一种复合双酶同步提取北虫草多糖的方法及在加工北虫草饮料中的应用与流程

本发明涉及一种真菌多糖的提取方法，特别是涉及一种复合双酶同步提取北虫草多糖的方法及在加工北虫草饮料中的应用，属于高新技术加工领域。

背景技术：

王普等通过虫草多糖的化学结构重点研究虫草多糖药理活性尤其是抗肿瘤、降血糖、对肝脏和肾功能的保护作用,以及免疫调节作用，提出虫草多糖可应用到食品中，对人体健康起到重大作用。何建丽等对虫草中功能成分，虫草酸、虫草素、虫草多糖、甾醇、超氧化物歧化酶等检测方法进行研究、总结，可将其应用于虫草食品的质量监控和开发。刘春泉等研究北虫草多糖提取和分离纯化，通过研究其结构来明确其功能因子和作用机理，对北虫草多糖的应用产生重要影响。朱培欣研究虫草多糖对免疫活性、体外抗癌活性、抗氧化活性有显著的作用，并且通过分离纯化虫草多糖提高其生理活性。曲瑾郁等研究也进一步证明：将虫草多糖进行纯化后，再对其进行化学修饰，虫草多糖的抗氧化活性进一步加强。贾俊强等采用α-淀粉酶修饰虫草多糖，其DPPH、还原力等抗氧化活性也显著增加。

但是目前的虫草在提取过程中，多糖提取率低，稳定性不理想，并且有化学试剂残留等问题。

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术中存在的问题，提供了一种复合双酶同步提取北虫草多糖的方法，解决了现有技术中多糖提取率低，有化学试剂残留的问题。

本发明的另一目的在于提供一种复合双酶制取北虫草饮料的方法，达到提高虫草多糖含量，减少损失，增加多糖稳定性的目的。

一种复合双酶同步提取北虫草多糖的方法，该方法包括以下步骤：

步骤(1)、将干燥的北虫草进行粉碎过60目筛，得到北虫草粉；

步骤(2)、然后将北虫草粉加水混合，料液质量比为1：12-1：28，用食用柠檬酸调节pH，使其一直保持pH3.5，然后向混合液中添加果胶酶并放到55℃水浴锅中酶解，果胶酶添加量为物料质量的2％-4％，再用食用碳酸氢钠调节pH至5.5并保持，然后添加纤维素酶酶解，纤维素酶添加量为物料质量的2％-4％，两次酶解总时间为3-5h；

步骤(3)、酶解后，混合液在4000rad/min离心机中离心30min后取上清液，即虫草原液，并在4℃下保存。

所述的步骤(2)中，果胶酶添加量为2.54wt％，纤维素酶添加量为2.08wt％，料液质量比1：21.45，酶解时间3.9h。

一种复合双酶同步提取北虫草多糖在加工北虫草饮料中的应用，包括如下步骤：

步骤1.将上述虫草原液煮沸灭酶15min，加水进行调配，并添加白砂糖、果糖、柠檬酸溶解并调配饮料口感，再加入饮料质量0.06％的黄原胶和0.04％的羧甲基纤维素钠，最后加入山梨酸钾，上述虫草原液和水的质量比为1：6-1：18，白砂糖和果糖添加质量比为2：1，总糖添加量占饮料质量的4％-16％，糖酸质量比为70：1-110：1，山梨酸钾添加量占饮料质量的0.05％-0.25％；

步骤2.将调配好的饮料进行高压均质，均质压力：20MPa，然后进行超高温瞬时杀菌，杀菌条件：135℃，2s，最后无菌灌装制成成品，完成虫草饮料的加工。

所述的步骤1中，虫草原液与水质量比为1：12，糖添加量占饮料质量的10％，糖酸质量比100：1，山梨酸钾添加量占饮料质量的0.1％。

本发明的优点效果如下：

北虫草中富含虫草多糖、虫草素、虫草酸、甾醇、多肽、超氧化物歧化酶等生物活性物质，尤其是虫草多糖能够起到抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、增强免疫力、降血脂等功效，通过酶法提取虫草多糖，可以有效提高虫草多糖的提取率，并且不破坏虫草的结构和组成，有利于其功效的发挥，提高利用率和吸收率，复合双酶生产的北虫草饮料是一种营养价值极高的饮品，具有极大的市场潜力。

本发明在加工北虫草饮料的过程中，采用果胶酶和纤维素酶复合酶解工艺提取虫草多糖，并通过复合稳定剂和功能性单糖进行饮料调配。此发明可以最大限度地提高虫草多糖的提取率，保证虫草多糖的稳定性，并用北虫草多糖原液进行饮料配方的研制。因此，复合双酶制取北虫草饮料工艺研究具有重要的应用价值和实际意义。

附图说明

图1是本发明总工艺路线图。

图2是果胶酶添加量和纤维素酶添加量交互作用响应面图。

图3是果胶酶添加量和料液比交互作用响应面图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述。

一种复合双酶同步提取北虫草多糖和加工北虫草饮料的方法，该方法包括以下步骤：(1).将干燥的北虫草进行粉碎过60目筛，得到北虫草粉；(2).然后将北虫草粉加水混合，料液比为1：12-1：28，用食用柠檬酸调节pH，使其一直保持pH3.5，然后添加物料质量2％-4％的果胶酶放到55℃水浴锅中酶解一定时间，再用食用碳酸氢钠调节pH至5.5并保持，添加物料质量2％-4％的纤维素酶，酶解总时间3-5h；(3).酶解后，混合液在4000rad/min离心机中离心30min后取上清液，即虫草原液，并在4℃下保存；(4).将虫草原液煮沸灭酶15min，加一定量水进行调配，并添加一定量白砂糖、果糖、柠檬酸溶解并调配饮料口感，再加入饮料质量0.06％黄原胶和0.04％羧甲基纤维素钠，提高饮料稳定性，最后加入一定量的山梨酸钾，上述原液和水比例为1：6-1：18，白砂糖和果糖添加比例为2：1，总糖添加量为4％-16％(按照饮料质量计算)，糖酸比为70：1-110：1，山梨酸钾添加量为0.05％-0.25％(按照饮料质量计算)；(5).将调配好的饮料进行高压均质，均质压力：20MPa，然后进行超高温瞬时杀菌，杀菌条件：135℃，2s，最后无菌灌装制成成品，完成虫草饮料的加工。

所述北虫草多糖提取过程最优参数：果胶酶添加量2.54％，纤维素酶添加量2.08％，料液比1：21.45，酶解时间3.9h；北虫草饮料调配最优参数：虫草原液与水比例1：12，糖添加量为10％，糖酸比100：1，山梨酸钾添加量为0.1％。

实施例1酶解提取虫草多糖最佳参数的筛选实验

1材料与方法

1.1材料、试剂

北虫草 大连金和菌业有限公司

果胶酶(食用级) 南京松冠生物科技有限公司

纤维素酶(食用级) 北京盛世嘉明科技开发有限公司

1.2主要仪器设备

1.3实验方法

1.3.1虫草多糖测定干燥的北虫草进行粉碎，过60目筛，55℃水浴下酶解提取虫草多糖，离心取上清液，重复上述操作三次，合并上清液，真空浓缩至一定体积，加入最终体积80％的乙醇沉淀，将沉淀加水复溶，采用sevage法除蛋白，干燥冷冻备用。

葡萄糖标准溶液的配置：

精确称取100mg烘干至恒重的无水葡萄糖，在小烧杯加少许水溶解，移至100ml容量瓶加水定容，反复震摇后从中吸取10ml，并定容至1000ml，得到的标液100ug/ml贮存备用。标准曲线的绘制表如下

按上表加入各试剂后，震荡摇匀，沸水浴15min加热，冷却后，于490nm处测定吸光度，以葡萄糖含量C为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线。

样品多糖含量的测定：用分析天平称取1.0000g多糖样品定容至100ml，从中精密吸取1.0ml置于试管中，参照葡萄糖标准曲线的绘制方法测定样品吸光度，根据标准曲线计算葡萄糖质量浓度，再由换算因子得到虫草多糖的含量。

1.3.2换算因子测定精密称取干燥至恒重的虫草多糖5.0mg，用蒸馏水定容至100ml容量瓶中，摇匀得到虫草多糖储备液，取2.0ml测定其吸光值，同时做空白对照。按照f＝m/(c*D*V)公式计算，f表示换算因子，m表示虫草多糖质量，c为储备液中葡萄糖的质量浓度，D为稀释倍数，V为样品体积。

1.3.3工艺流程

见附图1

2结果与分析

2.1北虫草酶解工艺条件的确定

2.1.1果胶酶添加量对虫草多糖提取率的影响从表1可知，随着果胶酶添加量增加，提取率先增加后保持稳定。由于酶解过程中果胶酶可以将虫草细胞壁多糖中果胶进行分解，有利于多糖溶出。当果胶酶添加量达到3.50％时，多糖提取率达到最大。

表1果胶酶添加量对多糖提取率的影响

2.1.2纤维素酶添加量对虫草多糖提取率的影响从表2知，随着纤维素酶添加量增加，提取率先增加后降低，并有缓慢下降趋势。由于虫草细胞壁主要为纤维素等多糖，阻碍虫草多糖溶出，纤维素酶将纤维素进行分解，提高多糖溶出效果。当纤维素酶添加量为2.5％时，多糖提取率达到最大。

表2纤维素酶添加量对多糖提取率的影响

2.1.3料液比对虫草多糖提取率的影响从表3知，随着料液比增加，提取率先增加后减小。随着料液比增大，溶液中酶与底物接触面积增加，提高酶解效果，多糖溶出增加，但随着料液比继续增加，酶的浓度被稀释，酶解效果下降，因此当料液比为1：24时，多糖提取率达到最大。

表3料液比对多糖提取率的影响

2.1.4酶解时间对虫草多糖提取率的影响从表4知，随着酶解时间增加，多糖提取率先增加后保持稳定。随着酶解时间增加，酶与底物充分接触，有利于多糖溶出，当酶解时间在4-4.5h时，多糖提取率达到最大。

表4酶解时间对多糖提取率的影响

2.2工艺条件的优化

2.2.1响应面试验设计在单因素试验的基础上，确定各因素的最佳水平值范围，采用响应面中心组合试验设计，研究各多糖提取率影响因素对多糖提取率的影响规律，并得到复合酶法提取多糖的最优条件。以多糖提取率影响因素果胶酶添加量(A)、纤维素酶添加量(B)、料液比(C)、酶解时间(D)为自变量，以多糖提取率为响应值，其因素水平编码表见表5。

表5试验因素水平编码表

2.2.2响应面分析响应面试验方案及结果见表6。试验号1～16为析因试验，17～21为5个中心试验，用以估计试验误差。

表6响应面试验方案及结果

通过统计分析软件Design expert8.06进行数据分析，建立二次响应面回归模型为：

Y＝9.30+0.21A-0.26B+0.10C+0.086D+0.31AB-0.23AC-0.42AD+0.085BC+0.27BD-0.16CD-0.35A²-0.31B²-0.43C²-0.45D²

表7回归与方差分析结果

进一步对该回归模型进行显著性检验，响应曲面数据的方差分析结果见表7。由表7可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著(P<0.001)，失拟项不显著，并且该模型R²＝99.28％，R²_Adj＝97.60％，说明该模型与试验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，试验误差小，可以用此模型来分析和预测结果。由此可以认为上面给出的二次回归方程模型是合适的。由F检验可以得到因子贡献率为：B>A>C>D，即纤维素酶添加量>果胶酶添加量>料液比>酶解时间。

根据试验结果可知，A、B、C、AB、AC、AD、BD、CD、A²、B²、C²、D²对虫草多糖提取率的影响显著。将其他2个因素固定在零水平，可以得到其他2个因素的响应面图，可以从中看出各因素之间的交互作用。

各两因素显著项(P<0.05)交互作用对虫草多糖提取率影响的响应面图见图2-3。

当料液比、酶解时间在零水平时，图2表示果胶酶添加量和纤维素酶添加量有显著的交互作用，在不同纤维素酶添加量作用下，果胶酶对多糖提取率的影响趋势是先保持稳定后有小幅降低；在不同的果胶酶添加量作用下，纤维素酶添加量对多糖提取率的影响趋势也是先保持稳定然后下降。说明果胶酶添加量在2.5％-3.0％附近，多糖提取率达到最大，所以果胶酶添加量不宜过高；纤维素酶添加量在2.0％-2.5％附近，多糖提取率达到最大。

当纤维素酶添加量、酶解时间在零水平时，图3表示果胶酶添加量和料液比有显著的交互作用，在不同料液比作用下，果胶酶添加量对多糖提取率的影响趋势是先升高后降低；在不同果胶酶添加量作用下，料液比对多糖提取率的影响趋势是先增加后降低并保持稳定，料液比在1：20附近，提取率达到最大。

2.3最佳工艺的确定和验证试验

应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析可知，当果胶酶添加量2.54％，纤维素酶添加量2.08％，料液比1：21.45，酶解时间3.9h，响应面最优值为(9.37±0.12)％，在此条件下虫草多糖提取率最大。

在响应面分析法求得的最佳条件下，即果胶酶添加量2.54％，纤维素酶添加量2.08％，料液比1：21.45，酶解时间3.9h，进行平行试验(3次)，3次平行试验值为9.29％、9.32％、9.28％，平均值为9.30％。响应值的试验值与回归方程预测值吻合良好，说明该模型能够较好地预测虫草多糖的提取率。

实施例2虫草饮料感官品质参数优选实验

1.1材料、试剂

1.2主要仪器设备

1.3实验方法

1.3.1感官评价测定采用百分制进行感官评定，所有感官指标的评分值范围均为1-25分，分值越高，则表示其质量越好。感官评价指标包括口感、气味、色泽、粘稠度4项，感官指标及其评分标准如下:气味(1-9分：差；10-19分：一般；20-25分：好)，口感(1-9分：差；10-19分：一般；20-25分：好)，色泽(1-9分：无色；10-19分：适中；20-25分：淡黄色)，粘稠度(1-9分：非常粘稠；10-19分：适中；20-25分：好)。选择30名专业饮料鉴评师进行感官评价，其中包括15名男士，15名女士。

1.3.2工艺流程

见附图1

2结果与讨论

2.1料液比对感官评价值的影响从表8知，随着原料液与水的比例增加，感官评价值先增加后减小。料液比增加，使原料液中虫草特有的味道降低，有利于感官评价，但水继续增加，口感降低。所以料液比在1：12时，感官评价值达到最大。

表8料液比对感官评价值的影响

2.2总糖添加量对感官评价值的影响从表9知，随着总糖添加量增加，感官评价值先增加后减小。糖添加量增加，甜度增加，口感较好，但由于果糖的甜度较高，糖添加量继续增加，饮料口感下降。所以总糖添加量在10％时，感官评价值最大。

表9总糖添加量对感官评价值的影响

2.3糖酸比对感官评价值的影响从表10知，随着糖添加量增大，感官评价值先增加后减小。通过糖酸比调节饮料的口感，当糖酸比在100：1时，感官评价值达到最大。

表10糖酸比对感官评价值的影响

2.4山梨酸钾添加量对感官评价值的影响从表11可知，随着山梨酸钾添加量增加，感官评价值先增加后降低并保持稳定，当山梨酸钾添加量在0.1％时，感官评价值达到最大。

表11山梨酸钾添加量对感官评价值的影响

2.5工艺条件优化

2.5.1正交试验设计在单因素试验的基础上，确定各因素的最佳水平值范围，采用四因素三水平正交试验设计，研究各感官评价影响因素对感官评价值的影响规律，并得到虫草多糖饮料的最优条件。以感官评价值影响因素虫草原液料水比(A)、总糖添加量(B)、山梨酸钾添加量(C)、糖酸比(D)为自变量，以感官评价值为指标，其因素水平表见表12。

表12正交因素水平表

2.5.2正交试验结果与分析

由表13知，根据极差分析，R值为极差，R值越大，其因素对感官评价值影响越大，结果表明R_B>R_A>R_D>R_C，即因素贡献率：B>A>D>C，最优水平为A2B2C2D3，因此虫草饮料的最佳工艺为：北虫草原液料水比1：12，总糖添加量10％，山梨酸钾添加量0.1％，糖酸比100：1。

表13试验方案及试验结果

2.6最佳工艺的确定和验证试验

应用四因素三水平正交试验和极差分析可知，当北虫草原液料水比1：12，总糖添加量10％，山梨酸钾添加量0.1％，糖酸比100：1，感官评价值95.7±1.2，口感、色泽、粘稠度、气味最佳。

在正交试验求得的最佳条件下，即北虫草原液料水比1：12，总糖添加量10％，山梨酸钾添加量0.1％，糖酸比100：1，进行平行试验(3次)，3次平行试验值为95、95.1、94.8，平均值为95。试验值与正交试验预测值吻合良好，说明该模型能够较好地预测产品的感官评价值。

并且在最优条件下，即北虫草原液料水比1：12，总糖添加量10％，山梨酸钾添加量0.1％，糖酸比100：1，此时产品多糖含量1.02％。

3结论

(1)北虫草多糖提取过程最优参数：果胶酶添加量2.54％，纤维素酶添加量2.08％，料液比1：21.45，酶解时间3.9h；

(2)北虫草饮料最优配方：北虫草原液料水比1：12，总糖添加量10％，山梨酸钾添加量0.1％，糖酸比100：1。