大规模生产二(尿苷5'－四磷酸)及其盐的方法

专利名称：大规模生产二(尿苷5'－四磷酸)及其盐的方法
技术领域：
本发明涉及生产治疗性二核苷酸(包括其新的盐)的方法。更具体地说，本发明涉及合成P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)(即二尿苷四磷酸U2P4)的比现有生产方法更好的方法。
背景技术：
P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)是一种具有以下结构的二核苷酸式I

其中X是Na，NH4或H，条件是所有X基团均不是H。
P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的游离酸(当X为氢时)以前已经被描述成尿苷5′-(五氢四磷酸)、P→尿苷5′酯(CAS登记号59985-21-6；C.Vallejo等人，Biochimica etBiophysica Acta 438，305(1976)和H.Coste等人，J.Biol.Chem.262，12096(1987))。
现已描述了不同方法来合成嘌呤二核苷酸如二腺苷四磷酸(A2P4)(E.Rappaport等人，Proc.Natl.Acad.Sci.78，838，(1981)；A.Guranowski等人，Biochemistry，27，2959，(1988)；C.Lobaton等人，Eur.J.Biochem.，50，495，1975；K.Ng和L.Orgel，Nucl.AcidRes.，15，，3573，(1987))。然而，作为嘧啶核苷酸的U2P4并非如此。尽管嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸看上去是类似的，但是用于合成嘌呤核苷酸的方法不一定能用于嘧啶(如尿苷)。
二尿苷四磷酸已经在治疗各种疾病(如慢性阻塞性肺病(COPD))中表现出有利的性质。例如，已经证明，它们有助于清除对象肺部的粘液分泌，这些对象例如是如出于各种原因(包括囊性纤维化、慢性支气管炎、哮喘、支气管扩张、手术后粘液滞留、肺炎、原发性睫状运动障碍)(M.J.Stutts，III等人，美国专利No.5,635,160；PCT国际公开WO 96/40059)需要治疗的哺乳动物(包括人)，并且还有助于预防和治疗卧床患者的肺炎(K.M.Jacobus和H.J.Leighton，美国专利No.5,763,447)。其它治疗用途包括治疗窦炎(PCT国际公开WO 98/03177)、中耳炎(PCT国际公开WO 97/29756)、干眼病、视网膜脱落、鼻管阻塞，通过增加粘膜分泌和上皮表面的水合作用治疗女性不育和由于阴道干燥引起的刺激，以及提高运动员的成绩。
U2P4还可用作哺乳动物诸如(但不局限于)狗、猫和马的兽用产品。
现有技术中只描述了一种生产二尿苷四磷酸的方法。该方法非常耗时，持续5天，并且只产生了少量的二尿苷四磷酸(C.Vallejo等人，Biochimica et Biophysica Acta438，305(1976)，Sillero等人，Eur J Biochem 76，332(1972))。根据该技术，二尿苷四磷酸是通过尿苷5′-单磷酸吗啉酯(monophosphomorpholidate)(0.54毫摩尔)和焦磷酸三乙胺盐(0.35毫摩尔)在无水吡啶介质(10毫升)中反应合成的。30℃下5天后，用蒸馏法从反应混合物中除去吡啶，将残余物重悬于玻璃蒸馏水(glass-destilled water)(8毫升)中，将悬浮液施加到DEAE-纤维素柱(37.5×2.6cm)中，用3.2升线性梯度(0.06-0.25M，pH8.6)的碳酸氢铵分级。按照下列标准鉴定出0.17-0.19M碳酸氢铵之间洗脱出的峰部分是U2P4对碱性磷酸酶不敏感，磷与碱的比例，以及在用磷酸二酯酶I处理后在柠檬酸缓冲液(pH5.0)中电泳分析水解产物(UTP+UMP)。没有给出得率或光谱数据。因此，现有二尿苷四磷酸的合成方法是耗时的，并且只产生了少量仅部分经鉴定的二尿苷四磷酸。本发明侧重于这一医学上有用的化合物的生产方法，该方法更有效，操作更方便，并且可用于大规模生产二尿苷四磷酸及其盐。
发明概述本发明提供了一种合成治疗性二核苷酸P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)(式I)的新方法，并且证明该方法可适用于大量生产。本发明的方法大大减少了合成二尿苷四磷酸所需的时间，较佳的为3天或更少。用这些方法制得的新的P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的铵盐和钠盐稳定、易溶、无毒，且生产时容易处理。四铵盐是较佳的；四钠盐是最佳的。
式I

其中X是Na，NH4或H，条件是并非所有的X基团均为H。
合成式I化合物以及其药学上可接受的盐的方法通常按照下列步骤进行1)将式IIa-d的尿苷或尿苷核苷酸化合物溶解在极性、质子惰性的有机溶剂和疏水性胺中；2)用式IVa-b的磷酸化试剂磷酸化和/或用式IIIa-c的活化试剂活化；和3)用离子交换层析纯化。
本发明的另一方面是治疗各种疾病症状的方法，这些症状包括，但不局限于慢性阻塞性肺病、窦炎、中耳炎、鼻管阻塞、干眼病、视网膜脱落、肺炎和由于阴道干燥引起的女性不育或刺激。
本发明另一方面是一种药物组合物，该组合物包含式I的化合物以及药学上可接受的载体。
发明详述本发明提供了一种合成治疗性二核苷酸P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的新方法，并且证明该方法可适用于大量生产。本发明的方法大大减少了合成二尿苷四磷酸所需的时间，较佳的为3天或更少。用这些方法制得的P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的铵盐和钠盐稳定、易溶、无毒，且生产时容易处理。
本发明还提供了式I化合物式I

其中
X是Na，NH4或H，条件是并非所有的X基团均为H。
P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的钠盐和铵盐有许多优点。与催化磷酸酯水解的二价阳离子(例如Ca2+，Mg2+，Mn2+)的盐相比，钠盐和铵盐提供了优良的长期稳定曲线。P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的四钠盐对肺和眼睛没有刺激性。其它阳离子对肺和眼睛以及其它粘膜上皮可能有刺激性，或不能被人体很好地耐受。与疏水性胺盐(如三和四丁基铵)和类似的盐相比，这些无机钠盐和铵盐提供了优秀的水溶性。高的水溶解度对配制不同浓度的药剂的灵活性来说是一个重要的优点。P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的四铵盐和四钠盐的优点还在于它们易用不采用有机溶剂的水性离子层析来纯化。另外，与一些油状或胶状胺盐相比，这些盐易处理成绒毛、白色固体。
四钠盐是较佳的。
式I化合物可有助于清除对象肺部的粘液分泌，这些对象例如是如出于各种原因(包括囊性纤维化、慢性支气管炎、哮喘、支气管扩张、手术后粘液滞留、肺炎、原发性睫状运动障碍)(M.J.Stutts，III等人，美国专利No.5,635,160；PCT国际公开WO 96/40059)需要治疗的哺乳动物(包括人)，并且还有助于预防和治疗卧床患者的肺炎(K.M.Jacobus和H.J.Leighton，美国专利No.5,763,447)。其它治疗用途包括治疗窦炎(PCT国际公开WO 98/03177)、中耳炎(PCT国际公开WO 97/29756)、干眼病、视网膜脱落、鼻管阻塞，通过增加粘膜分泌和上皮表面的水合作用治疗由于阴道干燥引起的女性不育和刺激，以及提高运动员的成绩。
式I化合物可以含有常规无毒、药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂的剂量单位配方口服、外用、肠胃外、吸入或喷雾、手术内、直肠内或鞘内给药。本文所用的术语“外用”包括药膏、凝胶、乳膏、油膏、栓剂、阴道栓剂或滴鼻、滴耳或滴眼。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或灌输。另外，还提供了一种包含通式I化合物以及药学上可接受的载体的药物配方。一种或多种通式I化合物可以与一种或多种无毒的药学上可接受的载体或稀释剂或佐剂组合，如果需要，还可以有其它活性组分组合。一种这样的载体是糖，在用于肺或气管输递时，化合物可通过玻璃化(glassification)直接掺入基质中或简单地与载体(如乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖)或其它可接受的赋形剂混合。
通式I的一种或多种化合物可以分开或一起给药，或是和粘液溶解物如DNA酶(Pulmozyme)或乙酰半胱氨酸、抗生素(包括但不局限于吸入用Tobramycin)、非类固醇抗炎剂、抗病毒剂、疫苗、减充血剂和皮质类固醇分开或一起给药。
含有通式I的化合物的药物组合物可以是适用于口服的形式，例如是片剂、胶囊剂、锭剂、水性或油性悬液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软的胶囊、或糖浆或酏剂。打算口服使用的组合物可以按照生产药物组合物领域的任何已知方法来制备，这些组合物可含有一种或多种选自增甜剂、调味剂、着色剂和防腐剂的试剂，以便提供药学上美观适口的制剂。片剂含有活性组分，该活性组分与适用于生产片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合。这些赋形剂例如可以是惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和粉碎剂如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以没有包层的，或可按已知技术包层以延迟在肠胃道中的分解和吸收，从而在更长的时间内提供缓释的作用。例如，可采用延长时间的材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服用配方还可以为硬的明胶胶囊，其中活性组分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合；或是软的明胶胶囊，其中活性组分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
水性悬浮液含有的活性物质与适用于生产水性悬浮液的赋形剂相混合。这些赋形剂是悬浮剂，例如是羧甲基纤维素钠、甲基纤维素和海藻酸钠。分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂或丙炔化氧和脂肪酸的缩合产物、或环氧乙烷和长链脂族醇的缩合产物、或环氧乙烷和由脂肪酸与己糖醇衍生的偏酯缩合产物、或环氧乙烷和由脂肪酸与己糖醇脱水物衍生的偏酯的缩合产物。该领域技术人员会认识到，上文的总体描述包括了许多具体的赋形剂和润湿剂。水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂、以及一种或多种增甜剂(例如蔗糖或糖精)。
适用于通过加入水来制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒提供可与分散剂、润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的活性组分。上文已经列举了合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂。其中还可存在其它赋形剂，例如增甜剂、调味剂和着色剂。
式I化合物可在无菌介质中通过肠胃外给药。根据所用的载体和浓度，药物可以悬浮或溶解在载体中。有利的是，诸如局部麻醉药、防腐剂和缓冲剂的佐剂可以溶解在该载体中。无菌的可注射制剂可以是在无毒性、肠胃外用可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射溶液或悬浮液。可采用的可接受的载体和溶剂有无菌水、盐溶液或Ringer溶液。通式I的化合物还可以适用于耳、直肠或阴道给药的栓剂形式给药。这些组合物可通过混合药物与合适的无刺激性赋形剂来制得，这种赋形剂在常温下呈固态，但在体温下呈液态，因此融化并释放出药物。这些材料是可可豆油和聚乙二醇。
式I化合物的溶液通过手术内装置在身体任何部位给药。
约为1至400毫克(较佳的在10-300毫克范围内，最佳的在25-250毫克范围内)的单剂水平可用来治疗上述呼吸道疾病。约为0.0005至5毫克(较佳的在0.001-3毫克范围内，最佳的在0.025-1毫克范围内)的单剂水平可用来治疗上述眼科疾病。根据受治疗的宿主和特定的给药方式，可与载体材料混合产生单剂的活性组分的量将有所不同。然而，应当理解，对于任何特定患者来说，具体的剂量水平将取决于各种因素，这些因素包括采用的具体化合物的活性、患者体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、和排泌率、药物的组合以及受治疗特定疾病的严重程度。
下述合成方法包括几种合成策略来生产P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)。总的来说，所有方法都用式IIa-d的尿苷或尿苷核苷酸化合物作为原料，溶解在极性、质子惰性有机溶剂(如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷、N-甲基吡咯烷酮、磷酸三甲酯)和疏水性胺(例如三乙胺、三丁基胺、三辛基胺、2，4，6-可力丁、四丁基铵、三烷基胺和四烷基胺、杂环胺)中。产物这样来获得分别用式IV的磷酸化试剂(例如磷酰氯、焦磷酸、焦磷酰氯)磷酸化或用式III的活化剂(如羰基二咪唑、烷基或芳基碳化二亚胺、氯化磷酸烷基或芳基酯(phosphochloridate))激活磷酸基团，然后用本领域技术人员熟知的各种方法进行纯化，这些方法包括但不局限于离子层析(如DEAE Sephadex，DEAE纤维素、Dowex 50，阴离子和阳离子交换树脂)。
下式IIa-d分别示出了嘧啶β-D-呋喃核糖原料尿苷、尿苷5′-单磷酸(UMP)、尿苷5′-二磷酸(UDP)和尿苷5′-三磷酸(UTP)的游离酸。这些材料可以各种盐形式从商业上大量购得。
式IIa尿苷

式IIbUMP

及其盐；式IIcUDP

及其盐；式IIdUTP

及其盐。
下列通式IIIa-c分别示出了活化剂碳化二亚胺、激活的羰基、和激活的磷。
式IIIa碳化二亚胺

其中R1和R2是C1-C8烷基或环烷基、被任意取代(如羟基和氨基)的C1-C8烷基或环烷基；芳基或被任意取代(如羟基和氨基)的芳基。较佳的式IIIa化合物是二环己基碳化二亚胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐。
式IIIb激活的羰基

其中X是咪唑、四唑和/或卤素。较佳的式IIIb化合物是羰基二咪唑或羰基二三唑。
式IIIc激活的磷

其中R1和R2是C1-C8烷基或环烷基、任意取代(如羟基和氨基)的C1-C8烷基、烷氧基或环烷基；芳基、烷氧基或任意取代(如羟基和氨基)的芳基或烷氧基和/或卤素；和X是卤素。较佳的式IIIc化合物是氯化磷酸二苯酯(diphenylphosphorochloridate)、二氯磷酸苯酯(phenyl phosphorodichloridate)、苯基膦酰二氯和二苯基次膦酰氯。
下面的通式IVa-b示出了单磷酸化和二磷酸化试剂。
式IVa一磷酸化试剂

其中X是卤素。较佳的式IVa化合物是磷酰氯。
式IVb二磷酸化试剂

其中X是氧、羟基、或卤素，及其盐。较佳的式IVb化合物是焦磷酰氯和焦磷酸。
本领域技术人员应理解，本发明并不局限于下列实施例，下列实施例中的步骤可以变化。
实施例1用尿苷5′-二磷酸生产二尿苷四磷酸四钠盐的方法将尿苷5′-二磷酸二钠盐(Yamasa，Choshi，Japan；600克)溶解在5.4升去离子水中。使溶液通过Dowex 50Wx4 H+(Dow Chemical)柱。合并含有尿苷5′二磷酸的级分，用三丁胺(Aldrich，St.Louis；300毫升)中和。在55-60℃的浴温下用旋转式蒸发器将中和的级分浓缩成油。将油溶解在干的二甲基甲酰胺(Aldrich，3升)中，然后用旋转式蒸发器(55-60℃浴温)浓缩成油干燥。重复该步骤两次。将油再次溶解在3升二甲基甲酰胺中，加入1，1-羰基二咪唑(Aldrich；100克)。溶液于50℃加热2.5小时。加入附加量的活化剂(33克)，再继续加热2.5小时。在旋转式蒸发器(55-60℃的浴温)上再次将溶液浓缩成油。将所得油溶解在去离子水中至电导率与0.2M碳酸氢铵相等。然后将溶液上样到Sephadex DEAE-A25(Pharmacia，Upsala，Sweden；预先在1.0M碳酸氢铵中溶胀，并用2倍柱体积的去离子水洗涤)柱中。用下列次序的溶液洗脱柱60升0.25M碳酸氢铵，120升0.275M碳酸氢铵，40升0.30M碳酸氢铵和40升0.35M碳酸氢铵。合并具有足量纯二尿苷四磷酸(经HPLC分析确定)的级分并在旋转式蒸发器(55-60℃的浴温)上浓缩。将所得残余物溶解在1.5升去离子水中，在旋转式蒸发器上浓缩。重复该步骤15次或直至除去过量碳酸氢盐缓冲液。将所得油溶解在足量去离子水中形成约10％的溶液，将溶液加入Dowex 50Wx4 Na+(Dow)柱中用去离子水洗脱。合并含有U2P4的级分并浓缩成约10-15％的溶液，冻干获得白色固体状U2P4四钠盐(150克，得率以尿苷5′-二磷酸计约为25％)。
P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐的结构阐述由于文献中缺乏足够的非腺苷酸二核苷酸的光谱数据，用现代分析技术对P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐进行全面的结构描述。用质谱法测得分子量为878[m/z 855，(M-Na+)-]，证实分子式为C18H22N4O23P4·4Na。测得C18H22N4O23P4·3Na[(M-Na+)-计算值854.9318]的确切质量为854.9268。测得的质量与理论质量差别5.0毫质量(milimass)单位(5.9ppm)，置信水平为99.7％。Karl Fisher湿度分析的值为1.73％水，从元素分析进一步确认分子式Na计算值为10.50，测定值为10.81％；C∶P比例计算值为1.74，测定值为1.80(根据分子式C18H22N4O23P4·4.2Na·1.1H2O(FW＝902.4克/摩尔))。红外光谱显示在3422cm-1有宽的信号，在1702cm-1有信号，表明存在羟基(O-H段)和羰基(O＝H段)官能团。另外，在1265cm-1处发现磷酸P＝O段。水中的UV光谱显示λmax为262nm，摩尔吸收率(ε)为17,004。用偏振法测得25℃时的比旋(c＝1，H2O)为-9.56°。
NMR光谱是1H NMR(D2O，TMS)δ4.11(m，2H)，4.14(m，1H)，4.25(m，1H)，4.27(m，1H)，5.84(d，J＝8.1Hz，1H)，5.86(d，J＝5.4Hz，1H)，7.81(d，J＝8.1Hz)；13C NMR(D2O，TMS)δ65.1(d，J＝5.5Hz)，69.7，73.5，83.4(d，J＝9.4Hz)，88.1，102.8，141.5，152.9，167.5；31PNMR(D2O，H3PO4std)δ-22，32(m)，-10.75(m)。1H偶合31P光谱显示由于1H偶合诱导δ-10.75处有多重峰增宽。因此确认该多重峰是Pα。在-22.23ppm处的多重峰上没有1H偶合效果，默认为Pβ。观察到H6对H2·和H3·糖质子有核极化效应(NOE)。由于H5不可能表现出对糖质子有核极化效应，因此确认是H6。另外确认了N1取代，因为对于N3取代结构不可能有嘧啶-糖核极化效应。
另外进行2维NMR试验以确认连通性。HMQC显示H5对C5和H6对C6有连通性，从而确认了C5和C6。观察到H5对H6有COSY和NOE连通性，确认了H5。观察到H6对C1′、C6对H1′、H1′对C2、H6对C2有HMBC 3-键连通性。因此这些数据确认了H1、C2和N1取代。H1′与H2′的COSY连通性确认了H2′，H1′与C1′以及H2′与C2′的HMQC连通性确认了C1′和C2′。另外，HMBC显示了从H5到C4的2-键J连通性，确认了C4。峰裂数(mult)＝1.5的13C DEPT谱显示δ65.1处的碳相对于所有其它碳是倒置的。这一发现确认C5′是亚甲基。31P与δ65.1和83.4处的碳偶合确认了C5′和C4′，因为C4′是仅有的偶合的亚甲基。另外，HMQC显示出C5′到H5′、C4′到H4′的连通性，确认了H4′和H5′。观察到H1′对H4′、H6对H2′、H6对H3′有核极化效应，从而确认了β反构体糖构型。
总之，从商业上可获得的原料出发用总共5小时的反应时间合成了规模为150克的P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐，得率为25％。用离子交换层析有效地纯化粗品，用质谱法、NMR和其它分析技术明确地证实了反应产物的结构。
实施例2用尿苷5′-单磷酸生产二尿苷四磷酸四钠盐的方法将尿苷5′-单磷酸(Sigma，Milwaukee，3.0克，9.26毫摩尔)溶解在干的DMF(10毫升)和三丁胺(Aldrich，2毫升)中。40℃真空蒸发溶液成油。将残余物溶解在干的DMF(Aldrich，8毫升)中形成溶液。在该溶液中加入羰基二咪唑(Aldrich，1.65克，10.18毫摩尔)。反应溶液于50℃加热1小时。将在5毫升DMF和2毫升三丁胺中制成无水三丁铵盐(如下文实施例3所述制备)的尿苷5′-三磷酸(Yamasa，5.60克，10.18毫摩尔)加入反应溶液中。使混合物于50℃搅拌3天，然后真空蒸发溶液成油，重新溶解在5毫升水中，用柱层析(300×50mm，Sephadex DEAE-A25，40-120μ，Aldrich，预先在1.0M碳酸氢铵中溶胀，用2倍柱体积的去离子水洗涤(H2O→0.3M碳酸氢铵梯度))纯化。35℃真空浓缩纯级分，加入水重新蒸发5次，获得白色固体状二尿苷四磷酸四铵盐(2.37克，得率30％)用相同的滞留时间作为标准，经HPLC测定为纯度为92.11％。另外，用FABMS分析四铵盐，质量为788.9875[C18H25N4P23P4(M-H+)-788.9860]，确认游离酸的母式为C18H26N4O23P4。
实施例3A
用尿苷5′-三磷酸(UTP)生产二尿苷四磷酸的方法使尿苷5′-三磷酸(UTP)三钠盐(ProBioSint，Varse，Italy；5.86克，0.01摩尔)的5毫升水溶液通过三丁胺形式的BioRad AG-MP 50(Aldrich)强阳离子交换树脂柱(50毫升床体积)，用约300毫升蒸馏水洗脱。在该溶液中加入三丁胺(Aldrich，5毫升)，振荡悬浮液至水性级分的pH升高至8。分层，将水溶液蒸发至较小的体积，然后冻干过夜。将残余物溶解在干的二甲基甲酰胺(Aldrich；20毫升)中，于0.1mmHg下蒸发溶剂。用无水丙酮将干燥的三丁胺补加至100毫升，获得储液(UTP中0.1M)。在等份前述UTP溶液(10毫升，1.0毫摩尔)中加入二环己基碳化二亚胺，室温下搅拌溶液30分钟。将混合物加入尿苷5′-单磷酸的三乙胺盐(2.0毫摩尔，通过将0.5毫升三乙胺加入尿苷5′-单磷酸(UMP)(Sigma；0.648克，DMF配)中然后蒸干制得)中。然后将该悬浮液蒸干，残余物用干的DMF补至5.0毫升，40℃下放置24小时。用微量制备离子交换层析(Hamilton PRP X-100柱)分离反应混合物，用0-1.0M碳酸氢铵、5毫升/分钟、30分钟的梯度洗脱。在21和23分钟之间洗脱出二核苷酸四磷酸；比较其在λmax263nm下的紫外吸收与P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)标准溶液的紫外吸收，定量测定产物(以UTP计，得率为76.7％)。
实施例3B用尿苷5′-三磷酸(UTP)和过量活化剂生产二尿苷四磷酸的方法通过用大量过量DCC(0.1克，5毫摩尔)活化三丁胺盐(0.1毫摩尔)可提高UTP至P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的转化率；在这种情况下，通过过滤除去沉积的二环己基脲，在用三丁胺UMP(0.2毫摩尔)处理前用10毫升醚萃取反应混合物，将残余物溶解在干的DMF中。在层析分离反应混合物并定量测定紫外吸收(如上述实施例3A所述)后，尿苷四磷酸产物占混合物中尿苷酸物质的50.7％(对应于95.9％的UTP转化)。
实施例4A用羰基二咪唑活化的尿苷5′-单磷酸生产二尿苷四磷酸的方法将尿苷5′-单磷酸(UMP)(0.324克，1.0毫摩尔)溶解在5毫升干的DMF和三丁胺(237μL，1毫摩尔)的混合物中，蒸干溶液，然后用DMF再进行两次，产生无水三丁胺盐。将残余物溶解在5毫升DMF中，加入羰基二咪唑(CDI)(0.81克，5毫摩尔)。静置溶液3小时，然后加入甲醇(324μL，8毫摩尔)以破坏过量的CDI。静置该溶液1小时。加入焦磷酸三丁胺(Sigma，0.228克，0.5毫摩尔)，在室温下氮气下搅拌该悬浮液。3小时后用水淬灭反应，使混合物进行HPLC(如上文实施例3A所述)。定量测定263nm下的吸收值测定P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的得率为9.3％。
实施例4B用经氯化磷酸二苯酯活化的尿苷5′-单磷酸生产二尿苷四磷酸的方法将UMP的无水三丁胺盐(1.0毫摩尔)(基本上如上所述制备)溶解在干的二噁烷(5毫升)和DMF(1毫升)混合物中。加入氯化磷酸二苯酯(0.3毫升)和三丁胺(0.3毫升)，使溶液在室温下静置3小时。蒸发溶剂，用约10毫升的乙醚振摇残余物，然后4℃静置30分钟。倾析除去乙醚，将残余物溶解在焦磷酸三丁胺(0.228克，0.5毫摩尔)的3毫升DMF溶液中。溶液置于室温下氮气下。反应3小时后，用水淬灭反应，如上文实施例3A所述对混合物进行HPLC。根据263nm下的吸收值定量测得P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的得率为9.6％。
实施例5用尿苷、磷酰氯和焦磷酸生产二尿苷四磷酸的方法将尿苷(Aldrich，0.244克，1毫摩尔)溶解在磷酸三甲酯(Aldrich，5毫升)中并加入三丁胺(466μL，2毫摩尔)。0℃下边搅拌溶液边加入磷酰氯(0.153克(93.2μL)，1毫摩尔)，0℃搅拌所得悬浮液3小时。加入焦磷酸三丁胺(0.288克)，室温下搅拌悬浮液3小时。用1.0M三乙胺碳酸氢盐水溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取混合物，以除去磷酸三甲酯。如实施例3A所述，对水溶液进行HPLC。通过定量测定后者在263nm下的吸收值测得尿苷到P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的转化率为6.83％。
实施例6用尿苷5′单磷酸和焦磷酰氯生产二尿苷四磷酸的方法将尿苷5′-单磷酸(UMP)(64.8毫克，0.2毫摩尔)溶解在1毫升干的吡啶中，边加入焦磷酰氯(13.9μL(25毫克)，0.1毫摩尔)边在冰上搅拌。溶液立即变混浊，然后形成大量半晶状白色沉淀，沉淀在1-2分钟内变为胶状团块。将混合物于室温下保藏过夜，用水淬灭，并如实施例3A所述进行HPLC。通过定量测定263nm下的吸收值测定P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)的产量为15.8％。获得了大量P1，P3-二(尿苷5′-四磷酸)(25.4％)作为主要的副产物。
实施例7P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐在水中的稳定性和溶解度通过将部分固体加入已知体积的去离子水中至溶液变混浊，来测定P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐的溶解度。因此测得其在水中的最大溶解度约为900毫克/毫升。固体或水溶液在低温(5℃)或较高温度(40℃)下的稳定性研究表明在三个月内发生分解量少于1.5％(经HPLC分析测得)。因此确定P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐具有优异的溶解度和稳定曲线，适用于药物用途。
实施例8P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐在动物体内的毒性已经在一组遗传毒理学试验中评价了P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐的非临床性毒理学曲线，这些试验包括细菌反突变(reverse mutation)试验、体内哺乳动物细胞遗传测试、体外哺乳动物细胞基因突变测试以及小鼠体内微核细胞遗传试验。在家兔体内的研究检查了6周内每日给予多剂后的局部眼耐受性和亚慢性眼毒性。另外，还在大鼠和狗体内两次单剂急性吸入毒性研究，以及在狗体内一次单剂急性静脉内毒性研究中对P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐进行测试。
这些研究的结果表明，P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐在这组遗传毒性试验中没有遗传毒性。在眼毒性研究中没有发现相反的结果。在单剂吸入(大鼠、狗)和静脉(狗)毒性研究中发现有较低程度的急性毒性。因此，确定P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐具有优异的毒理学曲线，对于人体给予有很宽的安全限度。
实施例9P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐在正常人志愿者中的安全性和效率在第I期、双盲、以安慰剂为对照、剂量逐渐增加的安全性和耐受性研究中，在75位正常健康男性志愿者体内评价P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐。40位不吸烟者和35位吸烟者分为5个给药组，每组16位志愿者，其中12位接受P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐(20-400毫克)的单剂气雾剂，4位接受安慰剂(普通盐水)。没有报道有严重的不良反应。盐水组或活性药物组中的FEV1、FVC、MMEF、临床实验室、12-导程(lead)ECG、或尿分析结果没有显著改变。在吸烟者中，P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐使给药5分钟内咳出的痰重量以剂量依赖型方式增加2-7倍，并且在收集痰液的后一小时内持续刺激咳出痰液。还发现P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐具有诱导不吸烟者咳出痰液的效果。总之，与安慰剂相比，P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐在正常男性对象体内是安全的，耐受性很好，并能有效地刺激痰液咳出。
权利要求
1.一种具有式I的化合物式I
其中X选自Na，NH4或H，条件是所有X基团都不是H。
2.P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四钠盐。
3.P1，P4-二(尿苷5′-四磷酸)四铵盐。
4.一种合成式I化合物及其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括a)将式IIa-d的尿苷或尿苷核苷酸化合物溶解在极性、质子惰性的有机溶剂和疏水性胺中；b)用式IVa-b的磷酸化试剂磷酸化和/或用式IIIa-c的活化试剂活化；和c)层析纯化式I化合物及其药学上可接受的盐；式I
其中X选自Na，NH4或H，条件是所有X基团都不是H；式IIa尿苷
式IIbUMP
及其盐；式IIcUDP
及其盐；式IIdUTP
及其盐；式IIIa碳化二亚胺
其中R1和R2是独立选自C1-C8烷基、C1-C8环烷基、被羟基和氨基任意取代的C1-C8烷基和C1-C8环烷基、芳基或被羟基和氨基任意取代的芳基；式IIIb激活的羰基
其中X独立选自咪唑、四唑或卤素；式IIIc活化的磷
其中X是卤素，R1和R2各自独立选自C1-C8烷基、C1-C8环烷基、被羟基和氨基任意取代的C1-C8烷基、被羟基和氨基任意取代的C1-C8烷氧基、被羟基和氨基任意取代的C1-C8环烷基、芳基、烷氧基、被羟基或氨基任意取代的芳基、被羟基和氨基任意取代的烷氧基、或卤素；式IVa一磷酸化试剂
其中X是卤素；式IVb二磷酸化试剂
其中X选自氧、羟基、卤素，及其盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其中式IIIa化合物选自二环己基碳化二亚胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐。
6.根据权利要求4所述的方法，其中式IIIb化合物选自羰基二咪唑或羰基二三唑。
7.根据权利要求4所述的方法，其中式IIIc化合物选自氯化磷酸二苯酯、二氯磷酸苯酯、苯基膦酰二氯和二苯基次膦酰氯。
8.根据权利要求4所述的方法，其中式IVa化合物是磷酰氯。
9.根据权利要求4所述的方法，其中式IVb化合物选自焦磷酰氯和焦磷酸。
10.一种制备权利要求1所述的式I化合物及其药学上可接受的盐的方法，其特征在于所述方法包括将权利要求4所述的式IIc化合物溶解在极性、质子惰性有机溶剂和疏水性胺中，用权利要求4所述的式IIIa-c活化剂处理，随后用层析纯化。
11.一种制备权利要求1所述的式I化合物及其药学上可接受的盐的方法，其特征在于所述方法包括将权利要求4所述的式IIb化合物溶解在极性、质子惰性有机溶剂和疏水性胺中，用权利要求4所述的式IIIa-c活化剂处理，然后和权利要求4所述的式IId化合物反应，随后层析纯化。
12.一种制备权利要求1所述的式I化合物及其药学上可接受的盐的方法，其特征在于所述方法包括将权利要求4所述的式IId化合物溶解在极性、质子惰性有机溶剂和疏水性胺中，用等摩尔量的权利要求4所述的式IIIa-c活化剂处理，然后和权利要求4所述的式IId化合物反应，随后层析纯化。
13.权利要求12所述的方法，其中采用了过量的活化剂。
14.一种制备权利要求1所述的式I化合物及其药学上可接受的盐的方法，其特征在于所述方法包括将权利要求4所述的式IIb化合物溶解在极性、质子惰性有机溶剂和疏水性胺中，用权利要求4所述的式IIIa-c活化剂处理，然后和权利要求4所述的式IVb化合物反应，随后层析纯化。
15.一种制备权利要求1所述的式I化合物及其药学上可接受的盐的方法，其特征在于所述方法包括将权利要求4所述的式IIa化合物溶解在极性、质子惰性有机溶剂和疏水性胺中，用权利要求4所述的式IVa-b磷酸化剂处理，随后层析纯化。
16.一种制备权利要求1所述的式I化合物及其药学上可接受的盐的方法，其特征在于所述方法包括将权利要求4所述的式IIb化合物溶解在极性、质子惰性有机溶剂和疏水性胺中，用权利要求4所述的式IVb磷酸化剂处理，随后层析纯化。
17.一种治疗哺乳动物体内慢性阻塞性肺疾病的方法，该方法是给予治疗慢性阻塞性肺疾病有效量的权利要求1所述的式I化合物。
18.一种治疗哺乳动物体内窦炎、中耳炎或鼻管阻塞的方法，该方法是给予清除粘液分泌有效量的权利要求1所述的式I化合物。
19.一种治疗哺乳动物体内干眼病的方法，该方法是给予治疗干眼病有效量的权利要求1所述的式I化合物。
20.一种治疗哺乳动物体内视网膜脱落的方法，该方法是给予治疗视网膜脱落有效量的权利要求1所述的式I化合物。
21.一种治疗或预防哺乳动物体内肺炎的方法，该方法是给予预防治疗肺炎有效量的权利要求1所述的式I化合物。
22.一种促进哺乳动物体内诱导产生痰液的方法，该方法是给予促进诱生痰液有效量的权利要求1所述的式I化合物。
23.一种促进哺乳动物吐痰的方法，该方法是给予促进吐痰有效量的权利要求1所述的式I化合物。
24.一种治疗由于阴道干燥引起的女性不育或阴道刺激的方法，该方法是给予治疗阴道干燥有效量的权利要求1所述的式I化合物。
25.一种药物组合物，它包含权利要求1所述的式I化合物以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了合成治疗性二核苷酸P
文档编号A61P27/00GK1265114SQ98806199
公开日2000年8月30日 申请日期1998年7月24日 优先权日1997年7月25日
发明者B·R·耶扎, W·彭德格斯特 申请人:印斯拜尔药品股份有限公司