一种采用两步脂肪酶催化法制备结构甘油酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及采用两步脂肪酶催化法制备结构甘油酯的方法。
【背景技术】
[0002]多年以来，关于结构甘油酯的研究一直是油脂改性领域的研究重点内容，特别是开发富含ω-3脂肪酸的结构甘油酯，其功能具有促进婴幼儿生长发育、增强人体免疫力、抗肿瘤和炎症等方面的生物学功能。当前，油脂的改性技术有油脂分提技术、氢化技术和酯交换技术。酯交换技术，尤其是酶法改性油脂技术，以新型绿色环保、经济高效而日渐成为油脂改性的一个主要应用技术。与化学法改性油脂相比，酶法改性油脂具有高效、专一、反应条件温和、副产物少等优点，是应用于工业化生产的首选技术。欧美、日本等发达国家在油脂改性及其工业化应用的研究一直处于领先地位(Camila A.Palla et 2014;Aditya et al, 2014; Lalit Mohan Negi et al, 2014) 0 Zou 和 Akoh(Zou and Akoh, 2013)通过两步法优化结构性油脂，即(I)通过Novozym435将富含亚麻油酸大豆油和软脂酸甘油酯进行酯交换生成富含亚麻油酸的结构型油脂(NSL) ;(2)以Lipozyme TL IM作为催化剂通过酸解催化NSL使其结合DHA形成富含DHA的NSL。丹麦技术大学Xuebing Xu教授长期利用不同脂肪酶对不同油源的多不饱和脂肪酸进行改性，并利用平膜反应器、填充床式反应器等反应器实现中小试生产规模(Xu et al, 1998, 2000, 2002;Ratchapol Pawongrat etal, 2007; Kahveci et al, 2011; Xu et al, 2012; Wang et al, 2012) 0 Maryam Khodadadi等(Maryam Khodadadi et al, 2014a, b)人利用脂肪酶催化酯交换改性亚麻油和三辛酰甘油生产MLM-和MML-结构性甘油酯，并建立催化过程中的催化动力学模型。
[0003]富含ω-3脂肪酸的结构甘油酯产品正得到消费者的青睐。我国的动植物油的开发和应用正蓬勃发展，目前，已开发出结构型单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油、磷脂等，在食品、饲料、工业、医药等领域有广泛应用前景。我国在油脂改性领域的研究相对较晚，处于实验室和小试阶段的研究，主要开展脂肪酶的筛选、反应介质、改造脂肪酶的分子结构等内容的研究。如，华南理工大学Li等人(Li et al, 2010)以高含量油酸的葵花油和完全氢化大豆油为底物，利用脂肪酶酯交换催化零反式脂肪酸油脂。国家粮食局Wang等(Wang eta人2012)人得出了 Lipozyme RM頂催化菜籽油和辛酸生产MLM结构脂的最佳条件。北京大学Wen等(Wen et al, 2013)人通过易错PCR定向技术改造脂肪酶以提高其热稳定性和延长半衰期。大连科技大学Yang等(Yang et al, 2014)人研究利用sn_l, 3特异性脂肪酶在填充床式反应器中酯交换催化大豆油制备中链三酰甘油的工艺参数。近年来，国内市场对含有结构性甘油酯的食品的需求越来越大，目前主要通过进口来满足市场的需求。2014年上半年，我国进口奶粉达68.12万吨，其中OPO结构脂奶粉约占20%。
[0004]我国开发结构性甘油酯面临两个困难:(I)油源的供应量和安全性。现阶段，我国主要靠进口鱼油开发功能性脂类。2013年我国鱼油进口达65540吨。鱼油的供应量直接影响国内在结构甘油酯的开发和生产。已有大量研究表明，藻油富含ω-3脂肪酸，其含量比鱼油更高，被称为“黄金油”。同时，由于海洋污染日益严重，从而使人们对养殖海洋和野生海鱼所提取鱼油的安全性产生质疑。因此，利用富含ω-3脂肪酸的藻油开发结构性油脂可以克服当前国内对进口鱼油及其安全性的制约。(2)结构甘油酯的制备率低。虽然酶法改性油脂获得结构甘油酯具有许多优点。但在工业化生产方面仍受到限制，如反应时间长、转化率不高、酶活性降低，最终使生产的结构甘油酯的稳定性降低。当前，研究者利用固定化酶、分子生物学定向进化脂肪酶、开发高转化率的催化介质、研发新型的反应器等方式提高产物的转化率及其稳定性。
[0005]本发明的目的就是以富含ω-3脂肪酸的藻油为原料，利用绿色环保的两步脂肪酶催化法制备稳定性强、纯度高的结构甘油酯。
[0006]为实现本发明的目的而采用的技术方案和步骤是:
1、藻油萃取
称取一定量的微藻藻粉，以有机溶剂作为萃取剂，利用加速溶剂萃取仪翠取藻油。萃取温度为40?125°C，萃取时间20?90min，重复萃取2?5次。萃取结束后将萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油。
[0007]本发明所述的有机溶剂是指氯仿、正己烷、乙醇或甲醇。
[0008]本发明所述的微藻，是指裂殖壶藻、等鞭金藻、寇式隐甲藻、微绿球藻、绿色巴夫藻、布朗葡萄藻、三角褐指藻、菱形藻、小球藻、栅藻或杜氏藻。
[0009]本发明所述的微藻藻粉中加入有机溶剂，其比例为微藻藻粉(m):有机溶剂(V) =1:15 ?45ο
[0010]2、富含ω-3脂肪酸的三酰甘油的分离
色谱柱加入己烷，同时加入SOg硅胶，然后将步骤I得到的藻油加入到色谱柱中；
用500mL正己烷-乙醚洗脱色谱柱，分离去除非极性组分的油脂。其中正己烷-乙醚中正己烷:乙醚的体积比为90:5 ;
用100mL正己烷-乙醚洗脱色谱柱分离获得富含ω-3脂肪酸的三酰甘油，其中正己烷-乙醚中正己烧:乙醚的体积比为90:10。
[0011]3、新型结构甘油脂的制备
3.1富含ω -3脂肪酸的2-单甘脂混合物的制备
利用上述提取的富含ω-3脂肪酸的三酰甘油与乙醇进行混合，同时加入脂肪酶和少许水，得到富含ω-3脂肪酸的2-单甘脂混合物。控制反应温度在25?55°C之间，搅拌速度为60?300r/min，反应6?48 h后得到富含ω-3脂肪酸的2-单甘脂混合物，其中三酰甘油和乙醇的质量比为1:0.5?4 ;脂肪酶的用量占三酰甘油质量的3?20% ;加水量占三酰甘油和乙醇总质量的2?13%。
[0012]上述步骤中所述的脂肪酶为Lipozyme TL ΙΜ，购自丹麦诺维信公司。
[0013]3.2富含ω-3脂肪酸的2_单甘脂提纯
将步骤3.1制备得到的富含ω-3脂肪酸的2-单甘脂混合物与食品级正己烷按照1:9的体积份比例混合，经3次萃取，收集乙醇相，旋转蒸发去除乙醇后获得富含ω -3脂肪酸的2-单甘脂。
[0014]3.3新型结构脂的制备。
[0015]将富含ω-3脂肪酸的2-单甘脂与短中链脂肪酸进行混合，加入脂肪酶，控制反应温度在40?80°C之间，反应时间在6?48 h之间，得到本发明所述的2位为ω -3脂肪酸、1，3位为短中链脂肪酸的新型结构脂。
[0016]所述的2-单甘脂和短中链脂肪酸的混合，是按照2-单甘脂和短中链脂肪酸的摩尔比1:1?3进行的。
[0017]上述步骤中所述的脂肪酶是指Novozym 435、Lipozyme TL IM或Lipozyme RM IM,购自丹麦诺维信公司。
[0018]所述的加入脂肪酶，其用量为2-单甘脂和短中链脂肪酸混合后总质量的5-30 %。
[0019]所述的短中链脂肪酸是指辛酸、月桂酸或油酸。
[0020]本发明的优点:
1、采用本发明所述的工艺条件，短中链脂肪酸的交换率达到90%以上，新型结构脂中ω-3脂肪酸的含量可达40-70 %。
[0021]2、该方法具有绿色环保、短时高效地制备抗氧化性强和纯度高的富含2位为ω-3脂肪酸的新型结构脂；
3、该方法制得的新型结构脂无鱼腥味，可满足各年龄阶层人群需求；
4、本发明所用到的脂肪酶，可以重复再利用多次，显著降低生产成本，达到规模化生产要求。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
1、藻油萃取。
[0023]称取1g裂殖壶藻藻粉，加入300mL正己烷与乙醇的混合液，利用加速溶剂萃取仪提取藻油，萃取条件为:温度60°C、重复提取4次、处理时间60min。提取结束后将提取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油。正己烷与乙醇的混合液中正己烷:乙醇的配制体积比为1:2。
[0024]2、不同成分藻油的分离
色谱柱加入己烷，同时加入SOg硅胶，然后将步骤I得到的藻油加入到色谱柱中；
用500mL正己烷-乙醚洗脱色谱柱分离去除非极性组分的油脂，其中正己烷:乙醚的体积比为90:5 ；
用100mL正己烷-乙醚洗脱色谱柱分离获得富含ω-3脂肪酸的三酰甘油，其中正己烷:乙醚的体积比为90:10。
[0025]3、新型结构甘油脂的制备
3.1富含ω -3脂肪酸的2-单甘脂混合物的制备
利用上述提取得到富含ω-3脂肪酸的三酰甘油与乙醇进行混合，同时加入脂肪酶催化反应制备富含ω-3脂肪酸的2-单甘脂混合物，反应条件为:三酰甘油和乙醇的质量比为1:3、反应温度25°C、脂肪酶L