专利名称：一种基质表达T.fusca角质酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种基质表达T. fusca角质酶的方法，属于生物工程技术和酶工程领域。
背景技术：
角质酶是一种多功能酯酶，既可催化水解不溶性多聚物角质和各种聚酯的酯键，也可以作用于其它长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等。除了水解反应外，角质酶还能催化酸与醇的酯化、一些脂肪酸盐与醇的转酯化。因此角质酶在食品工业、化工工业及纺织工业等诸多领域均有广泛用途。目前研究者对真菌角质酶中的Fusariumsolani角质酶进行了深入的研究,包括晶体结构解析、分子改造和闻效表达等各个方面。其中关于制备研究尚处在实验室阶段，主要集中于野生菌的培养条件优化以及在不同的基因工程宿主细胞(如酵母、大肠杆菌、曲霉属和镰刀菌属)中进行高效表达、优化生产工艺等方面的研究，但由于存在基因工程异源表达时表达量较低和稳定性较差的问题，并且生产成本较高，至今为止没有实现工业化生产，同时真菌角质酶本身存在热稳定性差的缺点，不能适合纺织工业的高温处理环境。
与真菌角质酶相比，细菌角质酶具有催化效率高、环境适应能力强、基因工程异源表达技术成熟等方面的优势。但是迄今为止国内外关于细菌角质酶的报道很少，仅有的报道集中在产角质酶菌种的筛选、发酵条件优化和粗酶性质研究等方面。本课题组前期工作中鉴定了嗜热放线菌Thermobifida fusca角质酶的基因,通过酶学定性和应用效能评价表明其非常适合纺织工业应用。采用大肠杆菌外源重组蛋白分泌表达中应用最普遍的I型和
II型分泌途径进行了 T. fusca角质酶的克隆表达和高效分泌研究，其中I型途径经过发酵条件优化，在3L发酵罐上胞外产量达到700-750U/mL，生产强度约为22. 6U/mL/h,为目前角质酶生产中的最高水平。前期工作中还发现T. fusca角质酶具有磷脂酶的水解活性，本发明将成熟的角质酶基因在大肠杆菌中克隆表达，通过角质酶对细胞膜磷脂的有限水解作用使细胞膜通透性增强，进而使得角质酶释放至培养基中，实现基质表达。
发明内容
本发明提供了一种基质表达T. fusca角质酶的方法，其特征在于，将NCBI编号为AAZ54921的T. fusca角质酶成熟蛋白基因在大肠杆菌中诱导表达，诱导培养并收集发酵上清液。为解决上述技术问题，具体方法为I)由本研究室前期构建的Tfu_0883/pET_20b(+)为模板，PCR扩增得到角质酶成熟蛋白基因，连接表达载体，得到重组质粒Tfu_0883/pET20b(+)NS ；2)含有重组质粒Tfu_0883/pET20b (+)NS导入宿主大肠杆菌，构建生产角质酶的基因工程菌；
3)步骤2)构建的重组大肠杆菌经诱导培养，收集发酵上清液。所述宿主菌可以为E.coli BL21(DE3)、Ε· coli W3110、E. coli JM109、Ε· coliJM109(DE3)、Ε· coli DH5 α 等，其中优选 E.coli BL21(DE3)。所述携带角质酶和目标蛋白的载体为pUC系列，pET系列，pT7-7，pGEX等任意一种。
图I重组大肠杆菌摇瓶发酵生产角质酶的过程曲线图■，DCW; □，培养基中角质酶酶活图2重组大肠杆菌生产角质酶的SDS-PAGE分析
1，蛋白质分子量标准；2，发酵液上清；3，细胞破壁上清；4，细胞破壁沉淀图3重组大肠杆菌3L发酵罐生产角质酶过程曲线图■，DCW; □，培养基中角质酶酶活
具体实施例方式实施例I :重组质粒的构建根据T. fusca角质酶成熟蛋白基因(NCBI编号AAZ54921)，设计引物Pl，P2。Pl :5’ -gTAATCCATATggCCAACCCCTACgAgCgC-3 含有 NdeI 酶切位点P2 :5’ -AgAgMTTCgggAACgggCAggTggAgCg-3 含有 EcoRI 酶切位点利用上述引物，以本研究室前期构建的Tfu_0883/pET_20b (+)为模板，PCR扩增得到角质酶成熟蛋白基因，反应在50μ L体系中进行。反应条件为94°C预变性4min ;随后进行30个循环(980C 10s，60°C 5s, 72°C lmin) ;72°C延伸IOmin ;最后4°C保温。扩增得到的PCR片段，经胶回收后，与pMD18-T simple载体连接，并将连接产物转化至E. coli JM109，转化产物涂布于LB-Amp固体平板，经37°C培养过夜，平板上挑取单菌落，接入LB液体培养基，8h后抽提质粒并测序。将测序结果正确的质粒和pET_20b(+)分别经Nde I和EcoR I双酶切(Nde I为pET-20b (+)载体固有的信号肽pelB上游的酶切位点)后割胶回收，用T4连接酶16°C连接过夜。连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，涂布LB-Amp固体平板。经37°C培养过夜，挑选转化子在LB-Amp液体培养基中培养，8 IOh后提取质粒，得到富集的Tfu_0883/pET-20b (+)NS。实施例2 :重组角质酶的摇瓶发酵将获得的重组质粒Tfu_0883/pET-20b (+)NS转入感受态细胞E. coli BL21 (DE3)，在LB-Amp的固体培养基上培养过夜，挑单菌落于LB-Amp的液体培养基生长至对数生长后期，按5%接种量接种到TB液体培养基(含100 μ g/mLAmp)，37°C培养2h后，加入终浓度为5g/L的乳糖并降温至25°C诱导培养。如图I所示，在发酵前期，重组菌正常生长，培养基中角质酶酶活很低，当诱导12h之后，培养基中角质酶酶活逐渐上升，当诱导24h时，培养基中酶活达到最高，为204. 8U/mL，胞内仅为10. lU/mL，表明角质酶几乎全部“分泌”至胞外。SDS-PAGE显示培养基中有明显的约31kDa的条带，与角质酶分子量一致，且无大量的杂蛋白，而胞内目的蛋白量极少(图2)。
实施例3 :重组角质酶的分批补料发酵在摇瓶发酵的基础上，进一步在3L发酵罐上进行了发酵放大实验。采用指数流加法控制补料速度以达到重组菌的高密度发酵。当初始碳源(甘油)在发酵6h左右基本消耗完时，指数流加补料液，控制比生长速率μ = O. 251Γ1。当菌浓OD6tltl达到50时，以O. 的流速流加乳糖进行诱导。如图3所示，在诱导9小时后胞外酶活快速上升，最终酶活为1063U/mL,是摇瓶发酵的5. 2倍，生产强度为44. 2U/mL/h,是前期I型分泌途径生产强度的
I.9倍，为国内外报道的最高水平。3L发酵罐中角质酶高产量的获得表明该种角质酶的生产方式可以实现角质酶的高效制备，具备工业化生产的潜力。
权利要求
1.一种基质表达T. fusca角质酶的方法，其特征在于，将NCBI编号为AAZ54921的T. fusca角质酶成熟蛋白基因在大肠杆菌中表达，发酵培养并收集发酵上清液。
2.权利要求I所述的方法，其特征在于，具体方法为 1)将T.fusca角质酶成熟蛋白基因克隆到pET-20b(+)，构建无信号肽角质酶的重组质粒 Tfu_0883/pET-20b(+)NS ； 2)将重组质粒Tfu_0883/pET-20b(+)NS导入宿主大肠杆菌； 3)步骤2)构建的无信号肽角质酶重组菌进行发酵，收集发酵上清液。
3.权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110.E. coli JM109、E.coli JM109 (DE3)、E. coli DH5 α 等中任意一种。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述携带角质酶的载体为pUC系列，pET系列，pT7-7,或pGEX等中的任意一种。
全文摘要
本发明涉及一种基质表达T.fusca角质酶的方法，属于生物工程技术和酶工程领域。本发明由本研究室前期构建的Tfu_0883/pET-20b(+)为模板，PCR扩增得到角质酶成熟蛋白基因，连接表达载体，转化E.coli宿主菌，实现了角质酶的基质表达。摇瓶发酵中，经过诱导重组角质酶在培养基中的酶活达到204.8U/mL，为总酶活的95.3％。进一步在3L发酵罐中放大培养，最终酶活为1063U/mL，是摇瓶发酵的5.2倍，生产强度为44.2U/mL/h，为国内外报道的最高水平。
文档编号C12R1/19GK102899298SQ20121024142
公开日2013年1月30日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者吴敬, 宿玲恰, 陈晟, 陈坚 申请人:江南大学