一种无明胶水痘疫苗冻干制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗制造领域。具体地，涉及制备具有高安全性的无明胶水痘疫苗冻 干制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 水痘是一种高度传染性疾病，其发生具有明显的季节性和周期性。通过预防接种 水痘疫苗是目前控制病毒传播的唯一方法。由日本大阪大学微生物疾病研究所（BIKEN)的 学者建立的VZV Oka株，是目前国际上唯一获得WHO认可的疫苗株。临床研究证明，Oka株 水痘疫苗接种反应轻微，能诱导机体产生良好的、持久的免疫应答和保护效果。
[0003] 现行水痘减毒活疫苗所用稳定剂为含谷氨酸钠、蔗糖和明胶的磷酸盐缓冲液，其 中明胶成分是动物源性辅料，不但容易引起过敏反应，还存在潜在感染动物源性病毒的安 全隐患。然而，在冻干制剂的制备过程中，若缺少了明胶，会造成冻干支架建立不足，制剂呈 薄膜状，冻干制剂的水份蒸发少，从而极易导致减毒病毒株的死亡，而这样制备的疫苗制剂 则极不稳定。
[0004] 目前，现有技术中也尝试开发各种替代明胶的疫苗制剂，然而，新加入的制剂却造 成了更多比明胶更为严重的副作用，例如右旋糖酐与海藻糖的组合反而造成偶有过敏反应 如荨麻疹、皮肤瘙痒、发热、恶心、呕吐等的副作用。因此无明胶的水痘制剂至今迟迟无法上 市。因此，尚无一种能够合理替代明胶的水痘疫苗制剂辅料，能达到相同的病毒株稳定性的 同时还使其安全性更高。
[0005] 因此，本领域迫切需要开发一种稳定、安全、副作用少的疫苗稳定剂以及相应的水 痘疫苗。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种不含明胶、右旋糖酐或动物蛋白的水痘疫苗冻干制剂及其制备 方法。
[0007] 本发明第一方面，提供了一种水痘疫苗冻干制剂，所述的冻干制剂含有水痘疫苗 原液和疫苗稳定剂，其中，所述疫苗稳定剂按疫苗原液初始浓度计，含有以下组分：
[0008] 蔗糖 3-10%，
[0009]谷氨酸钠 0.01-1%;
[0010] 任选的缓冲液余量；
[0011] 且所述的冻干制剂不含明胶、右旋糖酐、和/或动物源性蛋白。
[0012] 在另一优选例中，所述的冻干制剂在加入生理盐水后能形成pH为7. 0的水痘疫苗 复溶液。
[0013] 在另一优选例中，所述的缓冲液含有氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷 酸氢二钾、磷酸二氢钾；较佳地，含有氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾。
[0014] 在另一优选例中，所述的缓冲液中，各组分的浓度为：氯化钠0.9 %、氯化钾 0. 1 %、磷酸氢二钠1. 5%、磷酸二氢钾0. 2%。
[0015] 在另一优选例中，所述的动物源性蛋白包括人血白蛋白。
[0016] 在另一优选例中，所述的蔗糖按疫苗原液初始浓度计为5-8%，较佳地，为 5. 5-7. 5%。
[0017] 在另一优选例中，所述的疫苗稳定剂还含有海藻糖。
[0018] 在另一优选例中，所述的海藻糖的量基于疫苗原液初始浓度计，为0. 8-5%，较佳 地，为2-4%。
[0019] 在另一优选例中，所述的冻干制剂在l〇°C以下保存18-24个月后病毒滴度下降 0· 5-0· 6〇
[0020] 在另一优选例中，所述的冻干制剂制备如下：
[0021] (i)以水痘病毒为毒种，感染MRC-5人二倍体细胞株并培养，从而获得受水痘病毒 毒株感染的MRC-5人二倍体细胞；
[0022] (ii)将（i)中受水痘病毒毒株感染的MRC-5人二倍体细胞破细胞并收集上清液， 从而获得水痘疫苗原液；
[0023] (iii)将（ii)中所述的水痘疫苗原液与权利要求1所述的稳定剂混合，从而获得 水痘疫苗制剂；
[0024] (iv)将（iv)中的水痘疫苗制剂经冻干工艺后获得水痘疫苗的冻干制剂，其中所 述冻干工艺中，冻结温度为-32±2°C，和/或干燥时间为16±1小时。
[0025] 在另一优选例中，所述水痘疫苗的毒株来自水痘Oka株。
[0026] 本发明第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述水痘疫苗冻干制剂的方 法，其特征在于，包括步骤：
[0027] (i)以水痘病毒为毒种，感染MRC-5人二倍体细胞株并培养，从而获得受水痘病毒 毒株感染的MRC-5人二倍体细胞；
[0028] (ii)将（i)中受水痘病毒毒株感染的MRC-5人二倍体细胞破细胞并收集上清液， 从而获得水痘疫苗原液；
[0029] (iii)将（ii)中所述的水痘疫苗原液与本发明第一方面所述的稳定剂混合，从而 获得水痘疫苗制剂；
[0030] (iv)将（iv)中的水痘疫苗制剂经冻干工艺后获得水痘疫苗的冻干制剂，其中所 述冻干工艺中，冻结温度为-32±2°C，和/或干燥时间为16±1小时。
[0031] 在另一优选例中，所述的步骤（i)中，还包括在感染毒株前，用细胞培养液对 MRC-5株人二倍体细胞进行扩增传代，其中传代比例为1:2或1:4,生产工艺为细胞工厂，以 36土 1°C培养3~5天。
[0032] 在另一优选例中，待MRC-5人二倍体细胞株生长成均匀、致密的单层细胞后，更换 培养基为细胞维持液，并加入Oka株毒种感染细胞。
[0033] 在另一优选例中，待MRC-5人二倍体细胞株出现35%~65%的典型病变时，弃去 细胞维持液，用不少于原液量体积的洗涤液洗涤细胞表面。
[0034] 在另一优选例中，所述的细胞培养液为含红霉素60 μ g/ml和含胎牛血清10%~ 15_MEM〇
[0035] 在另一优选例中，所述细胞扩增传代的接种浓度为4. 2X 107个细胞/层。
[0036] 在另一优选例中，所述的毒种按0. 001~0. 01M0I接种MRC-5人二倍体细胞。
[0037] 在另一优选例中，所述细胞维持液为含胎牛血清3 %的MEM。
[0038] 在另一优选例中，所述的洗涤液为PBS缓冲液。
[0039] 在另一优选例中，所述的破细胞包括将受水痘病毒毒株感染的MRC-5人二倍体细 胞经冻融、超声后获得。
[0040] 在另一优选例中，所述的冻融温度为-60°C。
[0041] 本发明第三方面，提供了一种预防水痘的方法，包括步骤：
[0042] (a)将本发明第一方面所述的冻干制剂复溶，从而获得复溶后的水痘疫苗；
[0043] (b)向需要的对象施用（a)中所述复溶后的水痘疫苗。
[0044] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0045] 图1显示了 5种水痘减毒活疫苗成品和复溶后的外观照片，其中，图la是冻干疫 苗成品，图lb是复溶后疫苗，其中，从左到右依次为A、B、C、D、E疫苗。
【具体实施方式】
[0046] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，由特定比例的蔗糖、谷氨酸钠 构成的体系能够有效地形成良好的疫苗稳定系统，能够代替明胶制成水分含量合适的冻干 制剂，并使水痘疫苗能够长期保存且不造成毒株滴度的显著下降，所制备的疫苗冻干制剂 的稳定性与含明胶的对照制剂相似。此外，实验还证明，缓冲溶液的pH值以及冻干制剂制 备过程中的冻干工艺参数也能够对无明胶水痘疫苗冻干制剂具有一定的影响。在此基础 上，完成了本发明。
[0047] 术语
[0048] 如本文所用，术语"疫苗原液"指的是对感染水痘病毒的细胞培养、破细胞壁、分离 的含有水痘减毒病毒的原液。
[0049] 如本文所用，术语"水痘疫苗制剂"指的是加入本发明稳定剂后的液体疫苗，而当 在将本发明水痘疫苗冻干制剂加入生理盐水复溶后，所产生的疫苗液体也可以被称作"水 痘疫苗制剂"或"水痘疫苗复溶液"。
[0050] 如本文所用，术语"水痘疫苗冻干制剂"、"无明胶本发明制剂"可互换使用，均指将 水痘疫苗制剂经冻干工艺后获得的特殊冻干制剂形式。
[0051] 如本文所用，若非另行定义，本发明稳定剂中各成分的浓度均为以水痘疫苗原液 的质量计。
[0052] 水痘毒株
[0053] 可用于本发明的水痘毒株没有特殊限制，可以为任何WHO批准认可的临床可应用 的疫苗株。例如，目前常用的是由日本大阪大学微生物疾病研究所（BIKEN)的学者建立的 VZV Oka株，其可通过商业购买方式获得。Oka株水痘疫苗接种反应轻微，能诱导机体产生 良好的、持久的免疫应答和保护效果。
[0054] 疫苗稳定剂
[0055] 如本文所用，术语"疫苗稳定剂"通常指的是一类疫苗组合物中维持疫苗稳定性的 药学上可接受的载体。而可用于本发明的疫苗稳定剂不含有任何明胶、右旋糖酐或动物源 性蛋白（如人血白蛋白）。本发明所述的疫苗稳定剂所含有的组分如下：
[0056] 蔗糖 3-10%，
[0057] 谷氨酸钠 0.01-1%;
[0058] 任选的缓冲液余量；
[0059] 此外，本发明疫苗稳定剂还能够含有海藻糖。
[0060] 优选地，所述的蔗糖按疫苗原液初始浓度计为5-8%，较佳地为5. 5-7. 5%;所