一种两步酶解提取米糠蛋白的方法与流程

本发明涉及生物工程领域，具体地涉及一种米糠蛋白的提取方法，尤其涉及一种两步酶解提取米糠蛋白的方法。

背景技术：

米糠是大米加工过程中的一种重要的副产物，我国盛产稻米，因此米糠资源也非常丰富。米糠中含有丰富的膳食纤维、蛋白质、淀粉、维生素、肌醇等营养物质。其中蛋白质在米糠中的含量高达12％～16％。米糠蛋白含有的人体必需氨基酸比较齐全，生物效价高。营养价值甚至可以与鸡蛋蛋白相媲美，并且，米糠蛋白具有低过敏性的特点，被广泛应用于婴幼儿食品中。

尽管米糠蛋白具有优异的营养性，但是其蛋白产品却很难商业化，原因主要包括：(1)米糠蛋白中的四种蛋白溶解性差异大，很难通过单一溶剂获得高纯度的蛋白产品；(2)蛋白分子之间含有大量的二硫键，导致蛋白的溶解性很差，给提取增加了难度；(3)米糠中丰富的植酸盐、半纤维素和纤维素与蛋白紧密结合在一起，增加了提取难度，影响了蛋白纯度。从上世纪60年代起，国外研究者就开始了对米糠蛋白提取的研究，主要的提取方法有碱法提取、酶法提取以及物理法提取。碱法是提取米糠蛋白最常见的一种方法，碱能够作用于蛋白分子间的氢键、酰胺键和二硫键，使更多的蛋白分子溶出，并且碱法提取简单易操作。但是此方法获得的蛋白产品风味和色泽不理想，提取时使用高浓度的碱产生的有毒物质，还会引起营养物质的损失；物理法被广泛应用于大米胚乳蛋白的分离、大豆蛋白分离等蛋白产品的生产上。但是米糠蛋白的特别之处在于其蛋白分子与植酸、纤维素等通过化学键紧密的结合在一起，这种结构很难通过物理方法破坏，并且物理提取设备投资大且工艺复杂；目前来看，酶法是生产高品质蛋白的最佳方法。生物酶法提取米糠蛋白具有条件温和，对蛋白的影响小，而且降解后的多肽具有一定的生理活性，在增大蛋白溶解性的同时，还能改善发泡，乳化等性能。但是仅用蛋白酶提取的方法会导致蛋白的提取率和纯度都较低。这是因为米糠蛋白不仅有大量的分子间的二硫键，同时还与米糠中的淀粉、纤维素等组分形成共价键。这些结构大大阻碍了蛋白酶的作用。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的一个目的在于提供一种两步酶解提取米糠蛋白的方法，该方法操作简单，重复性好，可以大大提高米糠蛋白的提取率以及纯度。

根据本发明的一种两步酶解提取米糠蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)取去除淀粉后的米糠渣，加入蒸馏水调浆，米糠渣占蒸馏水重量的5％-20％(料液比)，用质量百分比浓度为10％的盐酸调至pH为4.5-6.5以及温度为45℃-65℃，加入细胞破壁酶，基于浆料的总重量，加入细胞破壁酶的量为0.05％-0.25％，反应1h-5h后，得到经过预处理后的浆料(醪)。

(2)将上述步骤(1)中得到的浆料直接加入蒸馏水重新进行调浆至米糠渣的浓度为8％-12％，并用质量百分比浓度为30％的氢氧化钠重新调节pH为6.5-9.0及温度为60℃-95℃，无需其他处理加入碱性蛋白酶，基于浆料的总重量，碱性蛋白酶的用量为1.0％-3％，反应1h-6h后，离心分离，取上清液并冷冻干燥，即可得到蛋白产品。

优选地，步骤(1)中所述的调浆后的料液比为10％-13％，进一步优选为12％。

优选地，步骤(1)中所述的加入细胞破壁酶的量为0.15％-0.25％，进一步优选为0.2％。

优选地，步骤(1)中所述的pH为5.0-6.5，进一步优选为6。

优选地，步骤(1)中所述的温度为55℃-65℃，进一步优选为60℃。

优选地，步骤(1)中所述的反应时间为2h-4h，进一步优选为3h。

优选地，步骤(2)中所述再次调浆的醪浓度为9％-11％，进一步优选为10％。

优选地，步骤(2)中所述的碱性蛋白酶的用量为1.5％-2.5％，进一步优选为2.11％。

优选地，步骤(2)中所述的再次调浆的pH为8.0-9.0，进一步优选为8.5。

优选地，步骤(2)中所述的温度为85℃-90℃，进一步优选为88℃。

优选地，步骤(2)中所述的反应时间为1h-3h，进一步优选为2h。

优选地，步骤(2)中所述的离心转速为3000rpm-8000rpm，优选为4000rpm-6000rpm，进一步优选为5000rpm。

根据本发明的所述两步酶解提取米糠蛋白方法中步骤1)得到的浆料无需其他处理，可以直接用于步骤2)中，无需例如过滤，蒸馏等除酶或其他成分的工艺。

而且，根据本发明的所述两步酶解提取米糠蛋白方法中无需加入碱或酸等反应物进行反应，所述碱包括无机碱或有机碱，所述酸包括无机酸或有机酸。

有益效果

根据本发明的两步酶解提取米糠蛋白方法与其他的酶法提取相比，本方法能够充分的提高米糠蛋白的提取率。由于米糠蛋白含有较多的二硫键，并且与米糠中的植酸、纤维素等等聚集在一起，单酶提取很难获得较高的提取率。本发明的发明人在蛋白酶提取米糠蛋白之前使用细胞破壁酶对米糠细胞进行破壁。细胞破壁酶不仅能够降解米糠细胞壁的纤维素骨架，使镶嵌在细胞壁中的蛋白脱落下来，同时也能使植物细胞壁崩溃，释放细胞中的蛋白质，没有了细胞壁的阻隔，随后加入的蛋白酶能够对蛋白进行充分的酶解，极大的增加了米糠蛋白的提取率。双酶法提取米糠蛋白的方法为工业上提取米糠蛋白提供了理论基础。

附图说明

图1为醪浓度对复合纤维素酶作用效果影响的对比图；

图2为温度对碱性蛋白酶作用效果影响的对比图；

图3为pH对碱性蛋白酶作用效果影响的对比图。

具体实施方式

以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。

以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非另有说明，以下实施例中使用的反应物均为市售产品。

实施例1

(1)复合纤维素酶的作用：将10g去淀粉和植酸后的残渣加入73g水调浆至12％醪浓度(醪浓度＝物料质量/(物料质量+蒸馏水质量))，加入占浆料重量0.2％的复合纤维素酶(细胞破壁酶)，质量百分比浓度为10％的盐酸调至pH＝6，在温度60℃条件下反应3h，即可得到经过预处理后的浆料。

为了判定复合纤维素酶的预处理效果，可以将浆料抽滤，所得到的滤液进行冷冻干燥之后，测定其蛋白含量，以蛋白的提取率判定复合纤维素酶的作用效果，结果如图1所示，步骤(1)的蛋白提取率为6％。

(2)碱性蛋白酶的作用：将步骤(1)中得到的浆料重新加入17g水调浆至醪浓度为10％，调至pH为8.5，加入占浆料重量2.11％的碱性蛋白酶，在温度为88℃条件下反应2h，所得到的浆料经过5000rpm离心10分钟，得到滤液，滤液冷冻干燥后，即可得到蛋白产品。用元素分析法测定蛋白产品的蛋白含量，即可判定碱性蛋白酶的提取效果。结果如图2及图3所示，步骤(2)的蛋白质的提取率为85.3％。

关于醪浓度的改变对复合纤维素酶作用效果的对比实施例

对比实施例1

除了将步骤(1)中的醪浓度设置为5％以外。按照实施例1中相同的方法提取米糠蛋白。结果如图1所示，步骤(1)的蛋白提取率为3％。

对比实施例2

除了将步骤(1)中的醪浓度设置为10％以外。按照实施例1中相同的方法提取米糠蛋白。结果如图1所示，步骤(1)的蛋白提取率为3.2％。

对比实施例3

除了将步骤(1)中的醪浓度设置为15％以外。按照实施例1中相同的方法提取米糠蛋白。结果如图1所示，步骤(1)的蛋白提取率为5.2％。

对比实施例4

除了将步骤(1)中的醪浓度设置为20％以外。按照实施例1中相同的方法提取米糠蛋白。结果如图1所示，步骤(1)的蛋白提取率为5.1％。

从图1的数据可以看出步骤(1)中的醪浓度对复合纤维酶的蛋白提取率有直接影响，当醪浓度为10％-13％时，蛋白提取率较高；当醪浓度为12％时，蛋白提取率最高。

关于温度的改变对碱性蛋白酶作用效果的对比实施例

对比实施例5

除了将步骤(2)中温度设置为60℃以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图2所示，步骤(2)的蛋白提取率为32％。

对比实施例6

除了将步骤(2)中温度设置为65℃以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图2所示，步骤(2)的蛋白提取率为41％。

对比实施例7

除了将步骤(2)中温度设置为70℃以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图2所示，步骤(2)的蛋白提取率为45％。

对比实施例8

除了将步骤(2)中温度设置为75℃以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图2所示，步骤(2)的蛋白提取率为48％。

对比实施例9

除了将步骤(2)中温度设置为80℃以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图2所示，步骤(2)的蛋白提取率为71％。

对比实施例10

除了将步骤(2)中温度设置为90℃以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图2所示，步骤(2)的蛋白提取率为85％。虽然与实施例1提取率相差不大，但是考虑到节约成本，实施例1对应的温度更加适合。

对比实施例11

除了将步骤(2)中温度设置为95℃以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图2所示，步骤(2)的蛋白提取率为73％。

关于pH的改变对碱性蛋白酶作用效果的对比实施例。

对比实施例12

除了将步骤(2)中pH设置为6.5以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图3所示，步骤(2)的蛋白提取率为14％。

对比实施例13

除了将步骤(2)中pH设置为7.0以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图3所示，步骤(2)的蛋白提取率为28％。

对比实施例14

除了将步骤(2)中pH设置为7.5以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图3所示，步骤(2)的蛋白提取率为48％。

对比实施例15

除了将步骤(2)中pH设置为8.0以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图3所示，步骤(2)的蛋白提取率为62％。

对比实施例16

除了将步骤(2)中pH设置为9.0以外，按照实施例1相同的方法提取米糠蛋白。结果如图3所示，步骤(2)的蛋白提取率为80％。