专利名称：利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法
利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法技术领域
本发明属于生物转化技术领域，具体涉及一种利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法。
背景技术：
熊果苷是源于杜鹃花科熊果属植物熊果叶的一种成份。研究表明熊果苷具有抑制酪氨酸酶活性、镇咳、利尿、抗菌等生物活性。熊果苷能有效地与酪氨酸酶结合，使黑色素的合成减少，从而减少皮肤中色素沉积，是目前国内外常用于美白化妆品中的主要原料，国内外市场需求十分巨大。目前熊果苷的生产主要是通过化学合成，但是化学合成需要4 6 步反应完成，合成成本高、污染大、副产物多。
生物转化是指通过培养微生物、植物细胞、植物组织，利用其体内的酶对外源底物进行结构修饰而获得有价值产物的一种技术。该技术与化学合成相比，具有无毒、无污染、 低能耗、高效率、高选择性等优点。发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、无污染并且转化率高的利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案
培养黄芩毛状根，利用培养后的黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷。
所述培养黄芩毛状根的培养基为改良MS培养基，该改良MS培养基包含大量元素、 微量元素、铁盐和有机成分，pH为5. 4 6. 0 ；
所述大量元素包含950mg/L 的 KN03、42. 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 · 7H20、 220mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和 500mg/L 的水解乳蛋白；
所述微量元素包含0. 83mg/L 的 KI,6. 2mg/L 的 H3BO3^22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4H20、 8. 6mg/L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 和 0. 025mg/ L 的 CoCl2 ；
所述铁盐包含18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；
所述有机成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的盐酸硫胺素、 0. 5mg/L盐酸吡哆醇和0. 5mg/L的烟酸。
上述改良MS培养基通过改变现有MS培养基(1962年由Murashige，T.和Skoo-ge， F. 二人设计的，故简称MS培养基。)的组成，更适合黄芩毛状根的生长。
所述培养黄芩毛状根的方法为
1)将黄芩毛状根以4-5g/L接种于黄芩毛状根种子培养基中于100 150r/min下避光震荡培养18 20天得黄芩毛状根种子，培养的温度25 ^°C，黄芩毛状根种子培养基为添加40-50g/L蔗糖的改良MS培养基；
2)将黄芩毛状根种子以4-5g/L接种于培养基中于100 150r/min下避光震荡培养20 30天，培养的温度为25 ，培养基为添加30-60g/L蔗糖、葡萄糖或其混合物和0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培养基。加入一定量的蔗糖、葡萄糖和0. 4mmol/L苯丙氨酸的作用在于促进黄芩毛状根快速生长，提高了黄芩毛状根转化合成熊果苷的能力，有利于节约生产成本，提高经济效益。
所述转化的时间为30 40h，转化时的温度为20 ^°C。
所述对苯二酚在加入前用体积分数70%的乙醇水溶液进行溶解，溶解比例为每 l-5mL乙醇水溶液溶解20mg对苯二酚。乙醇水溶液的作用在于降低加入对苯二酚的过程中黄芩毛状根染菌的机率，避免黄芩毛状根转化对苯二酚过程中染菌。
所述对苯二酚的加入量为每IOOmL黄芩毛状根的培养液中加入15 25mg。当每 IOOmL培养液的加入量超过25mg时，对苯二酚抑制黄芩毛状根的生长。
与现有的熊果苷生产技术相比，本发明具有以下有益的技术效果
1.与化学合成法相比，本发明生产工艺简便，底物的转化率达到50 60 %，具有低污染、副产物少等优点；2.与从植物提取方法相比，熊果苷生产周期短，条件可控，不受季节限制；3.本发明利用黄芩毛状根的糖苷转化功能，可作为新产物的生物反应器，为熊果苷的合成提供了一种新途径，也为开发新型药材提供了新途径和新思路。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。
本发明公开了一种利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法，通过预培养黄芩毛状根，然后将一定量对苯二酚作为底物加入到黄芩毛状根培养液中，利用黄芩毛状根细胞内的糖苷酶转化对苯二酚生成熊果苷。
实施例1
1)将黄芩毛状根以4g/L接种于黄芩毛状根种子培养基中J8°C，120r/min，避光培养18天；所述的黄芩毛状根种子培养基为添加50g/L蔗糖的改良MS培养基；
2)将经过步骤1)培养18天的黄芩毛状根，以5g/L接种到培养基中，28°C，150r/ min，避光培养28天；所述的培养基为添加50g/L蔗糖的改良MS培养基。
3)将对苯二酚溶于体积分数70%的乙醇水溶液中，溶解比例为每ImL乙醇水溶液溶解20mg，在无菌条件下加入到经过步骤2、培养后的黄芩毛状根培养液中，利用黄芩毛状根转化40h，转化时的温度为25°C，转化在避光条件下进行；所述的对苯二酚的加入量为 20mg/IOOmL 培养液；
所述改良MS培养基采用以下配方
包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5. 4 6. 0 ；
所述的大量元素为KNO3 :950mg/L、KH2PO4 :42. 5mg/L、MgSO4 · 7H20 185mg/L 和 CaCl2 · 2H20 220mg/L ；水解乳蛋白:500mg/L ；
微量元素为KI 0. 83mg/L、H3BO3 :6. 2mg/L、MnSO4 · 4H20 :22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 :0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 :0. 025mg/L 和 CoCl2 :0. 025mg/L ；
铁盐为 Na2 · EDTA 18. 65mg/L 和 FeSO4 · 7Η2013· 9mg/L ；
有机成分为肌醇100mg/L、甘氨酸dmg/L、盐酸硫胺素0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L 和烟酸0. 5mg/L ；
4) HPLC测定毛状根中熊果苷的含量为4. 42%，对苯二酚的转化率为51. 6%。
实施例2
1)将黄芩毛状根以5g/L接种于黄芩毛状根种子培养基中，28°C，100r/min，避光培养20天；所述的黄芩毛状根种子培养基为添加40g/L蔗糖的改良的MS培养基；
2)将经过步骤1)培养20天的鲜嫩黄芩毛状根种子以5g/L接种到培养基中， 28 0C，100r/min,避光培养20天；所述培养基为添加50g/L蔗糖和10g/L葡萄糖以及 0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培养基；所述改良MS培养基采用如实施例1的配方；
3)将对苯二酚溶于体积分数70%的乙醇水溶液中，溶解比例为每2mL乙醇水溶液溶解20mg，在无菌条件下加入到经过步骤2、培养后的黄芩毛状根培养液中，利用黄芩毛状根转化40h，转化时的温度为；转化在避光条件下进行，所述的对苯二酚的加入量为 20mg/IOOmL 培养液；
4)HPLC测定毛状根中熊果苷的含量为4. 71%，对苯二酚的转化率为56. 13%。与实施例1相比，通过在毛状根培养阶段的的培养基中加入葡萄糖以及苯丙氨酸，提高了对苯二酚的转化率。
实施例3
培养黄芩毛状根，利用培养后的黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷，所述转化的时间为30h，转化时的温度为20°C，转化在避光条件下进行，所述对苯二酚在加入前用体积分数70%的乙醇水溶液进行溶解，溶解比例为每ImL乙醇水溶液溶解20mg对苯二酚，对苯二酚的加入量为每IOOmL黄芩毛状根的培养液中加入15mg。
所述培养黄芩毛状根的方法为
1)将黄芩毛状根以5g/L接种于黄芩毛状根种子培养基中于150r/min下避光震荡培养19天得黄芩毛状根种子，培养的温度25°C，黄芩毛状根种子培养基为添加40g/L蔗糖的改良MS培养基；
2)将黄芩毛状根种子以4g/L接种于培养基中于120r/min下避光震荡培养30天， 培养的温度为25°C，培养基为添加30g/L葡萄糖和0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培养基。
上述改良MS培养基，包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5. 4 6.0 ；
所述大量元素包含950mg/L 的 KN03、42. 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 · 7H20、 220mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和 500mg/L 的水解乳蛋白；
所述微量元素包含0. 83mg/L 的 KI,6. 2mg/L 的 H3BO3^22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4H20、 8. 6mg/L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 和 0. 025mg/ L 的 CoCl2 ；
所述铁盐包含18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；
所述有机成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的盐酸硫胺素、 0. 5mg/L盐酸吡哆醇和0. 5mg/L的烟酸。
HPLC测定毛状根中熊果苷的含量可达4 6%，对苯二酚的转化率可达50 60%。
实施例4
培养黄芩毛状根，利用培养后的黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷，所述转化的时间为35h，转化时的温度为22°C，转化在避光条件下进行，所述对苯二酚在加入前用体积分数70%的乙醇水溶液进行溶解，溶解比例为每5mL乙醇水溶液溶解20mg对苯二酚，对苯二酚的加入量为每IOOmL黄芩毛状根的培养液中加入25mg。
所述培养黄芩毛状根的方法为
1)将黄芩毛状根以4g/L接种于黄芩毛状根种子培养基中于130r/min下避光震荡培养19天得黄芩毛状根种子，培养的温度^rc,黄芩毛状根种子培养基为添加50g/L蔗糖的改良MS培养基；
2)将黄芩毛状根种子以4g/L接种于培养基中于140r/min下避光震荡培养对天， 培养的温度为27°C，培养基为添加60g/L蔗糖和0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培养基。
上述改良MS培养基，包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5. 4 6.0 ；
所述大量元素包含950mg/L 的 KN03、42. 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 · 7H20、 220mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和 500mg/L 的水解乳蛋白；
所述微量元素包含0. 83mg/L 的 KI,6. 2mg/L 的 H3BO3^22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4H20、 8. 6mg/L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 和 0. 025mg/ L 的 CoCl2 ；
所述铁盐包含18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；
所述有机成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的盐酸硫胺素、 0. 5mg/L盐酸吡哆醇和0. 5mg/L的烟酸。
HPLC测定毛状根中熊果苷的含量可达4 6%，对苯二酚的转化率可达50 60%。
HPLC测定黄芩毛状根中熊果苷的方法收获转化后的毛状根，80°C烘干，95% 乙醇，以1 100料液比，回流提取^!;HPLC法测定毛状根中熊果苷含量的测定条件 waters-2487, Symmetry_C18 (250mmX 4. 6mm, 5 μ m),、流速 0. 8mL/min,、流云力才目V 甲醇V水= 15 85，检测波长287nm。
本发明所述利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法，该方法是通过培养黄芩毛状根，利用黄芩毛状根细胞内的糖苷酶，转化对苯二酚，生成熊果苷。转化后的黄芩毛状根中熊果苷的含量可达4 6%，对苯二酚的转化率可达50 60%。本发明具低污染、 副产物少等特点，为熊果苷生产提供了一种新技术、新途径。
权利要求
1.一种利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于包括以下步骤 培养黄芩毛状根，利用培养后的黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷。
2.根据权利要求1所述一种利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于所述培养黄芩毛状根的培养基为改良MS培养基，该改良MS培养基包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5. 4 6. 0 ；所述大量元素包含 950mg/L 的 ΚΝ03、42· 5mg/L 的 KH2P04、185mg/L 的 MgSO4 7H20,220mg/ L的CaCl2 · 2H20和500mg/L的水解乳蛋白；所述微量元素包含 0. 83mg/L 的 KI、6. 2mg/L 的 H3B03、22. 3mg/L 的 MnSO4 · 4Η20、8· 6mg/ L 的 ZnSO4 · 7Η20、0· 25mg/L 的 Na2MoO4 · 2Η20、0· 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20 禾口 0. 025mg/L 的 CoCl2 ；所述铁盐包含 18. 65mg/L 的 Na2 · EDTA 和 13. 9mg/L 的 FeSO4 · 7H20 ；所述有机成分包含100mg/L的肌醇、2mg/L的甘氨酸、0. lmg/L的盐酸硫胺素、0. 5mg/L 盐酸吡哆醇和0. 5mg/L的烟酸。
3.根据权利要求2所述一种利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于所述培养黄芩毛状根的方法为1)将黄芩毛状根以4-5g/L接种于黄芩毛状根种子培养基中于100 150r/min下避光震荡培养18 20天得黄芩毛状根种子，培养的温度25 ^°C，黄芩毛状根种子培养基为添加40-50g/L蔗糖的改良MS培养基；2)将黄芩毛状根种子以4-5g/L接种于培养基中于100 150r/min下避光震荡培养 20 30天，培养的温度为25 ^°C，培养基为添加30-60g/L蔗糖、葡萄糖或其混合物和 0. 4mmol/L苯丙氨酸的改良MS培养基。
4.根据权利要求1或3所述一种利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于所述转化的时间为30 40h，转化时的温度为20 ^°C。
5.根据权利要求1所述一种利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于所述对苯二酚在加入前用体积分数70%的乙醇水溶液进行溶解，溶解比例为每 l-5mL乙醇水溶液溶解20mg对苯二酚。
6.根据权利要求1所述一种利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法，其特征在于所述对苯二酚的加入量为每IOOmL黄芩毛状根的培养液中加入15 25mg。
全文摘要
本发明公开了一种利用黄芩毛状根转化对苯二酚合成熊果苷的方法，该方法是通过培养黄芩毛状根，利用黄芩毛状根细胞，转化对苯二酚，生成熊果苷。转化后的黄芩毛状根中熊果苷的含量可达4～6％，对苯二酚的转化率可达50～60％。本发明具低污染、副产物少等特点，为熊果苷生产提供了一种新技术、新途径。
文档编号A01H4/00GK102505031SQ20111030040
公开日2012年6月20日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者彭飞宇, 施春阳, 钱卫东, 齐香君 申请人:陕西科技大学