高效液相色谱质谱联用检测dna氧化与dna甲基化的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法，包括以下步骤：水解DNA，将DNA水解产物用HPLC-ESI-MS/MS测定5-甲基胞嘧啶和8-羟基脱氧鸟苷的含量；高效液相色谱：流动相A：体积比0.01～0.3%的甲酸/甲醇；流动相B：体积比0.01～0.3%的甲酸水溶液；在流速为0.2～0.4ml/min、柱温15～40℃条件下经液相色谱柱分离；电喷雾质谱：以电喷雾离子源离子化，在正极模式下通过多反应监测系统进行质谱分析。本发明的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法可以同时检测DNA样品中的8-OHdG和5-mdC含量。
【专利说明】高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学领域，更具体的说，涉及一种高效液相色谱质谱联用检测DNA 氧化与DNA甲基化的方法。
【背景技术】
[0002] 在需氧生物体正常的生理过程，代谢过程和其他的生物化学反应过程中会形成一 系列的活性氧自由基，如超氧阴离子自由基（〇 2〇,单线态氧（1O2),过氧化氢（H2O2),羟基自 由基（-0H)等。然而这些内生的活性氧自由基可能会导致DNA大分子被氧化损伤，并形成多 种DNA损伤分子。其中8-羟基脱氧鸟苷（8-0HdG)是一种普遍存在的被氧化的DNA核苷， 被用来作为DNA氧化损伤的生物标志物。人群调查结果与细胞实验均表明8-0HdG可以通 过遗传变异和非遗传变异两种机制诱导癌症的发生。其中遗传变异机制主要涉及到在DNA 复制时8-0HdG会发生碱基错配，导致G :T转化的点突变。非遗传变异机制是指在DNA大分 子内的8-0HdG可以降低DNA与DNA甲基化酶之间的亲和力，使DNA甲基化模式发生变化。
[0003] 从低等的细菌到哺乳动物体内，DNA甲基化是一种主要的表观遗传修饰。这种化 学修饰是指在一族甲基转移酶DNMTs催化下将甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸(缩写为SAM) 转移到胞嘧啶的C-5位置并形成5-甲基胞嘧啶（5-mdC)。在真核生物体中DNMTs主要包 括DNMT1，DNMT3a，DNMT3b等，其中DNMTl对半甲基化状态的双链DNA有很高的甲基转移活 性。它为新合成的子链DNA提供了甲基化模式。另一方面，DNMT3a、MMT3b等DNA甲基转 移酶则会转移一个甲基基团到未甲基化的CpG碱基对上，形成新的甲基化单链和甲基化双 链。5-mdC主要位于CpG二聚体中，在哺乳动物全基因组中5-mdC约占总脱氧胞苷的3-6%。 DNA甲基化在生物体正常发育和功能分化中具有十分重要的生物学意义，如转录调控，X染 色体失活和基因印迹等。DNA甲基化被认为与衰老和多种重大疾病的发生有关。全基因组 低甲基化可以启动原癌基因的表达，染色体不稳定和基因印迹丢失。基因启动子区域过度 甲基化可以干扰转录因子与DNA的结合和/或使DNA聚集转录抑制复合物从而导致抑癌基 因表达沉默。
[0004] 越来越多的研究证明氧化性DNA损伤和DNA甲基化异常与多种疾病的发生机制 紧密相关，特别是衰老和癌症的发生。与此同时很多的证据表明一些环境因子可以诱发 DNA氧化损伤并改变DNA甲基化模式，如辐射、吸烟烟气、重金属和大气污染等。因而，氧化 性DNA损伤和DNA甲基化常常被作为重要的生物标志物，不仅用于疾病的早期诊断也可用 于高风险人体的检测和风险评估。此外，最近的报告指出在DNMT识别域内或附近存在的 8-0HdG可以显著地降低DNMTs和甲基化-CpG-结合蛋白与双链DNA的结合力并抑制DNA 甲基化过程。相反，研究也表明DNA过度甲基化可以使一些抗氧化基因表达沉默，如谷胱甘 肽-S-转移酶Pl和锰超氧化物歧化酶基因等。因此，建立一个简单有效的同时检测DNA样 品中5-甲基-脱氧胞苷和8-羟基-脱氧鸟苷的方法对于评价环境因子对生物体遗传损伤 和表观遗传变异效应，进一步搞清楚8-0HdG和5-mdC在癌症和肿瘤发生中的角色以及相互 作用是十分有益的。
[0005] 到目前为止，已经建立了多种基于色谱方法的检测8-OHdG或5-mdC的方法，如薄 层色谱，高效毛细管电泳HPCE，气相色谱-质谱联用GC-MS，高效液相的紫外检测HPLC-UV， 高效液相色谱电化学法HPLC-ECD，液相色谱-质谱LC-MS和液相色谱-串联质谱联用 LC-MS/MS等。在这些方法中，薄层色谱需要的仪器设备简单但是结果的准确性较低；HPCE、 HPLC-UV和HPLC-E⑶方法能够提供高的重复性和灵敏度，但是由于这类方法的检测器对化 合物(核苷和脱氧核苷）不具备特异性，结果的准确性取决于色谱对核苷和脱氧核苷分离效 果。GC-MS方法虽然可以提供高的灵敏度，但是样品的准备需要衍生化步骤，而衍生化又可 以会使一些脱氧核苷和核苷被人工氧化。然而，目前这些方法只是针对8-0HdG或5-mdC的 单一化合物，却还没有同时检测DNA样品中5-mdC和8-0HdG水平的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中的缺陷，提供一种同时检测DNA 样品中5-mdC和8-0HdG的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种高效液相色谱质谱联用检 测DNA氧化与DNA甲基化的方法，包括以下步骤：
[0008] 水解DNA，将DNA水解产物用HPLC-ESI-MS/MS测定5-甲基胞嘧啶和8-羟基脱氧 鸟苷的含量；
[0009] 高效液相色谱：流动相A :体积比0. 01?0. 3%的甲酸/甲醇；流动相B :体积比 0. 01?0. 3%的甲酸水溶液；在流速为0. 2?0. 4ml/min、柱温15?40°C条件下经液相色 谱柱分离；
[0010] 电喷雾质谱：以电喷雾离子源离子化，在正极模式下通过多反应监测系统进行质 谱分析。
[0011] 在本发明所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法中，所 述水解DNA包括以下步骤：
[0012] 取一定量的DNA溶于去离子水中，同时向所述去离子水中加入30毫摩尔每升、pH 为6. 8的乙酸钠，10毫摩尔每升氯化锌，50毫摩尔每升的去铁敏和8U核酸酶P1，将上述混 合物轻微震荡并在37°C下水浴至预设时间，向混合物中加入30毫摩尔每升、pH为7. 8的乙 酸钠，0. 4U蛇毒磷酸二酯酶和36U小牛内肠碱性磷酸酶，轻微震荡后在37°C下继续水浴，得 到所述DNA水解产物。
[0013] 在本发明所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法中， 30毫摩尔每升的所述乙酸钠、所述氯化锌、所述去铁敏与去离子水的体积比分别为3/10、 1/10,3/100 ；
[0014] 40毫摩尔每升的所述乙酸钠与所述混合物的体积比为4/10。
[0015] 在本发明所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法中，所 述水解DNA还包括以下步骤：
[0016] 将旋转超滤膜用去离子水冲洗以去除吸附在膜上的甘油，将一定量的所述DNA水 解产物加入到所述旋转超滤膜上，通过超滤装置在4°C下12000g离心30min，以去除所述 DNA水解产物中的蛋白质。
[0017] 在本发明所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法中，所 述高效液相色谱的分离采用规格为2. 1_X 150mm，5 Ii m的Waters Atlantis dC18色谱柱， 规格为 2. 1_X 20mm，5 u m 的 Phenomenex dC18 保护柱。
[0018] 在本发明所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法中，所 述高效液相色谱的梯度洗脱程序为：起始洗脱液中流动相A的体积百分比为100%，流动相B 的体积百分比为〇%，在24min内，流动相A由100%下降至82%，流动相B由0%上升至18%。 [0019] 在本发明所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法中，所 述质谱仪为三重串联四级杆质谱仪。
[0020] 本发明的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法具有以下有益 效果：本发明的方法可以同时检测DNA样品中的8-0HdG和5-mdC含量，对于探讨二者在衰 老和癌症发生中的角色以及二者的相互关系有积极作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0022] 图 la、图 Ib 分别是 8-0HdG ([M+H]+，m/z284. 2)和 5-mdC ([M+H]+，m/z242. 2)在 ESI+模式下的子离子图；
[0023] 图2是在284nm波长下正常和修饰核苷的液相色谱图；
[0024] 图3a、图3b分别是小牛胸腺DNA水解产物中8-0HdG和5-mdC的MRM离子图；
[0025] 图4a、图4b分别是8-0HdG和5-mdC在HPLC-ESI-MS/MS条件下的工作曲线。
【具体实施方式】
[0026] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0027] 本发明的一个优选实施例公开了一种高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA 甲基化的方法，包括以下步骤：
[0028] 1、水解DNA，即在核酸酶P1，磷酸二酯酶和小牛内肠碱性磷酸酶三种主要酶的催 化作用下水解，然后将DNA水解产物用高效液相色谱-电喷雾质谱HPLC-ESI-MS/MS测定 5_甲基胞嘧啶和8-羟基脱氧鸟苷的含量。
[0029] 优选地，水解DNA包括以下步骤：
[0030] 取一定量的DNA溶于去离子水中，同时向去离子水中加入30毫摩尔每升、pH为 6. 8的乙酸钠溶液，10毫摩尔每升氯化锌溶液，50毫摩尔每升的去铁敏和8U核酸酶PMf 上述混合物轻微震荡并在37°C下水浴至预设时间，优选为3小时，水浴后向上述混合物中 加入30毫摩尔每升、pH为7. 8的乙酸钠，0. 4U蛇毒磷酸二酯酶和36U小牛内肠碱性磷酸酶， 轻微震荡后在37°C下继续水浴，得到DNA水解产物，第二次水浴以12小时为宜。其中去铁 敏是一种抗氧化剂，防止在水解过程中处于高氧化/还原电位的dG转化为8-0HdG。
[0031] 此外，各成分的比例可以采用但不限于以下优选方案：30毫摩尔每升的乙酸钠、 氯化锌、去铁敏与去离子水的体积比分别为3/10、1/10、3/100 ;40毫摩尔每升的乙酸钠与 所述混合物的体积比为4/10。
[0032] 进一步的，水解产物中如果混有蛋白质可能会影响后续的检测，本实施例中采用 Microcon超滤装置(型号YM-10,截阻分子量10000)进行过滤以去除蛋白质。具体的，将旋 转超滤膜用去离子水冲洗以去除吸附在膜上的甘油，将一定量的DNA水解产物加入到旋转 超滤膜上，通过超滤装置在4°C下12000g离心30min，以去除DNA水解产物中的蛋白质。其 中，每一次加入超滤膜上的DNA水解产物的量为100 ill。
[0033] 2、高效液相色谱：流动相A :体积比0. 01?0. 3%的甲酸/甲醇；流动相B :体积比 0. 01?0. 3%的甲酸水溶液；在流速为0. 2?0. 4ml/min、柱温15?40°C条件下经液相色 谱柱分离。
[0034] 本实施例的液相分离即LC分离是在AgilentllOO型高效液相色谱进行的，该型液 相色谱配置了真空脱气机，自动进样器，快速分离二元泵，二极阵列检测器和柱温箱，此处 不作--详述。
[0035] 反向液相色谱分离米用 Waters Atlantis dC182. 1mmX 1 50mm (5 U m 颗粒 直径）色谱柱(其中2. Imm为内径长度、150mm为柱长，下同），保护柱为Phenomenex dC182. lmmX20mm (5iim颗粒直径)，dC18即反向碳十八柱。其中，流动相A优选为0. 1%甲 酸/甲醇，流动相B优选为0. 1%甲酸水溶液，流速优选为0. 22ml/min，色谱柱温度优选为 25°C，进样量优选为10 yl。dC和dG的紫外检测波长设定为284nm。
[0036] 高效液相色谱的梯度洗脱程序为：起始洗脱液中流动相A的体积百分比为100%， 流动相B的体积百分比为0%，在24min内，流动相A由100%下降至82%，流动相B由0%上 升至18%。
[0037] 3、电喷雾质谱：以电喷雾离子源离子化，在正极模式下通过多反应监测系统进行 质谱分析。本实施例中选用三重串联四级杆质谱仪用于化合物的鉴定与定量。优化的ESI 离子源参数见表1。5-mdC和8-0HdG的定量检测是在多反应检测（MRM)模式下进行的，质谱 检测采集两个质谱段的信号，其中7-12min和18-24min时间段分别对应于5-mdC和8-0HdG 的检测，5-mdC和8-0HdG检测的过渡离子对分别为m/z242. 2/126. 1和m/z284. 2. /168. 0。 Agilent Mass Hunter工作站（version B. OL 03)用于数据的采集和分析。
[0038] 表1优化后的质谱工作参数
[0039]
【权利要求】
1. 一种高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法，其特征在于，包括以 下步骤： 水解DNA，将DNA水解产物用HPLC-ESI-MS/MS测定5-甲基胞嘧啶和8-羟基脱氧鸟苷 的含量； 高效液相色谱：流动相A :体积比0. 01?0. 3%的甲酸/甲醇；流动相B :体积比0. 01? 0. 3%的甲酸水溶液；在流速为0. 2?0. 4ml/min、柱温15?40°C条件下经液相色谱柱分 离； 电喷雾质谱：以电喷雾离子源离子化，在正极模式下通过多反应监测系统进行质谱分 析。
2. 根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法， 其特征在于，所述水解DNA包括以下步骤： 取一定量的DNA溶于去离子水中，同时向所述去离子水中加入30毫摩尔每升、pH为 6. 8的乙酸钠，10毫摩尔每升氯化锌，50毫摩尔每升的去铁敏和8U核酸酶P1，将上述混合 物轻微震荡并在37°C下水浴至预设时间，向混合物中加入30毫摩尔每升、pH为7. 8的乙酸 钠，0. 4U蛇毒磷酸二酯酶和36U小牛内肠碱性磷酸酶，轻微震荡后在37°C下继续水浴，得到 所述DNA水解产物。
3. 根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法， 其特征在于，30毫摩尔每升的所述乙酸钠、所述氯化锌、所述去铁敏与去离子水的体积比分 别为 3/10、1/10、3/100 ; 40毫摩尔每升的所述乙酸钠与所述混合物的体积比为4/10。
4. 根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法， 其特征在于，所述水解DNA还包括以下步骤： 将旋转超滤膜用去离子水冲洗以去除吸附在膜上的甘油，将一定量的所述DNA水解产 物加入到所述旋转超滤膜上，通过超滤装置在4°C下12000g离心30min，以去除所述DNA水 解产物中的蛋白质。
5. 根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法， 其特征在于，所述高效液相色谱的分离采用规格为2. lmmX150mm，5ii m的Waters Atlantis dC18 色谱柱，规格为 2. 1_X 20mm，5 u m 的 Phenomenex dC18 保护柱。
6. 根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法， 其特征在于，所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为：起始洗脱液中流动相A的体积百分比 为100%，流动相B的体积百分比为0%，在24min内，流动相A由100%下降至82%，流动相B 由0%上升至18%。
7. 根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用检测DNA氧化与DNA甲基化的方法， 其特征在于，所述质谱仪为三重串联四级杆质谱仪。
【文档编号】G01N30/88GK104374853SQ201310353874
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】柯跃斌, 吴双, 朱舟, 耿艺介, 程锦泉 申请人:柯跃斌