一种制备固定化芳香化酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及制备固定化芳香化酶的方法，具体利用的技术为表面环氧基功能化修 饰的介孔娃球吸附法。
【背景技术】
[0002] 芳香化酶(aromatase)又名〔￥口19，是细胞色素口450酶系中的一种，是体内雌雄激 素转化的关键酶。它在NADPH存在的条件下，能将雄締二酬和睾酬分别转化为雌酬和雌二 醇，多种对雌激素有依赖的肿瘤如乳腺癌、子宫内膜癌、恶性卵巢肿瘤都有芳香化酶的过度 表达。其中芳香化酶与乳腺癌关系尤为密切，约60%~70%的乳腺癌的生长依赖于雌激素。 芳香化酶抑制剂使芳香化酶失去作用，雄激素无法转化为雌激素，从而阻断了雌激素作用 下肿瘤细胞的生长。由于芳香化酶只催化雌激素合成的最后一步反应，抑制芳香化酶并不 会影响到体内其他激素的合成，因此芳香化酶是预防和治疗激素依赖型乳腺癌的一个重要 祀点。近年来，芳香化酶抑制剂的问世使得乳腺癌治疗迈入了新的阶段，并逐渐成为治疗绝 经后妇女乳腺癌的一线药物，如来曲挫，依西美坦等。
[0003] 对芳香化酶抑制剂结构改造和从天然产物中筛选芳香化酶抑制剂的工作是新药 开发的研究热点，但由于种种原因，目前已有的筛选模型已不能满足国内外新药开发产业 对于高通量的芳香化酶的活性筛选方法的需求。目前筛选芳香化酶抑制剂的模型主要有两 种:一种是细胞株培养法，另一种是W胎盘的微粒体作为芳香化酶的酶源，检测手段为放射 性标记法或者利用试剂盒检测反应中产生的雌酬浓度，W此测定芳香化酶抑制剂的活性。 专利CN 103149186 B发明了一种利用均相时间分辨巧光技术实现对芳香化酶抑制活性进 行高通量筛选。W胎盘的微粒体中存在的游离芳香化酶为筛选模型存在W下明显缺陷：（1) 酶源来之不易，每次筛选试验均需要寻找新鲜人体胎盘来制备微粒体作为芳香化酶的酶 源，原材料获取存在医学伦理问题；（2)经人体胎盘提取的微粒体是多种激素转化酶的混合 物，多种酶会相互竞争催化底物转化为不同产物，而且每次提取得到的混合物种芳香化酶 活力均有差异，无法有效评价待筛选药物；（5)反应后的酶与产物分离困难，无法回收再利 用。
[0004] 上述游离芳香化酶的缺点成为了芳香化酶抑制剂筛选的瓶颈，而固定化酶技术与 游离酶相比，具有许多优点：（1)极易与底物、产物分离；（2)可W在较长时间内进行反复使 用，成本降低；（3)能够提高酶的稳定性等。酶的固定化方法有吸附法、共价键合法、交联法 和包埋法。但是由于酶的个体差异，并没有一种普适的固定化技术适用于所有的酶，截止到 目前还没有一种芳香化酶的固定化技术公布于世，而芳香化酶作为一个非常重要的乳腺癌 治疗祀点，将其固定化后可W构建新型的芳香化酶抑制剂的快速筛选技术平台，为新药开 发提供有力的工具。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种非常简便有效的方法固定化芳香化酶。本发明的方法是 通过环氧基功能化修饰的介孔娃球利用吸附法固定芳香化酶。
[0006] 本发明的固定化芳香化酶的制备方法，包括W下步骤：
[0007] (a)球形介孔娃球用稀盐酸活化即得固体介质A，其中盐酸浓度为5%~10%。
[0008] (b)制备环氧基修饰的介孔娃球为固体介质B。
[0009] (C)芳香化酶用憐酸钟缓冲液稀释为液体介质C，其中酶浓度为lOpmol/mL~ 40pmol/mL。
[0010] (d)将固体介质B用憐酸钟缓冲液洗涂S次后，与液体介质C混合，低溫下旋转震摇 SOminW上，离屯、除去上清液，沉淀经低溫离屯、洗涂后即得固定化酶。
[0011] 所述步骤(d)中，固体介质B的质量:液体介质C的体积优选为lmg:50化，更优选为 Img:IOOuL。
[0012] 所述液体介质C为水溶液，缓冲液离子强度为50mmol/L~150mmol/L。
[0013] 本发明的技术方案中，所述芳香化酶优选来源于杆状病毒-昆虫细胞表达系统。
[0014] 本发明的技术方案中，所述介孔娃球的粒径为2~40WH，优选为2~lOwn，更优选为 2~如m。孔径为50A~500A，更优选为IOOA~300A。
[0015] 本发明的技术方案中，步骤(d)中所述的固体介质B与液体介质C的混合方式为满 旋或者旋转震摇，若为旋转震摇，转速为10巧m~30巧m。
[0016] 本发明的制备方法中，将芳香化酶W分子间作用力的形式固定于载体上，运种分 子间作用力主要为范德华力、亲水或疏水作用力W及静电力。
[0017] 该发明中，所述液体介质的抑为6~8。
[0018] 在本发明的【具体实施方式】中，所述环氧功能化娃球在使用之前需要进行预处理， 预处理方法为用憐酸盐缓冲液洗涂，所使用缓冲液的抑在6~8之间，离子强度为50mmol/L ~200mmol/L之间，具体洗涂方法不予特别限定。
[0019] 本发明的另一个目的是提供用上述方法制备的固定化芳香化酶，通过该方法所制 备的固定化酶在连续催化时显示出了比游离酶更好的稳定性，可W重复利用，实验证明该 固定化酶至少可重复使用5次。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] ①本发明的固定化酶的制备方法为吸附法，简单有效，采用的载体为环氧基功能 化修饰的介孔娃球，廉价易得，为首次将芳香化酶固定于多孔硅胶载体上，具有很高的潜在 研究价值。
[0022] ②本发明所制备的固定化酶连续催化时稳定性较好，游离的芳香化酶在40min后 催化速率有所降低，而固定化酶在SOmin后催化速率才有所降低。并且固定化酶可W重复利 用，为潜在芳香化酶抑制剂的筛选可提供很好的平台。
[0023] 附图l为环氧基功能化介孔娃球化xopy-Si02)与固定化酶（Immobilizeden巧me) 的红外光谱图对比。
[0024] 附图2为固定化酶催化反应完成后上清液中产物(①雌酬)与底物(②雄締二酬)分 离的高效液相色谱图。
[0025] 附图3环氧基功能化介孔娃球(A)与固定化酶(B)的扫描电镜(SEM)对比图。
[0026] 附图4为不同浓度的酶溶液参与固定化后固定化酶的酶活力上升曲线。
[0027] 附图5为游离酶随反应时间增加时产物雌酬的生成效率。
[0028] 附图6为固定化酶随反应时间增加时产物雌酬的生成效率。
【具体实施方式】：
[0029] 下述非限制性实施例可W使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不W 任何方式限制本发明。
[0030] 实施例1
[0031 ] (1)称取4g介孔娃球（sepax細IP-si 1 ica;扣m，300A )，加入IOOmL 10 %盐酸，9〇°C 揽拌下回流8小时，随后用大量去离子水清洗至中性，15(TC真空干燥。得到活化的介孔娃球 载体。
[0032] (2)称取500mg步骤（1)所得到的活化介孔娃球分散于20mL无水甲苯中，逐滴加入 25化L 丫-缩水甘油酸氧丙基S甲氧基硅烷化H-560)，于90°C揽拌回流12h，随后依次用甲 苯和丙酬洗涂=次，60°C真空干燥，保存于4°C，得到环氧基修饰的功能化介孔娃球巧xopy-Si〇2)。
[0033] (3) lOOmmol/L憐酸钟缓冲液(pH7.4)的配制：称取4.56g K2HPO4溶于200mL去离子 水为A液，称取2.72g K出K)4溶于200mL去离子水为B液，A与BW (A: B)80.2:19.8混合即得。
[0034] (4)雄締二酬储备液与工作液的配制:称取2mg雄締二酬与ImL容量瓶中，用DMSO稀 释至刻度，-20°C保存，即为2mg/血的储备液;取扣L储备液与95化憐酸钟缓冲液（IOOmmol/ 1，口^.4)混合，即为10化邑/1111的雄締二酬工作液。
[0035] (5)固定化所用酶溶液的配制：将来自杆状病毒-昆虫细胞表达系统的芳香化酶 (corning,美国）用憐酸钟缓冲盐（100111111〇1凡，口^.4)分别稀释至10口1]1〇1/111]^，20口111〇1/1111^， SOpmo1/mL，40pmo1/mL。
[0036] (S)NADPH工作液的配制：称取8.33mg的NADPH(BI0SHARP公司）加入ImL容量瓶中， 用憐酸钟缓冲液稀释至刻度，混匀，保存于4°C冰箱中即得。
[0037] (7)称取5mg步骤(2)所得到的环氧基修饰的功能化介孔娃球用0.5mL憐酸钟缓冲 液(lOOmmol/L，抑7.4)洗涂S次后，加入步骤(4)所制得的酶溶液0.5血，4°C旋转震摇30min W上，低溫高速离屯、后，沉淀用0.5mL憐酸钟缓冲液(100mmol/L，pH7.4)洗涂3次，测酶活力。
[0038] (8)固定化酶的活力测定方法为:在5mg步骤(6)所制得固定化酶中加入17扣L憐酸 钟缓冲液（lOOmmol/L，pH7.4)，扣L雄締二酬工作液，满旋混合均匀后，37°C恒溫震荡5min 后，加入20化NADPH工作液启动反应，反应20min，随后4°C高速离屯、，上清液取50化进入高效 液相色谱分析。沉淀用〇.5mL憐酸钟缓冲液(100臟〇1八，9^.4)洗