一种新城疫病毒耐热改造方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒反向遗传操作领域，尤其涉及一种新城疫病毒耐热改造方法及应 用，更具体地，本发明涉及一种对非耐热新城疫病毒进行耐热改造的方法和耐热改造后的 重组病毒在疫苗制备方面的应用。
【背景技术】
[0002] 新城疫（NewcastleDisease，ND)是由新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus， NDV)引起的极易传染的毁灭性疾病，有较高的发病死亡率，被国际兽疫局规定为仅有的两 种A类禽病之一，另一种为禽流感。新城疫病毒属副粘病毒科（Paramyxoviridae)腮腺炎 病毒属（Avulavirus)。新城疫病毒的基因组为单股、负链、不分阶段的RNA，全长为15186 个碱基，遵循六碱基原则，包含55碱基的3'前导序列和5'后随序列，两者之间存在6个 结构基因，按顺序排列分别为3'-NP(核衣壳蛋白）-P(磷酸化蛋白）-M(基质蛋白）-F(融 合蛋白）-HN(血凝素神经氨酸酶蛋白）-L(大聚合酶蛋白）-5 '，基因组编码至少7个蛋白。 在各个结构基因开放阅读框的起始和终止端都存在转录控制序列，分别为起始序列（Gene start，GS)和终止序列（Geneend，GE)，各个基因间存在1-47个数量不等的核苷酸间隔区 (IGS)。
[0003] 鸡新城疫首次于1926年爆发于印尼的爪哇和英国的新城，一直在除大洋洲以外 的全世界范围内发生流行，给全球造成了巨大的经济损失。在我国，新城疫也是危害最为严 重的禽病之一，许多地区一直都有该病流行，典型的新城疫以呼吸困难、下痢、神经紊乱、消 化道粘膜广泛出血等为特征。新城疫的控制以免疫预防为主，属国家强制性免疫疫病。近 年来随着疫苗的广泛应用，新城疫的大规模暴发流行已受到明显控制，但该病出现了新的 流行特点，如非典型新城疫不断发生、混合感染普遍和宿主范围不断扩大等。
[0004] 目前，国际上生产和使用的新城疫疫苗有两大类，即活疫苗和灭活疫苗。活疫苗 包括低毒力株疫苗和中等毒力株疫苗，低毒力株疫苗包括Π系苗（Bl)、III系苗（LaSota 株）、Clone-30、V4等；中等毒力疫苗包括I系苗、Roskin株、Komorov株、Hert33株和 Mukteswar株等。有些低毒力活疫苗具有独特的耐热特性，称之为耐热活疫苗，代表株有 V4、HB92和TS09-C株等。此类疫苗具有耐热、低毒、免疫效果好、可同群感染、多途径免 疫（拌料、喷雾等）等优点，适用于鸡、鸽、鹌鹑等多种禽类的新城疫防控。与其他非耐热 疫苗相比，该疫苗在气温普遍较高的南方地区和冷链条件较差的农村推广应用更有优势， 在新城疫的防控中发挥了重要作用。但目前应用最为广泛的低毒力疫苗株LaSota株以及 中等毒力株均为非耐热型新城疫病毒株。因此，探讨新城疫病毒的耐热机理以及如何提高 LaSota株等其他新城疫病毒株的耐热特性显得极具意义。
[0005] 现有关于新城疫反向遗传技术的文献较多，但均未见涉及到对新城疫病毒进行耐 热改造的方法的报道。例如：专利号为200510097997. 8的文献"新城疫LaSota疫苗株反向 遗传操作系统及其应用"公开了以新城疫病毒LaSota疫苗株为基础的非耐热活疫苗载体， 但未涉及对新城疫病毒耐热改造的方法；专利号为200610075781. 6的文献"表达禽流感病 毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株"公开了以新城疫LaSota疫苗株载体 构建的禽流感、新城疫二联基因工程活疫苗，也未涉及到对新城疫病毒耐热改造的方法；申 请号为CN201310090099. 4的文献"新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用"公开了新城 疫病毒耐热活疫苗载体系统，但未涉及到对非耐热新城疫病毒的耐热改造方法。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新城疫病毒耐热改 造的方法及应用。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
[0008] -种新城疫病毒耐热改造方法，该方法包括如下步骤：a.构建非耐热新城疫病毒 的转录质粒；b.将非耐热新城疫病毒的转录质粒中的HN基因替换为耐热新城疫病毒的HN 基因，获得改造的转录质粒；c.将改造的转录质粒与三个辅助质粒共同转染宿主细胞，获 得耐热改造的重组新城疫病毒。
[0009] 按上述方案，所述的非耐热新城疫病毒的转录质粒能表达非耐热新城疫病毒的全 基因组cDNA。
[0010] 按上述方案，所述的非耐热新城疫病毒为LaSota株。
[0011] 按上述方案，所述的耐热新城疫病毒为TS09-C株，其HN基因序列为SEQIDN0:1。
[0012] 按上述方案，所述的三个辅助质粒能够分别表达新城疫病毒的核蛋白、磷蛋白和 大聚合酶蛋白。
[0013] 按上述方案，所述的耐热改造的重组新城疫病毒为rT-HN株，已于2015年8月3 号保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址是中国，武汉，武汉大学，其微生物保 藏号为：CCTCC NO:V201529。
[0014] 按上述方案，所述的重组新城疫病毒rT-HN株在制备防制新城疫的耐热活疫苗方 面的应用。
[0015] 本发明的技术原理在于：
[0016] 1)利用反向遗传操作技术，将耐热TS09-C株和非耐热LaSota株进行NP、P、M、F、 HN和L基因的逐个互换，通过研究基因互换后的重组病毒的耐热特性的改变，最终确认HN 基因是决定新城疫病毒耐热的关键因子，为新城疫病毒耐热改造方法的建立提供了理论支 撑和实践经验；
[0017] 2)将非耐热新城疫病毒的全基因组RNA通过RT-PCR扩增、克隆连接的方式，连接 入低拷贝质粒中，获得非耐热新城疫病毒的转录质粒；
[0018] 3)通过RT-PCR方式扩增获得耐热新城疫病毒的HN基因，通过基因克隆的方法，将 非耐热新城疫病毒的转录质粒中的HN基因替换为耐热新城疫病毒的HN基因，获得改造后 的转录质粒；
[0019] 4)将能够表达T7 RNA聚合酶的痘苗病毒预感染宿主细胞，再将改造后的转录质 粒和三个辅助质粒（分别表达NP、P和L蛋白）进行细胞共转染。首先，痘苗病毒能够在宿 主细胞内表达T7 RNA聚合酶；然后，T7 RNA聚合酶识别转录质粒上的T7启动子序列，并启 动RNA的复制过程，在T7终止子处终止复制，复制出的RNA序列即为嵌合有耐热新城疫病 毒HN基因的非耐热新城疫病毒基因组；嵌合基因组RNA与三个辅助质粒表达出的NP、P和 L蛋白一起构成核蛋白复合体，启动病毒RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成，病毒的各 个组份通过自包装产生具有感染性的重组病毒粒子。该病毒粒子除HN蛋白来源于耐热病 毒外，其余蛋白均来源于非耐热病毒。由于HN基因是新城疫病毒的关键耐热因子，所以以 非耐热新城疫病毒为骨架，嵌合有耐热新城疫病毒HN基因的重组病毒具有了较好的耐热 特性，从而实现了对新城疫病毒的耐热改造；
[0020] 5)由于新城疫病毒不同毒株在基因组结构和生物学特性等方面具有高度相似性， 所以很多研究方法或技术在新城疫病毒不同毒株之间是通用的，如：新城疫病毒的PCR检 测方法可以检测所有新城疫病毒株；新城疫病毒强毒株的反向遗传操作方法同样适用于新 城疫病毒弱毒株；通过修改新城疫病毒LaSota弱毒株的F裂解位点，可将其改造为强毒株， 该方法同样可被用于改造其他新城疫弱毒株。因此，本发明建立的新城疫病毒耐热改造方 法不仅仅适用于LaSota株，也适用于其他所有新城疫病毒株。
[0021] 本发明的有益效果为：
[0022] 1)本研究以新城疫病毒非耐热LaSota株的转录质粒为基础，将LaSota株的转 录质粒中的HN基因替换为耐热新城疫病毒TS09-C株的HN基因，构建出了改造的转录质 粒，并成功获得了新的重组病毒。耐热试验结果表明，新的重组病毒的耐热特性明显高于 LaSota亲本株，证实了用该方法对新城疫病毒进行耐热改造的能力。利用本发明建立的新 城疫病毒耐热改造方法，可构建出一系列新的重组耐热新城疫病毒株，并应用于耐热新城 疫疫苗的制备；
[0023] 2)相对于传统的新城疫疫苗，耐热新城疫疫苗具有如下优点：a)可在4度甚至常 温保存，相比于常规疫苗的冷冻保存，将极大地降低运输、保存成本；b)提高疫苗产品的热 稳定性，延长疫苗的保质期，确保疫苗的使用效果；c)使用方便，可通过拌料、气雾、点眼、 滴鼻等方式免疫。
【附图说明】
[0024] 图1是耐热改造的新城疫病毒rT-HN株的构建示意图。
[0025] 图2是耐热改造的新城疫病毒rT-HN株的生长曲线。
[0026] 图3是耐热改造的新城疫病毒rT-HN株的耐热特性测定结果。
【具体实施方式】
[0027] 以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于 下面的实施例。
[0028] 实施例1
[0029] 新城疫病毒非耐热LaSota株的转录质粒的构建
[0030] 新城疫病毒非耐热LaSota株的转录质粒包含了LaSota株的全基因组序列、T7 RNA聚合酶启动子序列、T7RNA聚合酶终止子序列、丁型肝炎病毒核酶序列和低拷贝质粒 序列等，其主要功能是转录表达并准确切割出LaSota株的全基因组RNA序列。其构建策略 为：首先分片段扩增全基因组序列，共分为A-D4个片段。其中在A片段的上游加入了T7 启动子，D片段的下游加入了丁型肝炎病毒核酶序列和T7终止子。通过普通PCR、融合PCR 和引物自延伸的方法扩增获得4个片段后，通过In-fusionPCR克隆的方式，将4个片段依 次连入低拷贝质粒中，获得转录质粒。
[0031] 1.病毒RNA的提取及RT反应
[0032] 以新城疫病毒LaSota株鸡胚尿囊液为对象，参照试剂盒说明书进行病毒基因组 RNA的提取。将总RNA溶解于17μ1 DEPC 7K，加入1μ1随机引物，75°C 5min，立即冰浴，然 后加入逆转录反应液：5XRT Buffer 5μ1，dNTPs (10mM) 1μ1和M-MLV 1μ 1。42°C 60min， 95°C 5min，获得病毒的基因组cDNA，于-20°C保存，待PCR扩增。
[0033] 2.四个片段的PCR扩增及克隆
[0034] 设计并合成了四对覆盖病毒全基因组的PCR引物。为方便In-fusion克隆，片段 之间留有重叠区域。以病毒cDNA为模板，进行病毒全基因组DNA的PCR扩增。PCR反应体 系由10父81^€6厂]\%(：12(251111)、(1犯1^、上、下游引物（1(^]\1)、了39酶、〇0嫩和水组成。其中 上、下游引物由于扩增片段的不同而不