专利名称：微生物发酵转化含苷类中药及其相应苷元制剂制备的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用微生物发酵转化含苷中药及相应增效制剂制备的方法，具体的，本发明涉及一种利用微生物发酵产酶，将含苷类中药中的苷类物质转化为苷元的方法及相应苷元制剂制备的方法。
背景技术：
次生代谢产物在植物体内以苷的形式存在，苷的形式不利于人的吸收，对人体有效的物质是其苷元。服药后，苷元是经肠道微生物转化获得的。苷在人体内转化存在很多缺陷a、在体内运行时间长、转化效率低。b、有些苷元可能在转化过程中被分解成其他物质，从而失去药效。c、个体存在差异，每个人转化效果高低不同，从而导致药效不能充分发挥。
含苷类中药中苷类物质可以理解为植物由于不具有排泄器官，结果产生生物活性较低的化合物，如在化合物上添加极性基团，把具有生理活性的二次代谢产物苷元和糖结合起来形成生理活性较低的苷类而加以储存，使之更易排出体外。而对于人的代谢反应正好相反，人把苷吞服以后，借助肠道微生物的作用又把它变回生理活性物质，药理和毒理活性得到增强。这些含苷类中药是以前药的形式存在的，真正起作用的是其代谢产物。如本申请所提到的京尼平苷利胆作用仅限于口服给药，静脉注射无效，其苷元为京尼平，如果注射京尼平则有利胆作用，揭示京尼平苷的药理作用是通过肠道菌水解而产生的。若我们事先将栀子进行发酵使京尼平苷转化成京尼平，则其利胆作用为栀子发酵饮片所具备，因此发酵栀子具有明显利胆疗效。牛蒡子苷在进行动物体内试验(尤其是口服时)时所表现出的活性，主要是由于牛蒡子苷在消化道中经肠道菌的作用转变为苷元的脱甲基化物，此脱甲基化物在肝脏中的儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)的作用下恢复为苷元，苷元被血液输送到各个器官而发挥作用。如在白血病细胞株HL-60对牛蒡子苷和牛蒡子苷元抗白血病活性的研究中，牛蒡子苷无效，但苷元对白细胞株HL-60有明显的抑制活性，牛蒡子苷元还对肿瘤坏死因子(TNF-α)、一氧化氮(NO)的产生及淋巴增殖具有抑制作用；能抑制DNA拓扑异构酶II及人类免疫缺陷病毒I(HIV-I)整合酶活性。是抗HIV/AIDS活性物质，从而确定牛蒡子苷元是牛蒡子中的直接有效成分，而牛蒡子苷是前体物质。因此我们需要主动的利用微生物特异性的在体外对其进行转化。植物次生代谢产物是中药有效成分，是本发明的物质基础。
含苷类中药本身就具有丰富的营养物质，单独利用中药成分和添加少量其他营养成分就可以使微生物较好的生长。当营养成分特别是碳源消耗殆尽时微生物又可以利用所苷类降解生成的糖作碳源继续生长。因为对微生物来说，苷的糖就是不错的碳源，于是就能相适应地产生出分解酶，分解苷类，因此利用微生物发酵转化是可行的。
利用微生物发酵炮制中药古已有之，并且是一种相当重要的炮制加工方法之一，许多经典药物都是经微生物发酵后产生了新的药理活性，如虫草。但这些品种都是利用自然界天然的菌种发酵的，一般多为霉菌、酵母、细菌等，由于菌种不纯，针对性不强，不能定向改变药物的性能或有意识地根据药物之间的特性进行有目的的组合，同时接入的微生物种类范围受到了极大限制，也不可能根据需要将几种微生物组合接种在一起；另一方面，对那些在自然界中不占优势、生长条件要求比较严格的微生物来说，就不可能在药物上生长起来，这就大大地限制了微生物的作用。另外，是否会混入有害菌也不明确，所以微生物在药物中的潜在效能没有最大限度地发挥出来。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种利用微生物产生的酶系分解含苷类中药中的苷类物质，使其转化为直接有效成分苷元的方法。该方法克服了传统的化学法引起的对苷类物质结构和构型的改变，简化了酶解法工艺过程及转化过程，提高了转化效率和溶出率。
本发明的目的之二在于提供含苷类中药苷元制剂制备的方法。本发明苷元可口服或静脉注射作用于人体，当其进入组织或血液后，可在短期内达到较高的血药浓度，所以具有吸收快，用量小，毒性低、作用迅速的优点。
本发明的具体技术方案如下微生物发酵转化含苷类中药的方法，其特征在于它是将含苷类中药粉碎后，按照料量以一定水比配制后，于115℃下灭菌10-20min，冷却后，接种微生物菌种发酵，利用微生物发酵生成的相应酶类作用于中药中所含的苷类物质，使其脱去葡萄糖转化为相应的苷元，最后终止发酵，用相应有机溶剂从发酵品中溶出得苷元粗品，再用硅胶柱层析、溶剂重结晶和/或萃取法对苷元进行纯化，得苷元纯品。
所述菌株为青霉，其保藏编号为4009；或柱黄曲霉，其保藏编号为2348，均购自中国工业微生物菌种保藏中心。
所述青霉菌种4009发酵的种子斜面为琼脂粉1.6％、土豆20％、葡萄糖2％、pH自然。
所述柱黄曲霉2348发酵的种子斜面为硝酸钠0.2％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钾0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、蔗糖3％、琼脂粉20％，PH自然。
所述种子斜面为固体培养微生物的一种形式，可以在4℃下保藏微生物较长时间，具体配置方法是在种子培养基中加入1.6％的琼脂粉，加热融化后，分装到试管中，灭菌后将试管倾斜摆放，冷却后形成斜面状，在斜面表面接种微生物，让微生物在其表面生长。
所述含苷类中药中的牛蒡子、栀子、商陆、虎杖、大黄、三七、柴胡、葛根、远志、杜仲、山药、芍药等中药是经青霉4009产生的β-葡萄糖苷酶水解其中的苷产生相应的苷元。
所述含苷类中药中的甘草、黄芩是经柱黄曲霉2348产生的葡萄糖醛酸酶水解其中的苷产生相应的苷元。
所述菌种与含苷类中药粉末共发酵的方法包括方法1液体带渣培养将中药烘干后粉碎，以料水比5-20/100配制培养基，pH自然。按10-30％的装液量分装入三角瓶中，115℃灭菌10-20min，菌种用无菌水配制成每毫升含106-8个分生孢子的悬浮液，以孢子悬液的形式按5-10％(V/W)比例接入培养基，震荡培养。
本方法菌种与中药粉末共发酵的培养温度是26-30℃，摇床转速160-200rpm，培养时间96-120h。
方法2中药煮提液发酵将中药按料水比1∶10回流煮提3次，每次1h，合并煮提液，低速离心去除煮提液中的残渣，将上清液按照20-40％的装液量分装入500ml三角瓶，115℃灭菌15-20min，菌种用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，以孢子悬液的形式按3-10％(V/W)比例接入培养基，震荡培养。
本方法菌种与中药共发酵的培养温度是26-30℃，摇床转速140-220rpm，培养时间72-96h。
方法3固体发酵将中药于60℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎，过20目筛。以中药粉为培养基成分，将其调配成含水量30-70％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，115℃灭菌20min。菌种以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按2-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，在50*50cm的培养槽中，混合均匀后置于立式培养箱发酵培养。
本方法菌种与中药共发酵的培养温度是24-32℃，培养时间96-154h。
所述苷元纯化的具体方法包括方法1终止发酵后，取发酵后的发酵液过滤，过滤后取滤液，用相应有机溶剂从滤液中萃取得苷元粗品，含量达45％。再用硅胶柱层析和溶剂重结晶对苷元进行纯化，得苷元纯品。
方法2取发酵后中药，低温烘干后，加入2-3倍体积60-80％乙醇，回流提取两次，每次1h，合并提取液，减压回收乙醇，得浸膏，浸膏用相应有机溶济萃取得苷元粗品，含量一般为40％左右。再经硅胶柱层析和溶剂重结晶法得相应苷元纯品。
微生物发酵转化含苷类中药的相应苷元制剂制备的方法，其特征在于将上述苷元纯品或苷元含量约为30％的粗品，按制剂学上的通用方法制成各种剂型，包括片剂、胶囊、注射剂等。
本发明的优点在于1、本发明微生物发酵转化含苷类中药，克服了传统的化学法引起的对苷类物质结构和构型的改变，温和的转化过程有效地避免了强烈的酸碱分解反应引起的结构变型影响。
2、本发明微生物发酵转化含苷类中药，简化了酶解法工艺过程，它不必要将所含的苷类物质先提出来再酶解，更不需要将酶先提纯出来再利用，有效地简化了转化过程，提高了转化效率和溶出率。
3、本发明利用现代微生物发酵工程技术，使含苷类中药的苷类物质在体外可控条件下实现规模转化，得到的相应的苷元可口服或静脉注射作用于人体，进入组织或血液，短期内可达到较高的血药浓度，具有吸收快，用量小，作用迅速的优点。
4、本发明使中药中的有效成分变为能够被人体直接定量利用、结构明确、药理准确、药效显著的活性成分，且制备成各种制剂，从而使中药的用药符合现代用药要求。
5、本发明利用微生物在体外对中药进行有目的的、可控的规模转化，有效地提高了苷元的含量，提高了中药的生物利用度。
具体实施例方式
实施例1微生物发酵转化甘草小试将甘草煮提3次，合并水提液调整浓度为6-10％，灭菌。柱黄曲霉2348用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，以孢子悬液形式按1％(V/W)比例加入发酵培养基中，发酵的培养温度24-36℃，培养时间96-154h。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例2微生物发酵转化甘草工业化生产将甘草加煮提3次，合并水提液调整浓度为6-10％装于于100升发酵罐中，灭菌，在土豆20％，葡萄糖2％种子罐培养种子后，按3-5％接种量接入发酵罐发酵，发酵的培养温度26-34℃，培养时间96-120h。每次可达到20斤生甘草的发酵量。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例3增效甘草养胃保肝降酯口服液的制备本发明所述的一种增效甘草养胃保肝降酯制剂口服液的制备方法是一株柱黄曲霉2348与甘草共发酵，以甘草水提液为培养基成分，柱黄曲霉2348以孢子形式接入培养基。共发酵后的发酵液离心出菌体在真空下浓缩，分装后灭菌制得。
实施例4增效甘草养胃保肝降酯制剂口服胶囊制剂的制备本发明所述的一种增效甘草养胃保肝降酯制剂口服胶囊制剂的制备方法是一株柱黄曲霉2348与甘草共发酵，以甘草水提液为培养基成分，柱黄曲霉2348以孢子形式接入培养基。共发酵后的发酵液离心出菌体在真空下浓缩，再喷雾干燥至粉状，经分装胶囊后灭菌制得。
实施例5增效甘草养胃保肝降酯静脉注射制剂的制备本发明所述的一种增效甘草养胃保肝降酯静脉注射制剂的制备方法是一株柱黄曲霉2348甘草共发酵，以甘草水提液为培养基成分，柱黄曲霉2348以孢子形式接入培养基。共发酵后的发酵液离心出菌体在真空下浓缩，用乙酸乙酯回流提取3次，合并提取液，减压浓缩至小体积，上硅胶柱，洗脱，收集并利用薄层色谱法跟踪检测，合并甘草次酸洗脱液，低压浓缩，结晶得甘草次酸粗品。经重结晶得甘草次酸精品。用NaOH注射用溶剂(注射用水，葡萄糖注射液等)溶解甘草次酸至一定浓度。
实施例6甘草抗癌抗病毒、艾滋病口服胶囊制剂本发明所述的一种甘草抗癌抗病毒、艾滋病口服胶囊制剂的制备方法是一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与甘草渣共发酵，以甘草水提后的药渣为培养基成分，青霉4009以孢子形式接入培养基。共发酵后的甘草醇提三次，真空下浓缩，再喷雾干燥至粉状，添加辅料分装胶囊后灭菌制得。
实施例7甘草抗癌抗病毒、艾滋病注射剂本发明所述的一种甘草抗癌抗病毒、艾滋病注射剂的制备方法是一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与甘草共发酵，以甘草水提后的药渣为培养基成分，青霉4009以孢子形式接入培养基。共发酵后的甘草醇提三次，真空下浓缩至小体积，上硅胶柱洗脱，收集并利用薄层色谱法跟踪检测，合并洗脱液，低压浓缩，结晶得异甘草素粗品。经重结晶得异甘草素精品。用NaOH注射用溶剂(注射用水，葡萄糖注射液等)溶解异甘草素至一定浓度。
实施例8发酵产物甘草次酸分离硅胶柱层析法一株柱黄曲霉2348与甘草共发酵，以甘草水提液为培养基成分，发酵后的发酵液离心出菌体再真空下浓缩，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至小体积，上硅胶柱，洗脱，收集并利用薄层色谱法跟踪检测，收集含甘草次酸洗脱液，减压蒸干结晶得甘草次酸。
实施例9发酵产物异甘草素分离硅胶柱层析法一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与甘草水提后的药渣共发酵为培养基成分，发酵后的发酵液离心出菌体再真空下浓缩，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至小体积，上柱，洗脱，收集并利用薄层色谱法跟踪检测，收集含异甘草素洗脱液，减压蒸干结晶得异甘草素。
实例10增效甘草养胃保肝降酯降酯制剂抗炎实验小鼠60只，每组10只。以氢化考的松(氢考)和生理盐水分别为阳性和阴性对照。用灌饲器分别灌饲中药煎剂，每次灌饲体积为每10g体重0.2ml。甘草生药组含量为0.1g/ml。甘草炮制品同剂量组含量为0.1g/ml。低剂量组为0.05g/ml。证明甘草生品对空白组无作用，发酵后低剂量组无作用，阳性对照组和发酵后高剂量有较小作用，发酵后高剂量有较其它各组好的抗炎作用。
实施例11微生物发酵转化牛蒡子小试将牛蒡子于60℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎，以牛蒡子细粉为培养基成分，将其按料水比为3/40调配成带渣培养基，pH自然，以20-40％的装液量装入500ml三角瓶121℃灭菌20min。青霉4009用无菌水配制成每毫升含106个分生孢子的悬浮液以孢子悬液的形式接种，按4-10％(V/V)比例接入带渣液体培养基中，混合均匀后置于摇床震荡培养。发酵最佳条件为温度24-32℃，时间96-154h。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例12微生物发酵转化牛蒡子工业化生产将牛蒡子于60℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎。以牛蒡子细粉为培养基成分，将其按料水比为3-10/40调配成带渣培养基，pH自然，装入发酵罐中蒸汽灭菌20min。青霉4009用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液以孢子悬液的形式接种，按4-10％(V/V)比例接入液体培养基中，搅拌培养。发酵最佳条件为温度24-32℃，时间96-154h。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例13增效牛蒡子抗肿瘤、降血压口服胶囊制剂的制备青霉4009与牛蒡子共发酵，将发酵后的发酵液离心得上清液，在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，添加辅料分装胶囊后照射灭菌制得。
实施例14增效牛蒡子抗肿瘤、降血压口服片剂的制备青霉4009与牛蒡子共发酵，将发酵后的发酵液离心得上清液，在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，添加辅料压片后灭菌制得。
实施例15发酵产物牛蒡子苷元的分离硅胶柱层析法将发酵得到得发酵液离心，收集上清液，上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩至小体积，加入少量硅胶蒸发至干，上硅胶柱，洗脱，利用TLC跟踪检测，合并具有TLC检测中呈单一斑点的洗脱液，低压浓缩，结晶得粗品。经重结晶得牛蒡子苷元纯品。
实施例16增效牛蒡子抗肿瘤、降血压静脉注射制剂的制备将牛蒡子于60℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎，以牛蒡子细粉为培养基成分，将其按料水比为3-10/40调配成带渣培养基，pH自然，装入发酵罐中蒸汽灭菌20min。青霉4009用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液以孢子悬液的形式接种，按4-10％(V/V)比例接入带渣液体培养基中，搅拌培养。发酵最佳条件为温度24-32℃，时间96-154h。将发酵液离心得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩至小体积，加入少量硅胶蒸发至干，上硅胶柱，洗脱，利用TLC跟踪检测，合并具有TLC检测中呈单一斑点的洗脱液，低压浓缩，结晶得粗品。经重结晶得精品，利用常规注射剂制备工艺制备成增效牛蒡子抗肿瘤、降血压静脉注射制剂。
实施例17微生物发酵转化虎杖小试将虎杖于50℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎，以虎杖细粉为培养基成分，将其按固液比例为1∶10-20调配成培养基，pH自然，15磅灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，带渣发酵，发酵最佳条件为温度24-32℃，时间72-154h。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例18微生物发酵转化虎杖工业化生产将虎杖于50℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎，以虎杖粉为培养基成分，将其按固液比例为1∶10-20调配成培养基，pH自然，15磅灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，置于发酵罐中进行大批量发酵带渣发酵。发酵最佳条件为温度24-32℃，时间72-154h。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例19增效虎杖口服胶囊制剂的制备一株青霉4009与虎杖共发酵，以虎杖粉为培养基成分，含水量合适，霉菌以孢子形式接入液态培养基。共发酵后的发酵液，高速离心得上清液。再用水反复洗涤几次，几次离心得的上清液合并在一起。在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，经分装胶囊后用钴60照射灭菌制得。
实施例20增效虎杖静脉注射制剂的制备一株青霉4009与虎杖共发酵，以虎杖粉为培养基成分，含水量合适，霉菌以孢子形式接入液体培养基。共发酵后发酵液60℃旋转蒸发浓缩至一定体积。石油醚(60～90℃)脱脂，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后进行硅胶柱层析。洗脱。定量分批连续接收洗脱液，薄层色谱跟踪检测，合并白藜芦醇洗脱液，低压浓缩，结晶得白藜芦醇纯品。加注射用溶剂(注射用水，葡萄糖注射液等)溶解白藜芦醇至一定浓度。
实施例21作为添加剂添加到化妆品、食品、医药中的应用一株青霉4009与虎杖共发酵，以虎杖粉为培养基成分，含水量合适，霉菌以孢子形式接入液体培养基。共发酵后发酵液60℃旋转蒸发浓缩至一定体积。石油醚(60～90℃)脱脂，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后进行硅胶柱层析。洗脱。定量分批连续接收洗脱液，薄层色谱跟踪检测，合并白藜芦醇洗脱液，低压浓缩，结晶得白藜芦醇纯品。按需要加溶剂溶解至不同浓度，添加到化妆品、食品、医药中。
实施例22微生物发酵转化栀子小试将购买的栀子于60℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎，以栀子粉含量为5-10％的浓度配置成液态发酵带渣培养基，121灭菌20min，孢子接种，500ml三角瓶装液量100-200ml，转速140-180rpm，温度24-35℃，培养时间96-154h。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例23微生物发酵转化栀子工业化生产将购买的栀子于60℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎。以栀子果粉为培养基成分，将其调配成含水量20-70％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，115℃灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按4-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，在50*50cm的培养槽中，混合均匀后置于立式培养箱发酵大批量栀子粉，每次可达到1公斤的发酵量。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例24增效栀子保肝制剂口服胶囊制剂的制备一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与川栀子共发酵，以栀子果粉为培养基成分，含水量20-70％(v/w)，青霉4009以孢子形式接入固态培养基。共发酵后的固态培养基60℃烘干得粉末。用水充分提取三次，高速离心得上清液，合并三次上清液。在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，经分装胶囊后灭菌制得。
实施例25发酵产物京尼平分离硅胶柱层析法取干燥的发酵后栀子粉100g，石油醚(60～90℃)脱脂，用氯仿回流提取3次，合并提取液，减压浓缩至小体积，上硅胶柱，石油醚洗脱，利用TLC跟踪检测，合并具有TLC检测中呈单一斑点的洗脱液，低压浓缩，结晶得粗品。经重结晶得精品。
实施例26增效栀子保肝制剂静脉注射制剂的制备一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与川栀子共发酵，以栀子果粉为培养基成分，含水量20-70％(v/w)，青霉4009以孢子形式接入固态培养基。共发酵后的固态培养基60℃烘干得粉末。取干燥的发酵后栀子粉100g，石油醚(60～90℃)脱脂，用氯仿回流提取3次，合并提取液，减压浓缩至小体积，上硅胶柱，洗脱，收集并利用薄层色谱法跟踪检测，合并京尼平洗脱液，低压浓缩，结晶得京尼平纯品。加注射用溶剂(注射用水，葡萄糖注射液等)溶解京尼平至一定浓度。
实施例27增效栀子保肝制剂抗炎实验小鼠60只，每组10只。以氢化考的松(氢考)和生理盐水分别为阳性和阴性对照。用灌饲器分别灌饲中药煎剂，每次灌饲体积为每10g体重0.2ml。药物剂量按每公斤体重为《中华人民共和国药典》规定临床用量的20倍进行。栀子生药组含量为0.15g/ml。栀子炮制品同剂量组含量为0.15g/ml。低剂量组为0.03g/ml。证明栀子生品对空白组无作用，发酵后低剂量组无作用，阳性对照组和发酵后高剂量有较小作用，发酵后中剂量有较其它各组好的抗炎作用。
实施例28增效栀子保肝制剂镇痛实验对醋酸诱发的小鼠扭体反应的作用。小鼠60只，每组10只。分组同上。阳性对照样为阿司匹林。给药60min后，ip0.6％醋酸溶液0.1mL/10g，记录15min内小鼠扭体数，与模型组比较，求出减少百分率，并进行t检验。试验结果中，生品对空白组有一定的镇痛作用，但是无显著性差异，而发酵后高剂量组则对空白有显著性的镇痛作用。
实施例29微生物发酵转化商陆小试将商陆洗净于60℃下干燥，粉碎，以商陆根粉为培养基成分，将其调配成含水量30-65％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，121℃灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含106个分生孢子的悬浮液，按4-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，混合均匀后置于恒温培养箱培养。发酵条件为温度24-32℃，时间72-144h。此发酵工艺能使苷的转化率达到9O％以上。
实施例30微生物发酵转化商陆工业化生产将购买的商陆于60℃下干燥，粉碎。以商陆根粉为培养基成分，将其调配成含水量30-65％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，121℃灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按4-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，在50*50cm的培养槽中，混合均匀后置于立式培养箱发酵大批量商陆粉。高压液相色谱显示，此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例31无毒增效商陆怯痰止咳胶囊制剂的制备一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与商陆共发酵，以商陆根粉为培养基成分，含水量30-65％(v/w)，青霉4009以孢子形式接入固态培养基。共发酵后的固态培养基60℃烘干得粉末。用水充分提取三次，高速离心得上清液，合并三次上清液。在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，经分装胶囊后灭菌制得。
实施例32微生物发酵转化远志小试将远志洗净于60℃下干燥，粉碎，以远志粉为培养基成分，将其调配成含水量40-70％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，121℃灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按5-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，混合均匀后置于恒温培养箱培养。发酵条件为温度28-30℃，时间96-144h。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例33微生物发酵转化远志工业化生产将远志于60℃下干燥，粉碎，以远志粉为培养基成分，将其调配成含水量40-70％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，121℃灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按4-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，在50*50cm的培养槽中，混合均匀后置于立式培养箱发酵大批量商陆粉，每次可达到1公斤的发酵量。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例34增效远志胶囊制剂的制备方法一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与共发酵，以商陆根粉为培养基成分，含水量40-70％(v/w)，青霉4009以孢子形式接入固态培养基。共发酵后的固态培养基60℃烘干得粉末。用水充分提取三次，高速离心得上清液，合并三次上清液。在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，经分装胶囊后用灭菌制得。
实施例35微生物发酵转化葛根小试将葛根洗净于60℃下干燥，粉碎，以葛根粉为培养基成分，将其调配成含水量30-65％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，121℃灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按2-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，混合均匀后置于恒温培养箱培养。发酵条件为温度28-30℃，时间96-144h。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例36微生物发酵转化葛根工业化生产将购买的葛根于60℃下干燥，粉碎，以葛根粉为培养基成分，将其调配成含水量30-65％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，121℃灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按2-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，在50*50cm的培养槽中，混合均匀后置于立式培养箱发酵大批量商陆粉，每次可达到1公斤的发酵量。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例37增效葛根胶囊制剂的制备方法一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与共发酵，以葛根粉为培养基成分，含水量20-65％(v/w)，青霉4009以孢子形式接入固态培养基。共发酵后的固态培养基60℃烘干得粉末。用水充分提取三次，高速离心得上清液，合并三次上清液。在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，经分装胶囊后用灭菌制得。
实施例38发酵产物葛根素分离硅胶柱层析法取干燥的发酵后葛根粉100g，石油醚(60～90℃)脱脂，用乙酸乙酯回流提取3次，合并提取液，减压浓缩至小体积，上硅胶柱，洗脱，利用TLC跟踪检测，合并具有TLC检测中呈单一斑点的洗脱液，低压浓缩，结晶得粗品。经重结晶得精品。
实施例39微生物发酵转化山药小试将购买的山药洗净于60℃下干燥，粉碎 以山药根粉为培养基成分，将其调配成含水量40-80％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，121℃灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按4-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，混合均匀后置于恒温培养箱培养。发酵条件为温度24-32℃，时间72-144h。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例40微生物发酵转化山药工业化生产将购买的山药于60℃下干燥，粉碎，以山药根粉为培养基成分，将其调配成含水量40-80％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，121℃灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按4-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，在50*50cm的培养槽中，混合均匀后置于立式培养箱发酵大批量商陆粉，每次可达到1公斤的发酵量。此发酵工艺能使苷的转化率达到90％以上。
实施例41薯蓣皂苷元分离纯化硅胶柱层析法取干燥的发酵后山药粉100g，用乙酸乙酯回流提取3次，合并提取液，回收溶剂，浓缩静置，析出晶体，离心干燥后得到粗薯蓣皂苷元。最后在乙醇中重结晶得到薯蓣皂苷元纯品。
实施例42微生物发酵转化黄芩小试黄芩干粉10g以1∶10-20的水比混匀，250ml三角瓶10-20％装量，15p灭菌20min。冷却后，接种柱黄曲霉2348孢子悬液2-5ml至发酵瓶，24-32℃发酵3-6天。
实施例43微生物发酵转化黄芩中试取黄芩干粉10kg，以1∶10-20水比混匀，装罐，15p蒸汽灭菌20min，接种柱黄曲霉孢子悬液2-5ml至发酵瓶，24-32℃发酵3-6天。
实施例44黄芩素的分离提取分离将发酵得到得发酵液离心，收集上清液，上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩至小体积，上聚酰胺柱，洗脱，利用TLC跟踪检测，合并具有TLC检测中呈单一斑点的洗脱液，低压浓缩，结晶得粗品。经重结晶得黄芩素纯品。
实施例45增效黄芩抗病毒注射剂制备将发酵得到得发酵液离心，收集上清液，上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩至小体积，上聚酰胺柱，洗脱，利用TLC跟踪检测，合并具有TLC检测中呈单一斑点的洗脱液，低压浓缩，结晶得粗品。经重结晶得黄芩素纯品，制备成增效黄芩注射剂。
实施例46黄芩抗肿瘤片剂取黄芩干粉10kg，以1∶10-20水比混匀，装罐，15p蒸汽灭菌20min，接种柱黄曲霉孢子悬液2-5ml至发酵瓶，24-32℃发酵3-6天。
将发酵得到得发酵液离心，收集上清液，上清液用乙酸乙酯萃取，浓缩，使黄芩素沉淀析出，得黄芩素粗品，加辅料压片成黄芩片剂。
实施例47防治糖尿病并发肾病等并发症的黄芩胶囊制剂取黄芩干粉10kg，以1∶10-20水比混匀，装罐，15p蒸汽灭菌20min，接种柱黄曲霉孢子悬液2-5ml至发酵瓶，24-32℃发酵3-6天。将发酵得到的发酵液离心，收集上清液，上清液用乙酸乙酯萃取，浓缩，使黄芩素沉淀析出，得黄芩素粗品，加辅料分装后灭菌成黄芩胶囊。
实施例48增效黄芩制剂抗肿瘤药效实验取黄芩发酵前后提取物，各分为高、中、低三个浓度，试验体外对肉瘤细胞、肝癌细胞等癌细胞的抑制作用，结果显示增效黄芩制剂抗肿瘤活性明显高于发酵前样品。具有开发成为抗癌药物的广泛前景。
结果发酵后样品对肿瘤抑制率约80％，高于发酵前样品。
台盼蓝拒染法检测发酵前后样品作用于肿瘤细胞的数据(x±s)
注高浓度相当于1g药材/ml，中浓度0.5g药材/ml，低浓度0.1g药材/ml。
实施例49微生物发酵转化大黄小试将大黄于50℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎，以大黄细粉为培养基成分，将其按固液比例为1∶10-15调配成培养基，pH自然，15磅灭菌20min。霉菌以孢子形式接种，带渣发酵，发酵最佳条件为温度24-32℃，时间72-144h。
实施例50微生物发酵转化大黄工业化生产将大黄于50℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎以大黄粉为培养基成分，将其按固液比例为1∶10-15调配成培养基，pH自然，15磅灭菌20min。霉菌以孢子形式接种，置于发酵罐中进行大批量带渣发酵。发酵最佳条件为温度24-32℃，时间72-144h。
实施例51大黄增效消炎口服胶囊制剂的制备本发明所述的一种大黄增效消炎口服胶囊制剂的制备方法是取一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与大黄粉末共发酵，料水比为15-20/200(m/l)，以大黄为营养成分，将黑曲霉以孢子形式接种。发酵72-144h后，将发酵液10000rpm离心10min，取上清液，在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，经分装胶囊灭菌制得。
实施例52大黄消炎口服液的制备本发明所述的一种大黄消炎口服液的制备方法是取国产掌叶大黄根、茎60℃烘干打粉，加入10倍水量10磅灭菌15分钟，按照2-5％的接种量接种孢子悬液(孢子浓度为1×106)。进行带渣发酵24-32℃发酵72-144h，将发酵液离心10min，取上清液，在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，分装后灭菌制得。
实施例53微生物发酵转化柴胡小试将柴胡于50℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎，以柴胡细粉为培养基成分，将其按固液比例为1∶10-15调配成培养基，pH自然，15磅灭菌20min。霉菌以孢子悬液形式接种，带渣发酵，发酵最佳条件为温度24-32℃，时间72-144h。
实施例54微生物发酵转化柴胡工业化生产将柴胡于50℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎。以柴胡粉为培养基成分，将其按固液比例为1∶10-15调配成培养基，pH自然，15磅灭菌20min。霉菌以孢子悬液形式接种，置于发酵罐中进行大批量带渣发酵。发酵最佳条件为温度24-32℃，时间72-144h。
实施例55增效柴胡皂苷元消炎胶囊的制备取一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与柴胡细粉水混浊液共发酵，料水比为15-25/200(m/l)，以柴胡细粉为营养成分，将黑曲霉以孢子形式接入柴胡细粉水混浊液培养基。共发酵72-144h后，将发酵液离心10min，取上清液，在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，经分装胶囊后灭菌制得。
实施例56增效柴胡镇痛抗炎静脉注射制剂的制备一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与柴胡共发酵，以柴胡为培养基成分，含水量30-70％(v/w)，以孢子形式接入固态培养基。共发酵后的固态培养基60℃烘干得粉末。取干燥的发酵后柴胡粉100g，石油醚(60～90℃)脱脂，用乙酸乙酯回流提取3次，合并提取液，减压浓缩至小体积，上硅胶柱，洗脱，收集并利用薄层色谱法跟踪检测，合并柴胡皂苷元洗脱液，低压浓缩，结晶得柴胡皂总苷元，制备成增效柴胡镇痛抗炎静脉注射剂。
实施例57微生物发酵转化杜仲小试将杜仲打成粉，以杜仲粉为培养基成分，将其调配成含水量40-90％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，115℃灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按4-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，混合均匀后置于恒温培养箱培养96-154h。
实施例58微生物发酵转化杜仲实施例将杜仲打成粉，以杜仲粉的水提液为培养基成分，调成浓度为10-25％(v/w)的液体培养基，pH自然，装罐，蒸汽灭菌20min。青霉4009以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含107个分生孢子的悬浮液，按4-8％(V/W)比例接入液态发酵培养基中，混合均匀后置于摇床培养。
实施例59增效杜仲胶囊制剂的制备一株产β-葡萄糖苷酶的青霉4009与杜仲共发酵，以杜仲粉及其提取液为培养基成分，青霉4009以孢子形式接入液态培养基。共发酵后的得到发酵液，发酵残渣用水充分提取三次，高速离心得上清液，合并三次上清液和发酵液。在30～50℃低温和真空度为50～80Kpa的真空下浓缩，浓缩至浓度为40～70％，再喷雾干燥至粉状，制备成胶囊。
权利要求
1.微生物发酵转化含苷类中药的方法，其特征在于它是将含苷类中药粉碎后，按照料量以一定水比配制后，于115-121℃下灭菌10-20min，冷却后，接种微生物菌种发酵，利用微生物发酵生成的相应酶类作用于中药中所含的苷类物质，使其脱去葡萄糖转化为相应的苷元，最后终止发酵，用相应有机溶剂从发酵品中溶出得苷元粗品，再用硅胶柱层析、溶剂重结晶和/或萃取法对苷元进行纯化，得苷元纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述菌株为青霉，其保藏编号为4009；或柱黄曲霉，其保藏编号为2348。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述青霉菌种4009发酵的种子斜面为琼脂粉1.6％、土豆20％、葡萄糖2％、pH自然。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述柱黄曲霉2348发酵的种子斜面为硝酸钠0.2％、磷酸氢二钾0.1％、氯化钾0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、蔗糖3％、琼脂粉20％，PH自然。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述含苷类中药中的牛蒡子、栀子、商陆、虎杖、大黄、三七、柴胡、葛根、远志、杜仲、山药、芍药等是经青霉4009产生的β-葡萄糖苷酶水解其中的苷产生相应的苷元。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述含苷类中药中的甘草、黄芩等是经柱黄曲霉2348产生的葡萄糖醛酸酶水解其中的苷产生相应的苷元。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述菌种与含苷类中药粉末共发酵的方法包括方法1液体带渣培养将中药烘干后粉碎，以料水比5-20/100配制培养基，pH自然。按10-30％的装液量分装入三角瓶中，115-121℃灭菌10-20min，菌种用无菌水配制成每毫升含106-8个分生孢子的悬浮液，以孢子悬液的形式按5-10％(V/W)比例接入培养基，震荡培养。本方法菌种与中药粉末共发酵的培养温度是26-30℃，摇床转速160-200rpm，培养时间96-120h。方法2中药煮提液发酵将中药按料水比1∶10回流煮提3次，每次1h，合并煮提液，低速离心去除煮提液中的残渣，将上清液按照20-40％的装液量分装入500ml三角瓶，115-121℃灭菌15-20min，菌种用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，以孢子悬液的形式按3-10％(V/W)比例接入培养基，震荡培养。本方法菌种与中药共发酵的培养温度是26-30℃，摇床转速140-220rpm，培养时间72-96h。方法3固体发酵将中药于60℃下干燥，干燥品水分含量为6.9％，粉碎，过20目筛。以中药粉为培养基成分，将其调配成含水量30-70％(v/w)的湿粉培养基，pH自然，115-121℃灭菌20min。菌种以孢子形式接种，用无菌水配制成每毫升含108个分生孢子的悬浮液，按2-10％(V/W)比例接入固态发酵培养基中，在50*50cm的培养槽中，混合均匀后置于立式培养箱发酵培养。本方法菌种与中药共发酵的培养温度是24-32℃，培养时间96-154h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述苷元纯化的具体方法包括方法1终止发酵后取滤液，用相应有机溶剂从滤液中萃取得苷元粗品，含量达45％。再用硅胶柱层析和溶剂重结晶对苷元进行纯化，得苷元纯品。方法2取发酵后中药，低温烘干后，加入2-3倍体积60-80％乙醇，回流提取两次，每次1h，合并提取液，减压回收乙醇，得浸膏，浸膏用相应有机溶济萃取得苷元粗品，含量一般为40％左右。再经硅胶柱层析和溶剂重结晶法得相应苷元纯品。
9.微生物发酵转化含苷类中药的相应苷元制剂制备的方法，其特征在于将苷元纯品或苷元含量为30％的粗品，按制剂学上的通用方法制成各种剂型，包括片剂、胶囊、注射剂。
全文摘要
本发明公开了一种利用微生物发酵产酶，将含苷类中药中的苷类物质转化为苷元以及相关苷元制剂的制备方法，它是将含苷类中药粉碎后，按照料量以一定水比配制后，于115－121℃下灭菌10－20min，冷却后，接种微生物菌种发酵，脱去糖转化为相应的苷元，最后终止发酵，用相应有机溶剂从发酵品中溶出得苷元粗品，再经纯化得苷元纯品，最后将得到的苷元，按制剂学上的通用方法制成各种剂型，包括片剂、胶囊、注射剂等。本发明克服了传统的化学法引起的对苷类物质结构和构型的改变，简化了酶解法工艺过程及转化过程，提高了转化效率和溶出率，所配制剂吸收快，用量小，毒性低、作用迅速、生物利用度高。
文档编号C12P1/02GK1687429SQ20051002076
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月21日 优先权日2005年4月21日
发明者孙启玲, 邹文铨, 白家峰, 何晨, 薛慧玲, 米坤, 陈智, 陈永强, 王永宏, 田天丽, 阳泰, 霍蕾, 徐非一, 王嫱 申请人:四川大学