耐氧夏普氏菌及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘草化icorice roots)是一味古老的中药材，具有保肝、枯疲止咳、清热解毒、补 脾益气、抗菌消炎、抗癌、降糖、免疫调节、神经保护等多种功效，临床上主要用于治疗呼吸 系统、消化系统和免疫系统等疾病。甘草中的黄酬和酪类是甘草中的标志性化合物，甘草 巧（Liquiritin)是甘草中含量较高的黄酬成分之一，有研究表明，甘草巧在酸性条件下或 在人肠道微生物菌群产生的葡萄糖巧酶作用下，可被水解为甘草素（Liquiritigenin，简称 LG)。LG是Akt蛋白激酶抑制剂，也是有较高选择性的雌激素受体激动剂，对肝细胞等具有 保护作用。甘草不论是做成中成药还是作为汤药熬服，最终都要经口服进入体内，甘草中的 众多药理活性成分具有被寄居在胃肠道的微生物菌群降解为不同代谢产物的可能性。
[0003] 1998年，Li等（化化arffl历/77，1998，12:1251-1257)在人尿液检测到了甘草 代谢产物达维英速巧元（Davidigenin，简称DG)，而DG在天然甘草提取物中未能检测到，故 推测人体肠道微生物菌群可将LG转化为DG。此后，Zuo等的研究结果进一步证实LG可被 人肠道微生物菌群代谢为DG(公如7化ar曲历/77，2002，25:558-563)。由于DG资源匿乏， 有关其生理活性方面研究报道较少，但从目前已有研究结果看，DG除具有与LG相似的生理 功能，如止咳、降糖等外，还表现出不同于LG的一些生理功能，如抑制人肺细胞纤维化，抗 过敏和抗疫李等。随着DG生理功能研究的不断深入，该意味着DG今后极有可能开发为不同 于目前甘草药效的其他新药。此外，体外抗氧化试验结果表明，产物达维英速巧元对二苯代 苦味酷基自由基（DPPH)的体外清除率极显著高于相同浓度的底物甘草素(药学学报，2012， 47(5):664-669)。
[0004] 目前虽在某些植物中，如化妃/77歴施知出/巧'?ancA, 有分离 得到天然DG的报道，但天然DG在植物细胞中的含量极低，试图从天然植物中大规模化提取 DG几乎是不可能的。有关DG的化学合成方法已有报道，但大多是通过在无氧条件下提供昂 贵的化学催化剂钮经化学加氨来完成（化〇做?^/。/-(9邸?化评，1997,11:125-231)，所需成 本高，且易造成环境污染。
[0005]
【主权项】
1. 一种耐氧夏普氏菌（sAaTjDea sp. ) Aerot〇-AUH_JLD21，保藏号为 CGMCC No. 9976。
2. 如权利要求1所述的耐氧夏普氏菌Aer〇t〇-AUH-JLD21在达维荚莲苷元有氧合成中 的应用。
3. 根据权利要求2所述的耐氧夏普氏菌Aer〇t〇-AUH-JLD21在达维荚莲苷元有氧合成 中的应用，其特征在于包括以下步骤： (1) 耐氧夏普氏菌Aerot〇-AUH-JLD21的培养 将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aer〇t〇-AUH-JLD21融化并按10~15%接种量接种到 添加0. 05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，在37°C恒温培养箱内活化培养24小时； 再以10%接种量将上述活化后的耐氧夏普氏菌Aer 〇t〇-AUH-JLD21转接到新鲜的BHI液体 培养基中，培养4~8小时作为种子液； (2) 底物甘草素与耐氧夏普氏菌Aer〇t〇-AUH-JLD21共培养 将上述耐氧夏普氏菌Aer〇t〇-AUH-JLD21的种子液转接到发酵培养基中，同时加入甘 草素进行共培养； (3) 代谢产物达维荚莲苷元的分离纯化。
4. 根据权利要求3所述的耐氧夏普氏菌Aerot〇-AUH-JLD21在达维荚莲苷元有氧合成 中的应用，其特征在于所述步骤（2)中将耐氧夏普氏菌Aerot〇-AUH-JLD21的种子液按10~ 15%接种量转接到发酵培养基中，同时加入母液浓度为40~60毫摩尔/升的底物甘草素， 使甘草素在培养基中的终浓度为1. 6~2. 0晕摩尔/升，在37°C恒温培养箱内培养2~3 天；所述发酵培养基为添加5. 93克/升NaH2POJP 22. 21克/升Na 2即04的BHI液体培养 基，pH值为7.0~7. 3。
5. 根据权利要求3所述的耐氧夏普氏菌Aer〇t〇-AUH-JLD21在达维荚莲苷元有氧合成 中的应用，其特征在于所述步骤（2)中将耐氧夏普氏菌Aerot〇-AUH-JLD21的种子液按15~ 20%接种量转接到发酵培养基中，同时加入母液浓度为40~60毫摩尔/升的底物甘草素， 使甘草素在培养基中的终浓度为1. 2~1. 4毫摩尔/升，在37°C恒温培养箱内培养2~3 天；所述发酵培养基的配方为7. 5克/升葡萄糖、10克/升蛋白胨、1. 2克/升L-半胱氨 酸、10克/升氯化钠，调节pH值为7. 0,再向其中加入3. 59克/升NaH2P04, 27 . 58克/升 Na2HP04〇
6. 根据权利要求3所述的耐氧夏普氏菌Aerot〇-AUH-JLD21在达维荚莲苷元有氧合成 中的应用，其特征在于所述步骤（3)中分离纯化方法为：用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液2 次，将萃取液合并后过滤、蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢 产物达维荚莲苷元。
【专利摘要】本发明公开了一种耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21，保藏号为CGMCC No.9976及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用。属于微生物技术领域。应用包括以下步骤：（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养；（2）底物甘草素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养：将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液转接到发酵培养基中，同时加入甘草素进行共培养；（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化。本发明耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21能够在有空气氧条件下将甘草素高效转化为达维荚蒾苷元，转化性能稳定，且方法简单，生产成本低，解决了达维荚蒾苷元难于在有空气氧条件下规模化生产的难题。CGMCC No.997620141117
【IPC分类】C12P7-22, C12N1-20, C12R1-01
【公开号】CN104673721
【申请号】CN201510094048
【发明人】王秀伶, 杨露, 彭文涛, 王铭
【申请人】河北农业大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月3日