专利名称：IL-1ra-Fcε融合基因及其编码的蛋白在治疗过敏性鼻炎方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及IL-Ira-Fc ε融合基因及其编码的蛋白在治疗过 敏性鼻炎方面的应用。
背景技术：
鼻腔炎性细胞浸润以及血清中IgE浓度升高是过敏性鼻炎主要的指征。抑制IgE 水平升高及抗炎治疗是过敏性鼻炎治疗的研究热点。研究证实，IL-Ira作为有效的抗炎因 子，具有治疗和预防过敏性鼻炎的作用，但IL-Ira分子半衰期较短，在一定程度上限制了 它的广泛应用。鼻炎发病过程中，IgE与其高亲和力受体的结合是触发肥大细胞、嗜碱性粒 细胞脱颗粒，是导致发病的关键因素。阻断IgE与其高亲和力受体的结合是治疗过敏性鼻 炎的有效靶点之一。白细胞介素-I(IL-I)为体内作用较强的致炎症细胞因子之一，在过敏性鼻炎发 生、发展过程中具有重要作用。IL-Ira作为天然的IL-I拮抗剂，它能在受体水平拮抗IL-I 的作用。但由于IL-Ira在体内的半衰期极短，且需要大量的IL-Ira才能消除IL-I的作 用，所以必须长期大剂量的应用才能达到治疗的效果，此点在IL-Ira治疗类风湿性关节炎 中得到证实，长期的全身大剂量用药将产生强烈的不良作用。IgE与其受体结合是诱发过敏性鼻炎的关键性因素，阻断IgE与其高亲和力受体 的结合是治疗过敏性鼻炎的有效靶点之一，IgE分子恒定区Fc3-4具有与IgE高亲和力受 体的结合的特点。本研究室利用基因工程技术将IL-Ira和IgE分子恒定区Fc3_4基因重 组在一起，获得了可阻断IgE与其高亲和力受体结合，又可拮抗IL-I的生物学效应并延长 IL-Ira的半衰期的具有双功能的融合蛋白分子。本发明将IgE分子的Fc3_4区与IL-Ira构建成融合分子，利用该融合基因及其所 编码的蛋白，以分别直接给药的方式治疗过敏性鼻炎。滴注的裸基因表达载体可以在鼻腔 内表达，表达的重组蛋白不仅能拮抗IL-I的炎性作用，其中融合的Fc片段还可封闭IgE的 受体，抑制肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒，从而达到治疗过敏性鼻炎的目的；利用纯化制备的重组IL-Ira-Fc ε蛋白直接滴注也可获得同样的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供IL-Ira-Fc ε融合基因在治疗过敏性鼻炎方面的应用。本发明的目的还在于提供IL-Ira-Fc ε融合基因编码的蛋白在治疗过敏性鼻炎 方面的应用IL-Ira-Fc ε融合基因在治疗过敏性鼻炎方面的应用，其特征在于，将构建的融合 基因表达载体与转染试剂配置成混悬液，直接滴入鼻腔，对过敏性鼻炎进行治疗，滴入周期 为每天一次，连续滴鼻7天。所述转染试剂为脂质体2000，用量为10 100 μ L/只大鼠；所述IL-lra-Fc ε融合基因载体的用量为10 100 μ g/只大鼠。 IL-Ira-Fc ε融合蛋白在治疗过敏性鼻炎方面的应用，其特征在于，将纯化的 IL-Ira-Fc ε融合蛋白用PBS缓冲液稀释至0. 1 5mg/ml，直接滴入鼻腔，治疗过敏性鼻 炎，滴入周期为每天一次，连续滴鼻7天。所述IL-Ira-Fc ε融合蛋白的用量为0. 2mg/只大鼠。所述纯化的IL-Ira-Fc ε融合蛋白为经过S300分子筛柱和S_s印harose阳离子 层析柱纯化并逐步透析复性的蛋白[2]。PBS 缓冲液成分为 NaCl 1. 37mol/L、KCl 27mmol/L、Na2HPO4IOOmmo 1/L、KH2PO4 20mmol/L, pH 为 7· 5。本发明的有益效果本发明的IL-Ira-Fc ε融合基因编码的蛋白即能拮抗IL-I 的炎性作用，还可抑制肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒，从而达到治疗过敏性鼻炎的目 的。可直接利用构建的IL-Ira-Fc ε真核表达载体滴鼻治疗过敏性鼻炎；利用纯化的 IL-Ira-Fc ε融合蛋白直接滴鼻也可治疗过敏性鼻炎。
图1为大鼠鼻腔病理HE染色嗜酸性粒细胞计数；其中，A-正常组、B-模型组、C-IL-Ira-Fc ε基因治疗组、D-IL-lra-Fc ε蛋白治 疗组；图2为大鼠鼻腔转染荧光检测；其中，A-对照组、B-IL-Ira-Fc ε基因治疗2天后、C-IL-lra-Fc ε基因治疗7天
后O
具体实施例方式以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆 实验指南》第三版[5]相应部分(J.萨姆布鲁克Ε. F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试 剂盒的说明书。实施例1 IL-Ira-Fce融合基因治疗载体的制备将pIRES2-EGFP-IL-lra_Fc ε融合基因表达载体[1]转化入大肠杆菌DH5 α，LB培 养基37°C药瓶培养，9000rpm离心收集菌体，利用OMEGA公司质粒大提试剂盒大量提取质 粒，利用乙醇沉淀法将质粒浓缩至大于lmg/ml，-20°C保存待用。实施例2 IL-Ira-Fc ε融合基因的表达和蛋白纯化将原核表达载体pBV220-IL-lra-Fc ε转化入大肠杆菌BL21，利用原核发酵 工艺培养和诱导大肠杆菌BL21表达该重组蛋白，超声破碎菌体，利用S300分子筛柱和 S-sepharose阳离子层析柱(SPFF)分离纯化重组蛋白，最后逐步透析法复性蛋白[2]。实施例3动物模型的建立[3’4]选择健康的雌性Wistar大鼠，重量为135_165g。第1天将Iml的生理盐水、1. 5mg 卵蛋白、3mg氢氧化铝溶胶和IX IOki个灭活百日咳杆菌混合注射到大鼠的四只脚掌皮下， 前后脚掌皮下每只分别各注射0.2ml和0.3ml。第5天将Iml的生理盐水、1. Omg卵蛋白和 2mg氢氧化铝溶胶混合注射到背部皮下，分5点，每点各注射0. 2ml，加强一次。从第14天开始激发小鼠每天用的卵蛋白生理盐水溶液滴鼻，每侧鼻孔各30 μ 1，每天1次，共10 次。滴鼻激发后30min内行为学(喷嚏和抓鼻次数)及症状表现(鼻分泌物等)满足 大于等于2分即为造模成功。评分标准(1)0分无喷嚏抓鼻、喷嚏及鼻分泌物；(2) 1分喷嚏< 4个，轻度抓 鼻，前鼻孔有鼻分泌物；C3) 2分喷嚏4 10个，频繁抓鼻，鼻分泌物超过前鼻孔；(4) 3分 喷嚏> 11个，持续抓鼻、摩擦，脸部布满鼻分泌物。实施例4治疗方案和结果方案1 将脂质体 200050 μ 1 与含有 50 μ g pIRES2-EGFP-IL-lra_Fc ε 融合基因 表达质粒载体的溶液50μ 1混勻，每只滴鼻 οομ 1，每天给药，共给药7次。记录行为学分 数，降至2分以下即为初步确定有效。待病理及嗜酸性粒细胞计数检测。方案2 将纯化的IL-Ira-Fc ε融合蛋白用PBS缓冲液稀释至2mg/ml，每只滴鼻 ΙΟΟμΙ，每天给药，共给药7次。记录行为学分数，降至2分以下即为初步确定有效。待病 理及嗜酸性粒细胞计数检测。治疗结果给药三次后，宏观观察治疗组挠鼻及打喷嚏症状较给药前明显减少，平均分数降 至2分以下，模型组平均分数仍为2分以上(表1)，嗜酸性粒细胞计数也明显少于模型组。表1 IL-Ira-Fc ε基因和蛋白治疗2天和7天后计分变化
权利要求
1.IL-Ira-Fc ε融合基因在治疗过敏性鼻炎方面的应用，其特征在于，将构建的融合基 因表达载体与转染试剂配置成混悬液，直接滴入鼻腔，对过敏性鼻炎进行治疗，滴入周期为 每天一次，连续滴鼻7天。
2.根据权利要求1所述IL-Ira-Fcε融合基因在治疗过敏性鼻炎方面的应用，其特征 在于，所述转染试剂为脂质体2000，用量为10 100 μ L/只大鼠；所述IL-Ira-Fc ε融合 基因载体的用量为10 100 μ g/只大鼠。
3.IL-Ira-Fc ε融合蛋白在治疗过敏性鼻炎方面的应用，其特征在于，将纯化的 IL-Ira-Fc ε融合蛋白用PBS缓冲液稀释至0. 1 5mg/ml，直接滴入鼻腔，治疗过敏性鼻 炎，滴入周期为每天一次，连续滴鼻7天。
4.根据权利要求3所述IL-Ira-Fcε融合蛋白在治疗过敏性鼻炎方面的应用，其特征 在于，所述IL-Ira-Fc ε融合蛋白的用量为0. 2mg/只大鼠。
全文摘要
本发明公开了属于生物医药领域的IL-1ra-Fcε融合基因及其编码的蛋白在治疗过敏性鼻炎方面的应用。本发明是将构建的IL-1ra-Fcε融合基因表达载体按照一定的浓度配制成混悬液，直接滴入鼻腔治疗过敏性鼻炎；或者将纯化的IL-1ra-Fcε融合蛋白用PBS缓冲液稀释至一定的浓度，滴入鼻腔，治疗过敏性鼻炎。本发明中，IL-1ra-Fcε融合基因编码的蛋白能拮抗IL-1的炎性作用、抑制肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒，从而达到治疗过敏性鼻炎的目的。
文档编号A61K48/00GK102145179SQ20111003083
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者付文亮, 刘中成, 徐东刚, 王园园, 邹民吉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所