专利名称：一种聚合酶链反应增强方法
技术领域：
本发明涉及一种聚合酶链反应增强方法，属于生物技术领域。
背景技术：
聚合酶链反应(PCR)是一种类似于DNA天然复制过程的体外DNA扩增的卓越方法。主要由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:即①双链模板DNA经高温变性后解链成单链；②在DNA聚合酶的作用下，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合！③DNA模板-引物结合物，以脱氧核糖核苷酸(dNTP)为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。PCR技术所涉及的应用研究领域极为广泛，如疾病诊断、生物多样性分析、遗传图谱构建、基因序列克隆、核酸序列测定、核酸序列体外突变，考古工作等。PCR技术也是指数富集的核酸适配体系统进化(SELEX)过程中的重要环节。利用SELEX技术可以从人工合成的随机单链核酸序列文库中筛选出能够与靶分子高特异性、高亲和性结合的核酸适配体(aptamer)。SELEX技术广泛适用于各种无机、有机小分子,肽,蛋白质,糖和抗生素,甚至复杂细胞和组织的检测。尤其，当靶分子为HIV-1表面糖蛋白(gpl20) ,MUCl-多肽(乳腺癌、胃癌等其他癌症的肿瘤标记物)，白血病细胞(CCRF-CEM)等与重大疾病相关时，SELEX技术将为重大疾病的诊疗、癌症的早期诊断提供依据。近年来，人们发现了多种用于提高PCR效率和专一性的添加剂，其中常见添加剂包括:(1)有机小分子类添加剂，二甲亚砜(Shen, ff.H.and Hohn, B.Trends Genet.,1992,8,227-227 ；Jensen, M.A., Fukushima, M.and Davis, R.ff.Plos One,2010,5)、甘油(Chakrabarti, R.and Schutt, C.E.Nucleic AcidsResearch,2001,29,2377-2381.)、三甲基甘氨酸一水合物(Pinto, A., Bermudo Redondo, M.C., Cengiz Ozalp, V.and0' Sullivan, C.K.Mol .Biosyst., 2009, 5, 548-553.)、甲酸胺(Sarkar, G., Kapelner, S.andSommer, S.S.Nucleic AcidsRes.，1990，18，7465-7465.)、氯化四甲基铵、7-脱氮 _2’_ 脱氧鸟苷(deaza-dGTP) (Musso, M., Bocciardi, R., Parodi, S., Ravazzolo, R.and Ceccherini,1.J.Mol.Diagn.，2006，8，544-550) ； (2)非离子添加剂，0.1-1 % 的曲通 X-100、吐温 20、诺纳德 P-40(NP-40) (Li, M.，Lin, Y.C.，Wu, C.C.and Liu, H.S.Nucleic AcidsRes.,2005,33.) ；(3)蛋白类添加剂，牛血清蛋白(BSA)、T4噬菌体基因32编码蛋白(一种单链DNA结合蛋白)(Kreader, C.A.Appl.Environ.Microbiol.，1996,62,1102-1106.)等。然而，已知的增强剂在其适用范围上都有局限性。例如，二甲亚砜、一水合三甲基氨甘酸可抑制二级结构的形成，因此适用于鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)含量高(大于等于55% )的模板。而当模板的GC含量小于50%时，这些添加剂对PCR显示抑制作用。一些非离子的添加剂可以稳定聚合酶，阻止模板DNA 二级结构的形成，从而增加产物的生成量，但是同时也造成了非特异扩增。最常见的蛋白类增强剂，BSA，在扩增传统DNA模板时可以提高DNA聚合酶的稳定性，减少反应物在管壁的吸附，但对于高GC含量的模板增强效果不佳。因此，迫切需要寻找新的PCR增强剂，可更多地适用于不同模板体系和复杂环境背景条件下的扩增。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，找到一种普适性增强剂应用于聚合酶链反应(PCR)体系中，提高PCR的效率和专一性。为了实现上述目的，本发明提供一种聚合酶链反应增强方法，其中，使用牛凝血酶蛋白作为添加剂。优选的，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为:0.0074 u g/mL <牛凝血酶蛋白< 84ii g/mLo进一步,对于简单线性模板L和G的聚合酶链反应,所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为2.5 ii g/mL。对于随机单链DNA文库的聚合酶链反应，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为25 ii g/mL。对于随机单链DNA文库的实时定量聚合酶链反应,所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为64 ii g/mL。对于人类全基因DNA样本的聚合酶链反应扩增，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为Iu g/mL至150 ii g/mL。对于血清样本中乙肝病毒基因的聚合酶链反应扩增，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为84y g/mL。对于加入纳米金的聚合酶链反应，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为0.0074ii g/mL至0.74ii g/mL。对于加入氧化石墨烯的聚合酶链反应,所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为50 ii g/mL。优选的，根据前述的聚合酶链反应增强方法，其中，牛凝血酶蛋白通过吸附在纳米金或氧化石墨烯的表面来消除其对聚合酶链反应的抑制。凝血酶是一种常见的丝氨酸蛋白，在水溶液中成为可溶性的单链纤维蛋白原，用于催化与凝血相关的生理反应。利用SELEX技术，人们成功地从人工合成的随机单链核酸序列文库中筛选出能与凝血酶特异结合的高亲和性核酸适配体。随着特异性结合适配体的出现，凝血酶常作为模型蛋白，用于SELEX和蛋白检测的方法学研究。实验中，我们发现将牛凝血酶蛋白(TB)加入PCR体系中，可广泛的应用于多种扩增环境中来提高低浓度的模板的PCR效率和阻止引物二聚体的形成，可以消除纳米材料对PCR的抑制作用。特别是与目前最常用的蛋白类PCR添加剂BSA相比，TB的用量仅是BSA常规用量的十分之一或更少。对于相关研究领域有潜在生物重要应用价值。将牛凝血酶蛋白(TB)作为一种普适性增强剂应用于聚合酶链反应(PCR)体系中，可显著提高PCR的效率和专一性。其特征在于作为PCR增强剂TB适用范围广，可应用于增强低模板浓度下单链DNA、低模板浓度下单链DNA随机序列文库、复杂样本中DNA序列的扩增、高GC含量模板的扩增以及有抑制剂存在条件下的扩增，消除纳米材料对PCR的抑制作用。此外，与常见的蛋白类PCR增强剂牛血清蛋白(BSA)相比，TB的用量更少，通常比前者少一个数量级。本发明具有如下的技术效果:1、采用TB作为PCR增强剂，可广泛应用于提高低模板浓度下单链DNA、低模板浓度下单链DNA随机序列文库、复杂样本中DNA序列的扩增效率；2、采用TB作为PCR增强剂，可抑制不同扩增体系中引物二聚体的形成；3、采用TB作为PCR增强剂，可消除纳米材 料对PCR的抑制作用；4、本发明所使用的蛋白质TB常规用量仅是BSA常规用量的十分之一或更少，廉价易得。
图1是示出牛凝血酶蛋白(TB)提高低模板浓度下单链DNA序列(L和G)的扩增效率的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2是示出牛凝血酶蛋白(TB)提高低浓度条件下随机单链DNA文库的扩增效率的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图3是示出实时定量PCR中加入牛凝血酶蛋白(TB)提高单链随机DNA文库的扩增效率的图。图4是示出实时定量PCR退火温度曲线的图。图5是示出牛凝血酶蛋白(TB)提高人类全基因样本中性别基因的扩增效率的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图6是示出牛凝血酶蛋白(TB)提高HBV临床样本的扩增效率和专一性的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图7是示出牛凝血酶蛋白(TB)消除纳米金颗粒在全基因样本中性别基因扩增时的抑制作用的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图8是示出牛凝血酶蛋白(TB)消除氧化石墨烯(GO)对于单链DNA模板L和G在扩增时的抑制作用的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图9是示出牛凝血酶蛋白(TB)在扩增随机单链DNA文库时优于牛血清蛋白(BSA)的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图10是示出牛凝血酶蛋白(TB)在扩增全基因模板中的性别基因时优于牛血清蛋白(BSA)的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图11是颜色反应 显示三种蛋白在模拟PCR体系中竞争性吸附于纳米金的图。图12是粒径测量显示三种蛋白在模拟PCR体系中竞争性吸附于纳米金的图。
具体实施例方式表1:本发明中使用的核酸探针序列。
权利要求
1.一种聚合酶链反应增强方法，其特征在于，使用牛凝血酶蛋白作为添加剂。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链反应增强方法，其特征在于，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为=0.0074 u g/mL彡牛凝血酶蛋白彡84y g/mL。
3.根据权利要求2所述的聚合酶链反应增强方法，其特征在于，对于简单线性模板L和G的聚合酶链反应,所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为2.g/mL。
4.根据权利要求2所述的聚合酶链反应增强方法，其特征在于，对于随机单链DNA文库的聚合酶链反应，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为25 ii g/mL。
5.根据权利要求2所述的聚合酶链反应增强方法，其特征在于，对于随机单链DNA文库的实时定量聚合酶链反应，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为64 ii g/mL。
6.根据权利要求2所述的聚合酶链反应增强方法，其特征在于，对于人类全基因DNA样本的聚合酶链反应扩增，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为Iu g/mL至150ii g/mL。
7.根据权利要求2所述的聚合酶链反应增强方法，其特征在于，对于血清样本中乙肝病毒基因的聚合酶链反应扩增，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为84 ii g/mL。
8.根据权利要求2所述的聚合酶链反应增强方法，其特征在于，对于加入纳米金的聚合酶链反应，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为0.0074 u g/mL至0.74y g/mL。
9.根据权利要求2所述的聚合酶链反应增强方法，其特征在于，对于加入氧化石墨烯的聚合酶链反应，所述牛凝血酶蛋白在反应体系中的含量为50 ii g/mL。
10.根据权利要求8或9所述的聚合酶链反应增强方法，其特征在于，牛凝血酶蛋白通过吸附在纳米金或 氧化石墨烯的表面来消除其对聚合酶链反应的抑制。
全文摘要
本发明涉及一种聚合酶链反应增强方法，属于生物技术领域，是采用牛凝血酶蛋白作为添加剂，应用于多种类型扩增模板和扩增环境中，以显著提高聚合酶链反应(PCR)的效率和专一性的方法。通过在PCR体系中添加适量牛凝血酶蛋白，可提高低模板浓度单链DNA模板、低模板浓度单链随机序列DNA文库、乙肝患者血清中乙肝病毒基因(HBV)、人类全基因样本中性别基因的扩增效率和抑制引物二聚体的形成。此外，在有纳米金、氧化石墨烯类抑制剂存在的条件下，加入牛凝血酶蛋白，可消除抑制剂对于PCR反应的抑制性作用。与目前最常用的蛋白类PCR添加剂牛血清蛋白(BSA)相比，牛凝血酶蛋白的用量仅是BSA常规用量的十分之一或更少。
文档编号C12N15/10GK103074329SQ20131004385
公开日2013年5月1日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者娄新徽, 张颖, 邹如杏, 王文洁 申请人:首都师范大学