下引起的疾病的药物中的应用。本发明的提取物及含有其的药物组合物生物利用度高，可显著增强机体免疫功能，无毒副作用，且本发明的制备方法简单，便于操作与工业化生产。
文档编号A61P37/04GK101015649SQ20061014567
公开日2007年8月15日 申请日期2006年11月23日 优先权日2006年11月23日
发明者石秀伟, 章晓骅 申请人:天津市轩宏医药技术有限公司