高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于血液检测技术领域，具体涉及高效液相色谱串联质谱技术检测血清中 10种类固醇激素的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 类固醇激素是一类脂溶性小分子激素，是由胆固醇经一系列酶催化而来。本发明 主要针对其中对人体生长发育、性成熟及新陈代谢所必须的10种类固醇激素进行分析， 包括脱氛表雄酬（dehydroepiandrosterone, DHEA)、睾酬（testosterone，T)、双氛睾酬 (dihydrotestosterone，DHT)、雄稀二酮（androstenedione，AD)、雌酮（estrone, El)、皮 质酮（corticosterone, C0RT)、孕酮（progesterone, P4)、孕稀醇酮（pregnenolone，P5)、 17 α -轻孕酮（17 a -Hydroxyprogesterone, 17 α -〇HP4)和 17-轻孕稀醇酮（17-hydroxyl pregnenolone, 17-OHP5)〇
[0003] 其中，DHEA是一种非常重要的荷尔蒙，可使人改善记忆力，恢复性能力，降低血液 中的胆固醇，并能抵抗肥胖、心脏疾病与压力，还能强化免疫系统。脱氢表雄酮过低可能引 起糖尿病、免疫力不足、癌症、高血压及心脏病等重大疾病。17 a -OHP4和CORT增高可能引 起先天性肾上腺皮质增生，肾上腺腺瘤或卵巢肿瘤。T可增进记忆力、增加肌肉强度、减少脂 肪、增加骨头硬度。DHT的作用主要是维持产生精子作用，刺激生殖器官的发育，维持正常的 性欲，同时还能促进骨骼生长与钙磷的沉积和红细胞的生成。AD升高可引起痤疮，先天性肾 上腺皮质增生，肾上腺皮质肿瘤等；AD降低可使得男性发育延迟，侏儒症，肾上腺皮质功能 减退症，镰状红细胞性贫血。
[0004] 总之，人体类固醇激素的升高或者降低与一些临床疾病如先天性肾上腺增生、多 囊卵巢综合症、肾上腺皮质功能不全等疾病息息相关，其在血清中含量的高低对于评估人 体健康是至关重要的。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱串联质谱技术检测血清中 10种类固醇激素的试剂盒。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，
[0008] 所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮 质酮、孕酮、孕烯醇酮、17 α -羟孕酮和17-羟孕烯醇酮；
[0009] 所述试剂盒包括如下试剂：
[0010] ⑴洗脱液：
[0011] 洗脱液A :0· 1 % v/v甲酸水溶液；
[0012] 洗脱液B :0· 1 % v/v甲酸甲醇溶液；
[0013] (2)标准品母液：含雄烯二酮、17α -羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮、双氢睾酮、脱氢表雄 酮、孕酮、睾酮、皮质酮和17-羟孕烯醇酮的甲醇溶液；
[0014] ⑶混合内标液：含有d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、d8-17 α -羟孕酮、d2-雌酮和 d9-孕酮的甲基叔丁基醚溶液；
[0015] (4)稀释液：
[0016] 稀释液1 :空白血清基质溶液；
[0017] 稀释液2:甲醇；
[0018] (5)萃取液：甲基叔丁基醚；
[0019] (6)质控品：含有雄烯二酮、17 α -羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮、双氢睾酮、脱氢表雄 酮、孕酮、睾酮、皮质酮和17-羟孕烯醇酮的空白血清基质溶液，分高中低三个浓度分别为 QC (L)、QC (M)、QC (H);
[0020] 其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中10种类固醇激素质控品对应浓度见表1 ;
[0021] 表1 10种类固醇激素质控品对应浓度（单位ng/mL)
[0022]
【主权项】
1. 高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，其特征在于， 所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质 酮、孕酮、孕烯醇酮、17a-羟孕酮和17-羟孕烯醇酮； 所述试剂盒包括如下试剂： (1) 洗脱液： 洗脱液A:0. 1 %v/v甲酸水溶液； 洗脱液B:0. 1%v/v甲酸甲醇溶液； (2) 标准品母液：含雄烯二酮、17a-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、 孕酮、睾酮、皮质酮和17-羟孕烯醇酮的甲醇溶液； (3) 混合内标液：含有d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、d8-17a-轻孕酮、d2-雌酮和d9-孕 酮的甲基叔丁基醚溶液； (4) 稀释液： 稀释液1 :空白血清基质溶液； 稀释液2 :甲醇； (5) 萃取液：甲基叔丁基醚； (6) 质控品：含有雄烯二酮、17a-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、孕 酮、睾酮、皮质酮和17-羟孕烯醇酮的空白血清基质溶液，分高中低三个浓度分别为QC(L)、 QC(M)、QC(H); 其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中10种类固醇激素质控品对应浓度见表1 ; 表1 10种类固醇激素质控品对应浓度（单位ng/mL)
2. 根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的 试剂盒，其特征在于，所述的标准品母液为含浓度为20ng/mL的雄稀二酮、20ng/mL17a -轻 孕酮、20ng/mL孕稀醇酮、20ng/mL雌酮、20ng/mL双氢睾酮、80ng/mL的脱氢表雄酮、lOOng/ mL孕酮、100ng/mL睾酮、100ng/mL皮质酮、50ng/mL17-轻孕稀醇酮的甲醇溶液。
3. 根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的 试剂盒，其特征在于，所述的混合内标液为含有1. 〇mg/mLd6-脱氢表雄酮、1. 0mg/mLd3-睾 酬、l.Omg/mLd8_17a-轻孕酬、l.〇mg/mLd2_雌酬和l.Omg/mLd9_孕酬的甲基叔丁基酿 溶液。
4. 根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的 试剂盒，其特征在于，所述的空白血清基质溶液为40mg/mL牛血清蛋白的水溶液。
5. 根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的 试剂盒，其特征在于，所述的血清为人或动物的血清。
6. 权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂 盒的制备方法，其特征在于， (1) 洗脱液： 洗脱液A:配制0. 1 %v/v甲酸水溶液； 洗脱液B:配制0. 1%v/v甲酸甲醇溶液； (2) 标准品母液： 分别准确称取脱氢表雄酮10. 〇mg、睾酮25.Omg、双氢睾酮5. 2mg、雄稀二酮1. 5mg、雌 酮2. 5mg、皮质酮2.Omg、孕酮10mg、孕稀醇酮5.lmg、17a-轻孕酮l〇mg和17-轻孕稀醇酮 25mg，分别加入lmL、2. 5mL、5. 2mL、l. 5mL、2. 5mL、2mL、lmL、5.lmL、10mL和 2. 5mL的甲基叔丁 基醚，配制成浓度分别为10.Omg/mL的脱氢表雄酮、10.Omg/mL的睾酮、1.Omg/mL的双氢睾 酮、1.Omg/mL的雄稀二酮、1.Omg/mL的雌酮、1.Omg/mL的皮质酮、10.Omg/mL的孕酮、1.Omg/ mL的孕稀醇酮、1.Omg/mL的17-轻孕酮和10.Omg/mL的17-轻孕稀醇酮的标准品母液； 分别从以上脱氢表雄酮、睾酮、孕酮和17-羟孕烯醇酮标准品母液中移取100 y L用甲 基叔丁基醚定容至lmL，得到这10种类固醇激素的浓度都是1. Omg/mL，然后用甲醇将这10 种类固醇激素的浓度由1. Omg/mL逐级稀释至1. 0 y g/mL; 分别取200yL浓度为1. 0yg/mL的雄烯二酮、17a-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮和双氢睾 酮，800yL浓度为1.0yg/mL的脱氢表雄酮，各l.OmL浓度为1.0yg/mL的睾酮、孕酮和皮 质酮，500yL浓度为1.0yg/mL的17-羟孕烯醇酮均加入到15mL离心管中，再加去离子水 定容到10mL，配制成混合标准液A;混合标准液A中，雄烯二酮、17a-羟孕酮、孕烯醇酮、雌 酮和双氢睾酮的浓度为20ng/mL，脱氢表雄酮的浓度为80ng/mL，孕酮、睾酮和皮质酮的浓 度为100ng/mL，17-轻孕稀醇酮的浓度为50ng/mL; (3) 混合内标液：配制含有1.Omg/mLd6-脱氢表雄酮、1.Omg/mLd3-睾酮、1.Omg/mL d8_17a-轻孕酮、1.Omg/mLd2_雌酮和1.Omg/mLd9_孕酮的甲基叔丁基酿溶液； (4) 稀释液： 稀释液1 :将4g牛血清蛋白用水定容至100mL制得； 稀释液2 :甲醇； (5) 萃取液：甲基叔丁基醚； (6) 质控品：取步骤（2)得到的10种类固醇激素标混合标准液A各20yL、100yL、 500yL分别用空白血清基质溶液定容至1000yL得到。
7.权利要求1~5中任意一项所述的试剂盒在利用高效液相色谱串联质谱技术检测血 清中10种类固醇激素中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的试剂盒，包括洗脱液、标准品母液、混合内标液、稀释液、萃取液和质控品，所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质酮、孕酮、孕烯醇酮、17α-羟孕酮和17-羟孕烯醇酮。采用本发明试剂盒进行检测，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，10min之内可完成多种激素的分离和检测，精密度与加标回收率基本满足要求。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104807920
【申请号】CN201510264575
【发明人】周亚飞, 于嘉屏
【申请人】上海迪安医学检验所有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月21日