专利名称：一种施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测引物、检测试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal ampification,LAMP)技术原理而开发的施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)的环介导等温扩增检测引物、检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)是一种海洋弧菌,能够侵染珊瑚，引起珊瑚的细菌性白化。目前，施罗氏弧菌的检测方法主要是传统的微生物分类鉴定方法及依赖于PCR技术的检测方法。传统的微生物分类和鉴定方法主要足以微生物的形态学和生理生化等特性作为判断依据，虽然结果可信度高，但是繁琐且费时。聚合酶链式反应(PCR)灵敏度高，可达98% 100%，但是特异性较差，而且需要PCR扩增仪、凝胶电泳仪等相关贵重设备，不利于基层实验站及现场快速检测。 环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等于2000午报道的一种新型等温核酸扩增方法，该法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件(65°C左右)孵育约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物一白色焦磷酸镁沉淀。通过逆转录酶，还可进行RT-LAMP而完成针对RNA的扩增。该技术具有不需要PCR仪、肉眼可判断结果及反应时间短等优点。扩增结果也可用结合双链DNA的荧光染料SYBRGreen I染色，在紫外灯或日光下通过肉眼进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变。目前LAMP技术已有成功用于其他病原体检测的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测能力强、检测限高、检测时间短、特异性高、对仪器设备要求简单的施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)的环介导等温扩增(LAMP)检测引物、检测试剂盒和检测方法。本发明利用环介导等温扩增技术，以施罗氏弧菌的toxR基因(Genebank登录号为EU727208. I)为靶基因设计特异性引物，进行环介导等温扩增反应，并优化反应条件，在环介导等温扩增检测过程中加入阳性对照质控品和阴性对照质控品，最后通过电泳分析或SYBR Green I荧光染色显色法检测阳性对照质控品的扩增产物、阴性对照质控品的扩增产物和目标样品组的扩增产物，从而判断目标样品是否含有施罗氏弧菌，达到简单、经济、快捷和灵敏的效果，从而实现了本发明的目的。本发明的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3,；(如 SEQ ID NO. I 所示)
后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；(如 SEQ ID NO. 2 所示)前内引物FIP:5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTITGGAGCTGGTGGGAT-3、；(如SEQ IDNO. 3所示)后内引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、；(如 SEQID NO. 4 所示)。本发明的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物，其特征在于，所述的检测引物包括前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3,；(如 SEQ ID NO. I 所示)后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；(如 SEQ ID NO. 2 所示)前内引物FIP:5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTITGGAGCTGGTGGGAT-3、；(如SEQ IDNO. 3所示)后内引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、；(如 SEQIDN0. 4 所示)。所述的阳性对照质控品优选为含有施罗氏弧菌的toxR基因(Genebank登录号为EU727208. I)的质粒DNA，可以通过人工的方法构建，如PCR的方法从施罗氏弧菌的基因组DNA扩增得到toxR基因。所述的阴性对照质控品为不同于施罗氏弧菌的toxR基因(Genebank登录号为EU727208. I)的DNA序列即可。本发明的阳性对照质控品和阴性对照质控品是衡量实验检测结果是否有效的重要标志。在每批实验中，必须引入一个Vibrio shilonii的阳性对照质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阴性反应；同样的，在每批实验中，必须引入一个阴性对照质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阳性结果。本发明的非诊断目的的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；(2)使用上述施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测引物，与环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶和样品菌体的基因组DNA混合形成扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应，以阳性对照质控品和阴性对照质控品分别作为阳性对照和阴性对照；(3)扩增反应完成后，通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断样品扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断样品中是否含有施罗氏弧菌。所述的通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断样品扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断样品中是否含有施罗氏弧菌具体优选为通过电泳分析或SYBR GreenI荧光染色显色法同时检测阳性对照、阴性对照和样品扩增反应体系的扩增产物，根据是否有梯状电泳条带或反应体系的颜色来判断样品中是否有施罗氏弧菌。
SYBR Green I染色若反应混合物变绿，说明含有扩增产物，样品中含有施罗氏弧菌(Vibrio shilonii);反之,反应混合物保持SYBR Green I的橙色不变,则样品中不含有施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)。琼脂糖凝胶电泳检测若样品扩增反应体系的扩增产物的电泳条带呈现特异性的梯状条带，说明反应混合物中含有目的产物，样品中含有施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)；若无梯状条带产生，说明样品中不含有施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)。所述步骤(2)的扩增反应体系优选为8mmol/LMgS04>I. Ommol/L dNTPs、0. 8mol/Lbetaine (甜菜碱)、1. 2 u mol/L 前内引物 FIP、L 2 u mol/L 后内引物 BIP、0. 2 u mol/L 前外引物 F3、0. 2iimol/L 后外引物 B3、4X104U/L Bst DNA 聚合酶、I XThermoPol buffer、适量的模板DNA和水。所述步骤(2)的进行环介导等温扩增反应，其反应参数优选为65°C温育I小时，然后80°C灭活lOmin，最后10°C保存。所述的阳性对照质控品优选为含有施罗氏弧菌的toxR基因(Genebank登录号为EU727208. I)的质粒DNA，可以通过人工的方法构建，如PCR的方法从施罗氏弧菌的基因组DNA扩增得到toxR基因。所述的阴性对照质控品为不同于施罗氏弧菌的toxR基因(Genebank登录号为 EU727208. I)的DNA序列即可。本发明一方面是填补在施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)环介导等温扩增(LAMP)检测技术方面的空白，使施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)检测技术达到国际先进水平，检测能力大幅提高，施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法的检测限高于传统检测方法100 200倍；另一方面本发明的施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法具有仪器设备要求简单(只需要简单结构的恒温箱)、检测时间短(0. 5^1. 0小时)、特异性高(针对靶基因的8/6个区域设计6/4种特异引物)等特点，弥补了经典聚合酶链式反应(PCR)扩增技术对仪器设备要求高(如PCR扩增仪、琼脂凝胶电泳系统等)、技术较为复杂等诸多弊端，具有检测能力强、检测时间短、对仪器设备要求简单的优点，具有广阔的应用前景。
图I是实施例3中的样品、阳性对照质控品和阴性对照质控品的环介导等温扩增反应后的扩增产物的电泳图，其中M marker ;1、2为阳性对照；3、4为阴性对照；5为样品；图2是实施例3中的样品、阳性对照质控品和阴性对照质控品的环介导等温扩增反应后的扩增产物经荧光染色后的结果图，其中1、2、3为阳性对照的三个重复，4、5是样品的两个重复，6、7、8为阴性对照的三个重复。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例I :引物的设计和合成按照环介导等温扩增引物的设计原则，利用Genebank数据库查找施罗氏弧菌中适用环介导等温扩增的基因序列，选定toxR基因(Genebank登录号为EU727208. I)为靶基因，针对施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)的toxR基因设计环介导等温扩增引物。按照LAMP引物设计原则，利用Genebank数据库查找Vibrio shilonii的LAMP基因序列,选取其特异性序列，利用PrimerExplorer IV软件进行进一步分析,针对施罗氏弧菌的祀基因设计一套引物。
由此设计的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测引物为前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3、；后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前内引物 FIP : 5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3、；后内引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。实施例2:核酸提取从37°C摇床培养10小时的施罗氏弧菌菌悬液中吸取菌液lmL，12000r/min离心5min,去上清,在沉淀中加入100 u L无菌水,混勻后，于100°C水浴IOmin,再冰浴2min,12000r/min离心5min，上清液即为施罗氏弧菌基因组DNA，将其作为DNA模板用于环介导等温扩增反应。实施例3 :环介导等温扩增反应样品的环介导等温扩增反应体系，反应体系25 ii L，包括实施例2的DNA模板2 u L, I XThermoPol缓冲液(反应体系终浓度),8mmol/L MgSO4(反应体系终浓度)，I. Ommol/LdNTPs(反应体系终浓度)，0. 8mol/L betaine(反应体系终浓度)，I. 2u mol/L前内引物FIP(反应体系终浓度)，I. 2 u mol/L后内引物BIP (反应体系终浓度)，0. 2 u mol/L前外引物F3(反应体系终浓度)，0. 2 u mol/L后外引物B3 (反应体系终浓度)，IUBstDNA聚合酶，用灭菌去尚子水补齐至25 u L0阳性对照质控品的环介导等温扩增反应体系，反应体系25 UL，包括人工构建的含有施罗氏弧菌toxR基因的质粒DNA2ii L，I X ThermoPol缓冲液(反应体系终浓度)，8mmoI/LMgSO4 (反应体系终浓度)，I. Ommol/L dNTPs (反应体系终浓度),0. 8mol/L betaine(反应体系终浓度)，I. 2 u mol/L前内引物FIP (反应体系终浓度)，I. 2 u mol/L后内引物BIP(反应体系终浓度)，0. 2 ii mol/L前外引物F3 (反应体系终浓度),0. 2 y mol/L后外引物B3(反应体系终浓度)，IU Bst DNA聚合酶，用灭菌去离子水补齐至25 iiL。所述的人工构建的含有施罗氏弧菌toxR基因的质粒DNA的制备方法为以pUC19质粒作为载体，根据Genebank中的基因序列人工合成toxR基因片度作为目的DNA片段，以E. coliDH5a作为感受态细胞。将pUC19质粒以Hind III酶切后，与目的DNA片段在T4连接酶的催化下连接，转化E. coli DH5a感受态细胞，经氨苄青霉素平板筛选出阳性克隆，以碱裂解法提取重组质粒,经酶切电泳和PCR电泳检测质粒构建的正确性。阴性对照质控品的环介导等温扩增反应体系，反应体系25y L，包括阴性对照质控品(以大肠杆菌(E. coli)基因组DNA作为阴性对照质控品)2 u L，IXThermoPol缓冲液(反应体系终浓度)，8mmol/L MgSO4 (反应体系终浓度)，I. Ommol/L dNTPs (反应体系终浓度)，0. 8mol/Lbetaine (反应体系终浓度)，I. 2u mol/L前内引物FIP (反应体系终浓度)，
I.2 ii mol/L后内引物BIP (反应体系终浓度)，0. 2iimol/L前外引物F3 (反应体系终浓度)，0. 2 u mol/L后外引物B3 (反应体系终浓度)，IUBstDNA聚合酶，用灭菌去离子水补齐至25 u L0分别将上述三种环介导等温扩增反应体系混合均匀后，放入恒温水浴箱，设定反应条件65°C,60min ;80°C，lOmin，终止反应;10°C保存。环介导等温扩增反应完成后取5 ii L上述三种扩增反应体系的扩增产物，于2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如图I所示，电泳分析检测结果显示样品的环介导等温扩增反应体系和阳性对照质控品的环介导等温扩增反应体系的电泳条带呈现特异性的梯状条带，而阴性对照质控品的环介导等温扩增反应体系无特异性的条带，说明样品的DNA模板含有施罗氏弧菌的特异性toxR基因，则说明样品中含有施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)。分别取I ii L SYBR Green I荧光染料，与反应完成后的上述三种扩增体系混匀，观察反应体系是否颜色发生变化。如图2所示，SYBR Green I荧光染色显色法检测结果显示样品的环介导等温扩增反应体系和阳性对照质控品的环介导等温扩增反应体系变成绿色，而阴性对照质控品的环介导等温扩增反应体系仍为橙色，说明样品的DNA模板含有施罗氏弧菌的特异性toxR基因，则说明样品中含有施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)。综上所述，利用本发明的检测引物及检测方法，可以简单、经济、快捷、灵敏地检测 出施罗氏弧菌，且检测结果准确可靠。
权利要求
1.一种施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示 前外引物 F3 :5、-CAAACGGITGGCGGTGTC-3、； 后外引物 B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前内引物 FIP 5, -CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3,；后内引物 BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。
2.一种施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物，其特征在于，所述的检测引物包括 前外引物 F3 :5、-CAAACGGITGGCGGTGTC-3、； 后外引物 B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前内引物 FIP 5, -CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3,；后内引物 BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。
3.根据权利要求2所述的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含有施罗氏弧菌的toxR基因的质粒DNA。
4.根据权利要求2所述的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照质控品为不同于施罗氏弧菌的toxR基因的DNA序列。
5.一种非诊断目的的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板； (2)使用权利要求I所述的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测引物，与环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶和样品菌体的基因组DNA混合形成扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应，以阳性对照质控品和阴性对照质控品分别作为阳性对照和阴性对照； (3)扩增反应完成后，通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断样品扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断样品中是否含有施罗氏弧菌。
6.根据权利要求5所述的非诊断目的的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断样品扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断样品中是否含有施罗氏弧菌具体为通过电泳分析或SYBR Green I荧光染色显色法同时检测阳性对照、阴性对照和样品扩增反应体系的扩增产物，根据是否有梯状电泳条带或反应体系的颜色来判断样品中是否有施罗氏弧菌。
7.根据权利要求5所述的非诊断目的的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的扩增反应体系为8mmol/L MgSO4、I. OmmoI/L dNTPs、0. 8mol/Lbetaine、I. 2 u mol/L 前内引物 FIP、I. 2u mol/L 后内引物 BIP、0. 2 u mol/L 前外引物 F3、0. 2iimol/L后外引物B3、4X104U/LBst DNA聚合酶、I X ThermoPol buffer、适量的模板DNA和水。
8.根据权利要求5所述的非诊断目的的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的进行环介导等温扩增反应，其反应参数为65°C温育I小时，然后80°C灭活lOmin，最后10°C保存。
9.根据权利要求5所述的非诊断目的的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含有施罗氏弧菌的toxR基因的质粒DNA。
10.根据权利要求5所述的非诊断目的的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的阴性对照质控品为不同于施罗氏弧菌的toxR基因的DNA序列。
全文摘要
本发明公开了一种施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测引物、检测试剂盒和检测方法。检测引物为前外引物F35'-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3'；后外引物B35'-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3'；前内引物FIP5'-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3'；后内引物BIP5'-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3'。使施罗氏弧菌检测技术达到国际先进水平，检测能力大幅提高，施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测方法的检测限高于传统检测方法100~200倍；另一方面本发明的施罗氏弧菌的环介导等温扩增检测方法具有仪器设备要求简单、检测时间短(0.5~1.0小时)、特异性高(针对靶基因的8/6个区域设计6/4种特异引物)等特点，弥补了经典PCR扩增技术对仪器设备要求高、技术较为复杂等诸多弊端，具有检测能力强、检测时间短、对仪器设备要求简单的优点，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/11GK102719551SQ201210240479
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月11日 优先权日2012年7月11日
发明者任春华, 刘助红, 胡超群, 陈偿, 高磊 申请人:中国科学院南海海洋研究所