高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于血液检测技术领域，具体涉及高效液相色谱串联质谱技术检测血清中 10种类固醇激素的方法。
【背景技术】
[0002] 类固醇激素是一类脂溶性小分子激素，是由胆固醇经一系列酶催化而来。本发明 主要针对其中对人体生长发育、性成熟及新陈代谢所必须的10种类固醇激素进行分析， 包括脱氛表雄酬（dehydroepiandrosterone, DHEA)、睾酬（testosterone，T)、双氛睾酬 (dihydrotestosterone，DHT)、雄稀二酮（androstenedione，AD)、雌酮（estrone, El)、皮 质酮（corticosterone, C0RT)、孕酮（progesterone, P4)、孕稀醇酮（pregnenolone，P5)、 17 α -轻孕酮（17 α -Hydroxyprogesterone, 17 α -〇HP4)和 17-轻孕稀醇酮（17-hydroxylp regnenolone, 17-OHP5)〇
[0003] 其中，DHEA是一种非常重要的荷尔蒙，可使人改善记忆力，恢复性能力，降低血液 中的胆固醇，并能抵抗肥胖、心脏疾病与压力，还能强化免疫系统。脱氢表雄酮过低可能引 起糖尿病、免疫力不足、癌症、高血压及心脏病等重大疾病。17 a -OHP4和CORT增高可能引 起先天性肾上腺皮质增生，肾上腺腺瘤或卵巢肿瘤。T可增进记忆力、增加肌肉强度、减少脂 肪、增加骨头硬度。DHT的作用主要是维持产生精子作用，刺激生殖器官的发育，维持正常的 性欲，同时还能促进骨骼生长与钙磷的沉积和红细胞的生成。AD升高可引起痤疮，先天性肾 上腺皮质增生，肾上腺皮质肿瘤等；AD降低可使得男性发育延迟，侏儒症，肾上腺皮质功能 减退症，镰状红细胞性贫血。
[0004] 总之，人体类固醇激素的升高或者降低与一些临床疾病如先天性肾上腺增生、多 囊卵巢综合症、肾上腺皮质功能不全等疾病息息相关，其在血清中含量的高低对于评估人 体健康是至关重要的。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱串联质谱技术检测血清中 10种类固醇激素的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法，
[0008] 所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮 质酮、孕酮、孕烯醇酮、17 α -羟孕酮和17-羟孕烯醇酮；
[0009] 采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述10种类固醇激 素，先利用高效液相色谱将10种类固醇激素分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准 品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述 10种类固醇激素的含量，具体色谱条件为：
[0010] (1)高效液相色谱条件：
[0011] 流动相A :0· 1 % v/v甲酸水溶液；
[0012] 流动相B :0· 1% v/v甲酸的甲醇溶液；
[0013] 色谱柱型号：Phenomenex C18100mmX 2. 1mm，2. 6 μ m ;
[0014] 采用梯度洗脱的方式，见表1 ;
[0015] 流速为0· 5mL/min，柱温为35°C，进样体积为20 μ L ;
[0016] 表1流动相梯度洗脱参数
[0017]
【主权项】
1.高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法，其特征在于， 所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质 酮、孕酮、孕烯醇酮、17a-羟孕酮和17-羟孕烯醇酮； 采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述10种类固醇激素， 先利用高效液相色谱将10种类固醇激素分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与 内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述10种 类固醇激素的含量，具体色谱条件为： (1) 高效液相色谱条件： 流动相A:0. 1%v/v甲酸水溶液； 流动相B:0. 1%v/v甲酸的甲醇溶液； 色谱柱型号：PhenomenexC18 100mmX2.1mm，2.6iim; 采用梯度洗脱的方式，见表1; 流速为〇. 5mL/min，柱温为35°C，进样体积为20yL; 表1流动相梯庠洗脱参数
(2) 质谱条件： 在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电 压为5500V;碰撞气为Medium;气帘气为40kPa;离子源雾化气和加热辅助气均为 60kPa;去溶剂温度为550°C;同时监测了目标物孕酮（m/z345.093 - 124.1)、孕烯醇 酮（m/z332. 0 - 86. 2)、17a-羟孕酮（m/z 361. 0 - 112. 2)、17_ 羟孕烯醇酮（m/z 348.0 - 330. 3)、雄烯二酮（m/z317.0- 112. 2)、脱氢表雄酮（m/z304.2 - 253. 2)、睾 酮（m/z304. 1/112. 2)、双氢睾酮（m/z306. 2 - 81. 1)、皮质酮（m/z410. 0 - 377. 2)和 雌酮（m/z286. 0 - 253. 0)以及同位素内标d2-雌酮（m/z288. 0 - 255.I)、d6-脱氢 表雄酮（m/z310. 3 - 219. 2)、d8-17a-羟孕酮（m/z 269. 2 - 115. 1)和d3-睾酮（m/z 307. 0 - 112. 2);各个目标物的去簇电压、碰撞电压和碰撞池出口电压参数见表2 ; 表2 10种类固醇激素质谱参数 ?a
2. 根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素 的方法，其特征在于，所述的血清为人或动物的血清。
3. 根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素 的方法，其特征在于，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取200yL血清于 1. 5mL离心管中，向其中加入20yL100ng/mL混合内标液B，再加入600yLMTBE，然后涡旋 数秒后振荡15min，14000r/min离心5min后取400yL上清液用氮吹仪吹干，再加入80yL 1. 5mol/L羟胺，涡旋5秒后振荡15min，放入恒温箱60°C衍生化反应lh。
4. 根据权利要求3所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的 方法，其特征在于，所述的混合内标液B按如下方法制备得到：分别准确称取10.Omg氘代同 位素内标品，包括d6-脱氢表雄酮、d3-睾酮、d8-17a-羟孕酮、d2-雌酮和d9-孕酮，分别 加入10mL甲基叔丁基醚完全溶解，得到浓度均为1.Omg/mL的5种同位素内标溶液，然后用 甲醇将这5种同位素内标溶液的浓度均由1.Omg/mL稀释至1. 0yg/mL，接着各取lmL浓度 为1. 0yg/mL的5种同位素内标溶液加水定容至10mL，配制得到浓度均为100ng/mL的混合 内标液B。
5. 根据权利要求3所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的 方法，其特征在于，所述的标准品按照如下步骤制备得到： 分别准确称取脱氢表雄酮10.Omg、睾酮25.Omg、双氢睾酮5. 2mg、雄稀二酮1. 5mg、雌 酮2. 5mg、皮质酮2.Omg、孕酮10mg、孕稀醇酮5.lmg、17a-轻孕酮l〇mg和17-轻孕稀醇酮 25mg，分别加入lmL、2. 5mL、5. 2mL、l. 5mL、2. 5mL、2mL、lmL、5.lmL、10mL和 2. 5mL的甲基叔丁 基醚，配制成浓度分别为10.Omg/mL的脱氢表雄酮、10.Omg/mL的睾酮、1.Omg/mL的双氢睾 酮、1.Omg/mL的雄稀二酮、1.Omg/mL的雌酮、1.Omg/mL的皮质酮、10.Omg/mL的孕酮、1.Omg/ mL的孕稀醇酮、1.Omg/mL的17-轻孕酮和10.Omg/mL的17-轻孕稀醇酮的标准品母液； 分别从以上脱氢表雄酮、睾酮、孕酮和17-羟孕烯醇酮标准品母液中移取100yL用甲 基叔丁基醚定容至lmL，得到这10种类固醇激素的浓度都是1.Omg/mL，然后用甲醇将这10 种类固醇激素的浓度由1.Omg/mL逐级稀释至1. 0yg/mL; 分别取200yL浓度为1. 0yg/mL的雄烯二酮、17a-羟孕酮、孕烯醇酮、雌酮和双氢睾 酮，800yL浓度为1.0yg/mL的脱氢表雄酮，各l.OmL浓度为1.0yg/mL的睾酮、孕酮和皮 质酮，500yL浓度为1.0yg/mL的17-羟孕烯醇酮均加入到15mL离心管中，再加去离子水 定容到10mL，配制成混合标准液A;混合标准液A中，雄烯二酮、17a-羟孕酮、孕烯醇酮、雌 酮和双氢睾酮的浓度为20ng/mL，脱氢表雄酮的浓度为80ng/mL，孕酮、睾酮和皮质酮的浓 度为100ng/mL，17-轻孕稀醇酮的浓度为50ng/mL; 移取100yL混合标准液A于1. 5mL离心管中，向其中加入100yL空白血清基质作为 第一个高值浓度点；移取40yL混合标准液A用血清基质类似物定容至400yL得到标准混 合液B;分别取5、25、50、100、200yL标准混合液B定容至200yL，得到其它五个校准浓度 点，这六个浓度点体积均为200yL;接着向其中各加入20yL100ng/mL混合内标液B，再加 入600yL甲基叔丁基醚，然后涡旋5秒后振荡15min，14000r/min离心5min后取400yL 上清液用氮吹仪吹干，再加入80yL1. 5mol/L羟胺，涡旋5秒后振荡15min，再放入恒温箱 60°C衍生化反应lh。
6.根据权利要求5所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的 方法，其特征在于，所述的空白血清基质为40mg/mL牛血清蛋白水溶液。
【专利摘要】本发明公开了高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法，所述的10种类固醇激素分别为：脱氢表雄酮、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、雌酮、皮质酮、孕酮、孕烯醇酮、17α-羟孕酮和17-羟孕烯醇酮；采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述10种类固醇激素，先利用高效液相色谱将10种类固醇激素分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述10种类固醇激素的含量。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，10min之内可完成多种激素的分离和检测，精密度与加标回收率基本满足要求。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104807921
【申请号】CN201510264590
【发明人】周亚飞, 于嘉屏
【申请人】上海迪安医学检验所有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月21日