专利名称：长链非编码rna基因linc00312的应用方法
技术领域：
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA基因LINC00312的应用方法。
背景技术：
鼻咽癌是一种上皮源性的多基因遗传性肿瘤，具有明显的种族和地域差异，临床表现复杂多变，发病机制还不十分清楚，治疗效果也不理想，五年生存率仍徘徊在50%左右。如何揭示鼻咽癌发生发展的分子机制、发现其预后的特异性分子标志物、预测鼻咽癌患者的预后，从而实现对鼻咽癌患者的预后判定，采用不同的针对性治疗方案，实现对鼻咽癌患者的个体化治疗，最终提高五年生存率、降低死亡率，是目前值得临床科研工作者们研究的重要课题。长链非编码RNA (long non-coding RNA, IncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，研究发现很多IncRNA在肿瘤的发生发展中有重要调节作用，它具有抑制肿瘤生长和促进肿瘤转移等生物学作用。IncRNA根据其基因位置可分为五种类型:正义 IncRNA(sense IncRNA)、反义 IncRNA(antisense IncRNA)、双向 IncRNA(bidirectionalIncRNA)、基因内 IncRNA(intronic IncRNA)及基因间 IncRNA(intergenic IncRNA) 之前一直被认为是转录“噪音”的IncRNA，因在基因调节中的重要功能，目前已成为继miRNA之后非编码RNA领域又一研究热点。近年的研究已表明，IncRNA参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。IncRNA有望成为肿瘤诊断、治疗和预后新的标志物，同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。LINC00312是一个长的基因间非编码RNA，位于染色体3ρ25.3，3p25.3-26.3是一个与鼻咽癌发生密切相关的 染色体等位基因共同缺失区域。我们利用显微切割技术获得纯净的鼻咽癌组织样本，抽提RNA 后通过逆转录，实时定量PCR，检测了 LINC00312在鼻咽癌组织中的表达情况，结果显示LINC00312在鼻咽癌组织中表达下调(Ρ〈0.001)。我们随后又利用鼻咽癌组织微阵列技术，通过原位杂交的方法，在大样本中验证了 LINC00312在鼻咽癌中表达显著下调(Ρ〈0.001)。ROC曲线分析发现LINC00312表达能很好区分鼻咽癌患者和非癌患者，因此LINC00312的检测制剂可用于鼻咽癌的辅助诊断。且LINC00312表达与临床进展及肿瘤大小呈负相关，但与淋巴结转移呈正相关，生存曲线分析发现在无淋巴结转移的鼻咽癌患者中LINC00312阳性表达的患者其总生存率和无病生存率高于LINC00312阴性表达的患者，而在有淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达的患者其总生存率和无病生存率低于LINC00312阴性表达的患者。多因素分析则证实LINC00312是鼻咽癌预后的独立判断因素。
发明内容
本发明的目的是提供LINC00312基因的应用方法，利用该基因可以制备用于鼻咽癌辅助诊断或者预后预测的制剂。
所述的用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂包括原位杂交检测试剂和实时定量PCR检测试剂。根据该基因序列设计并合成用于原位杂交的寡核苷酸探针，具体序列如下:5' -ctactataaggaaaagcactatcttctccc-3'5'-gccttaggtcagattctactagtttaaagc-3'5' -agactggttgtctgccccatagtagttgtc-3'。根据该基因序列设计并合成出用于实时定量PCR的检测引物，具体序列如下:用于实时定量PCR检测的上、下游引物分别为5 ’ -AAGCGAACCAAGCCAATA-3 ’和5， -CAAATCCCTGAAACTCTG-3，。
申请人利用显微切割技术获得纯净的鼻咽癌或正常鼻咽上皮组织样本，抽提RNA后逆转录，荧光实时定量PCR检测了 LINC00312表达，结果显示LINC00312在鼻咽癌组织中表达下调(P〈0.001)。并通过原位杂交也发现LINC00312在鼻咽癌中表达显著下调，与临床进展及肿瘤大小呈负相关，与淋巴结转移呈正相关，LINC00312表达能很好区分鼻咽癌患者和非癌患者，有明显的统计学差异。另外，LINC00312的表达与预后密切相关，多因素分析发现LINC00312可作为预测鼻咽癌预后的独立预后因素。提示LINC00312可作为鼻咽癌预后预测的分子标志。本发明为鼻咽癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和推广性。
图1为正常鼻咽上皮组织和鼻咽癌组织显微切割图片；a正常鼻咽上皮组织；b正常鼻咽上皮组织显微切割后；c鼻咽癌组织；d鼻咽癌组织显微切割后；图2为LINC00312在经显微切割后的40例正常鼻咽上皮组织和100例鼻咽癌组织中实时定量PCR结果；图3为两个各含448个不同组织点的鼻咽癌发病不同阶段组织微阵列；图4为组织微阵列各组织点对应标本的临床资料数据库；图5为原位杂交检测LINC00312在鼻咽癌(a)及非癌鼻咽上皮组织中的表达(b);图6为ROC分析结果；显示LINC00312的表达可用于区分鼻咽癌和正常鼻咽上皮，从而可以用于鼻咽癌的辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性图7根据有无转移及LINC00312表达水平将鼻咽癌患者分组，不同分组病人的预后曲线。A无淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达(+ )的患者其无病生存率高于LINC00312阴性表达(_)的患者；B无淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达(+ )的患者其总生存率高于LINC00312阴性表达(_)的患者；C有淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达(+ )的患者其无病生存率低于LINC00312阴性表达(-)的患者；D有淋巴结转移的鼻咽癌患者中，LINC00312阳性表达(+ )的患者其总生存率低于LINC00312阴性表达(_)的患者。
具体实施例方式以下结合具体实施方式
进一步说明本发明，而非限制本发明。
一、荧光实时定量PCR1.材料与方法:40例正常鼻咽上皮组织和100例鼻咽癌组织经Leica ASLMD (Leica MicrosystemsLtd.;ffetzlar, Germany)显微切割纯化后(图1 )，抽提总RNA, 2 μ g RNA经逆转录成cDNA后，进行荧光实时定量PCR。GAPDH引物为5' -GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3'(见序列表第9条序列)和5' -AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3'(见序列表第10条序列)，LINC00312引物为5’ -AAGCGAACCAAGCCAATA-3’(见序列表第 7 条序列)和 5’ -CAAATCCCTGAAACTCTG-3’。(见序列表第8条序列)荧光实时定量PCR反应体系
SYBR Premix Ex Taq (2x)10μ1
PCR Forward Primer (ΙΟμιη)0.4μ1
PCR Reverse Primer (IOpm)0.4μ1
cDNA lift2.0μ1
dii^O7.2μΙ
Total20μ1荧光实时定量PCR反应步骤I 94 0C5min2 95 °CIOsec3 58 °C30sec4 72 °C20sec5 Plate read6 82 °C30sec7 Plate read8 Go to step 2 for more 39 times9 Perform melting curve from55.0°C to 95.0°C , read every0.2°C , hold forI sec反应结束后确认荧光实时定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据 CT 值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后,采用 group t_test 检验计算P值。2.结果与正常鼻咽上皮相比，LINC00312基因在鼻咽癌组织表达下调，P〈0.001 (图2)二、原位杂交1.材料方法I)寡核苷酸探针的设计打开网址NCBI核酸数据库，输入目的基因名称LINC00312，查找基因序列，利用DNAClub软件将各基因cDNA序列转换为其互补序列。利用Primer3软件(http://frod0.w1.mit.edu/cg1-bin/primer3/primer3.cgi/)的探针设计功能，以每一个基因的互补序列为模板，在其阅读框架内设计寡核苷酸探针，探针参数设定基本一致，GC含量为40-60%，Tm为65-70°C。根椐基因序列长度，以200或300个碱基的间隔，在同一条件下设计5_6条30个碱基长度的寡核苷酸探针。使用BLAST软件(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/Blast, cgi)对所设计探针进行精确匹配，筛选出杂交参数最佳特异性的3条寡核苷酸探针。2)用于组织微阵列原位杂交的寡核苷酸探针LINC00312及用作对照的看家基因GAPDH对应的寡核苷酸探针长度为30个碱基，寡核苷酸探针5’端为磷酸基团，3’端为羟基，探针序列均为这些基因cDNA的互补序列。基因寡核苷酸探针的详细序列，GC含量，Tm值见表I。寡核苷酸探针采用化学合成方法合成。表I用于原位杂交的基因的寡核苷酸探针序列
权利要求
1.长链非编码RNA基因LINC00312的应用方法，其特征在于，根据该基因序列制备用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂包括原位杂交检测试剂和实时定量PCR检测试剂。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，根据该基因序列设计并合成用于原位杂交的寡核苷酸探针。
4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，用于原位杂交的寡核苷酸探针序列包括:5' -ctactataaggaaa agcactatcttctccc-3'5’-gccttaggtcagattctactagtttaaagc-3’5’-agactggttgtctgccccatagtagttgtc-3’ 。
5.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，根据该基因序列设计并合成出用于实时定量PCR的检测引物。
6.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，用于实时定量PCR检测的上、下游引物分别为 5’ -AAGCGAACCAAGCCAATA-3’ 和 5’ -CAAATCCCTGAAACTCTG-3 ’。
全文摘要
本发明提供了一个长链非编码RNA基因LINC00312的应用方法，根据该基因序列，设计并合成实时定量PCR引物和原位杂交探针，制备用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。利用该制剂，在鼻咽癌临床病例标本中检测LINC00312的表达水平，发现LINC00312在鼻咽癌中表达显著下调，但有转移的鼻咽癌样品中LINC00312的表达较高。将临床病理参数中的年龄、性别、组织学类型、临床分期、肿瘤大小及浸润范围、有无淋巴结转移及LINC00312表达情况进行多变量分析(Cox’s proportional hazards model)，分析这些参数与鼻咽癌病人预后的关系，结果显示LINC00312表达能作为鼻咽癌患者独立的预后因子，在没有侵袭转移的患者中LINC00312表达高预后较好，而有侵袭转移的患者中LINC00312表达高反而预后差。
文档编号C12Q1/68GK103074441SQ201310044009
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月24日 优先权日2013年1月24日
发明者李桂源, 张文玲, 黄琛, 曾朝阳, 熊炜, 李小玲, 李夏雨, 范松青, 石磊, 谭琛, 黄东海, 赵艳华 申请人:中南大学