专利名称：一种在聚电解质离子的协同作用下对青霉素酰化酶的固定方法
技术领域：
本发明涉及将青霉素酰化酶(PGA)在聚电解质离子的协同作用下固定在高聚物形成的固体网格之中的方法，并应用于β-内酰胺类抗生素及其母核的工业制备和合成过程。
背景技术：
二十世纪60年代早期β-内酰胺抗生素半合成工业渐渐兴起，这使得β-内酰胺的母核6-氨基青霉素烷酸(6-APA)成为重要的药物合成中间体。因此，人们首先开始通过青霉素酰化酶(PGA)裂解青霉素G来合成6-APA。随后，由于PGA独特的选择性，人们又研究利用PGA的选择催化作用，以6-APA或7-氨基去乙酸基头孢烷酸(7-ADCA)为β-内酰胺的母核，再加上适当的侧链来半合成β-内酰胺抗生素。
四十余年来，经过不断的筛选和基因重组的PGA变得越来越稳定，酶的生产能力也不断的得到提高，再加上有效的固定化方法使得酶的回收变成可能，该方法的成本也被大大的降低。
现在，通过酶的这一催化作用，全世界一年可以生产20000吨的6-APA，而相应的β-内酰胺类抗生素，如头孢氨苄，阿莫西林和头孢羟氨苄等，也已经逐渐实现了工业化。
但值得注意的是，有效的PGA固定化方法是酶促裂解青霉素G和β-内酰胺抗生素半合成的关键。所以现在对于这一领域的研究也相当重视。
总体说来，酶的固定化方法有三大类1、载体结合法将酶共价结合到一个预制载体上。载体通常使用合成树脂，生物高聚体或无机材料等。
2、包埋法将酶物理包埋于聚合物的网格(如凝胶格子)或有孔纤维、微囊之类的膜中。这其中采用的物理作用力非常弱，但是却可以阻止酶的活性构象被破坏。但有时也会对酶再进行一次共价结合处理。
3、酶交联晶体或聚沉体法主要是用双官能团试剂对酶进行无载体交联制备酶颗粒。
青霉素酰化酶的固定化方法及基材也有很多种。例如，以丙烯酸树脂及其衍生物的多元共聚物为载体的共价结合固定化方法，这类载体常见的有Eupergit C和Amberlite系列等。荷兰DSM公司发明的明胶-壳聚糖凝胶包埋青霉素酰化酶的方法。此外还有许多以无机硅材料，分子筛，硅藻土等各种材料为载体通过物理吸附，共价交联等各种方法来固定化青霉素酰化酶的途径。酶交联晶体或聚沉体法也有过报道，但由于自身条件限制，该种固定化的青霉素酰化酶不能用于β-内酰胺抗生素的工业化大生产。
发明内容
本发明提供一种更高效的青霉素酰化酶的固定化方法。以聚电解质离子的协同作用，先将青霉素酰化酶包埋于聚电解质离子形成的固体网格之中，再通过交联剂的作用进一步提高其机械强度和稳定性。
这种在聚电解质离子的协同作用下对青霉素酰化酶进行固定的方法，包括如下步骤(1)将浓度为100～3000U/ml的青霉素酰化酶的溶液与聚阴离子溶液进行预混合，得到预混合液，然后将预混合液与聚阳离子溶液混合，生成带有絮状沉淀的悬浊液；(2)将带有絮状沉淀的悬浊液进行搅拌，搅拌下加入硅烷类物质并均匀混合，加入交联剂，再经过陈化，真空干燥，研磨，得到颗粒状的青霉素酰化酶固定化产物。
所述的聚阴离子溶液是将聚阴离子溶于pH值5.0～9.0的磷酸缓冲溶液或8.0～11.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，所述的聚阴离子为聚对苯乙烯磺酸钠、硫酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸或海藻酸钠中的一种或几种。
所述的聚阳离子溶液是将聚阳离子溶于pH值3.5～6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液或5.0～9.0的磷酸缓冲溶液中，所述的聚阳离子为壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚三甲基烯丙基氯化铵、聚二甲基二烯丙基氯化铵或聚烯丙基氯化铵中的一种或几种。
所述的青霉素酰化酶与聚阴离子溶液进行预混合时pH值控制在5.0～11.5；所述的预混合液与聚阳离子溶液进行混合时pH值控制在3.5～9.0。聚阴离子溶液浓度为0.1mg/ml～0.2g/ml；聚阳离子溶液浓度为0.1mg/ml～0.2g/ml。
所述的硅烷类物质为四甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷含氨基衍生物、四甲氧基硅烷含环氧基团衍生物、四甲氧基硅烷含羧基衍生物、四乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷含氨基衍生物、四乙氧基硅烷含环氧基团衍生物或四乙氧基硅烷含羧基衍生物。硅烷类物质的用量为聚阳离子质量的0.2～5.0倍。
所述的交联剂为戊二醛、乙二醛、甲醛、N，N-二甲基甲酰胺或环氧氯丙烷。交联剂的用量为硅烷类物质质量的0.1％～20％。
步骤(1)中，由于酶自身表面的电荷分布并不均匀，通过缓冲液的控制可以使酶的表面更多的富集正电荷或负电荷，本发明方法中是采用在酶表面富集阳离子的方法，与聚阴离子溶液进行混合，得到的溶液再与聚阳离子进行混合。由于聚电解质自身正负离子的聚沉作用，这样就可以得到通过静电力作用的包覆有酶的聚电解质絮状沉淀体。
步骤(1)是整个青霉素酰化酶固定化最主要的部分，因为它不仅涉及到青霉素酰化酶的固定量，也对最后产物的活性，回收率等等主要参数有极大的影响，并且之后的处理过程也是以此步骤为基础的。因此，必须选取合适的聚电解质离子和优化各物质之间合适的比例，还要严格控制各种物质溶液的pH值。
步骤(2)的主要出发点是考虑到絮状沉淀并非是工业上所能直接采用的固定化产物，因为工业需要的固定化酶必须要易于分离，并且有一定的机械强度，这都是絮状沉淀物所不能达到的。所以，在这一悬浊液中加入一定量的硅烷，并加入交联剂，用一种类似于溶胶凝胶法的方法来制得颗粒状的固定化酶，并达到一定的机械强度，以适于工业生产的要求。
因此，这一过程中的助剂硅烷和交联剂的选择及用量是很重要的，这影响到最后产物的颗粒大小和机械强度。
通过本发明方法固定的青霉素酰化酶，保留了酶自身较高的稳定性和活性，又使得整个固定化产物本身能较好的适应于β-内酰胺抗生素工业化生产中恶劣的环境条件。
图1为青霉素酰化酶包埋于聚阳离子与聚阴离子形成的网格中的示意图具体实施方式
实施例1取1.0g聚对苯乙烯磺酸钠溶于20ml pH值7.4的磷酸缓冲溶液中，再加入5ml1000U/ml的青霉素酰化酶水溶液。另取1.0g聚二甲基二烯丙基氯化铵溶于30ml pH值7.4的磷酸缓冲溶液中。将两份溶液在150ml圆底烧瓶中混合，立刻可得到白色极细的絮状沉淀。机械搅拌，并加入5ml氨丙基三甲氧基硅烷，1小时之后，停止搅拌，并立刻加入5ml 25％的戊二醛水溶液，陈化24小时后，洗涤沉淀物至检测不出戊二醛，室温真空干燥，产品取出研磨，可得颗粒状青霉素酰化酶固定化产物，活力可达1000～1200U/g。
实施例2取1.0g羧甲基纤维素钠溶于20ml pH值9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，再加入5ml 1000U/ml的青霉素酰化酶水溶液。另取1.0g聚乙烯亚胺溶于30ml pH值4.0的柠檬酸-柠檬酸钠溶液中。将两份溶液在150ml圆底烧瓶中混合，立刻可得到白色絮状沉淀。机械搅拌，并加入5ml环氧丙基三乙氧基硅烷，1小时之后，停止搅拌，并立刻加入5ml环氧氯丙烷，机械搅拌2小时，静置24小时后，洗涤沉淀物，室温真空干燥，产品取出研磨，可得颗粒状青霉素酰化酶固定化产物，活力可达1200～1500U/g。
实施例3取1.0g海藻酸钠溶于20ml pH值8.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，再加入5ml 1000U/ml的青霉素酰化酶水溶液。另取0.8g聚烯丙基氯化铵溶于40ml pH值6.8的磷酸缓冲溶液中。将两份溶液在150ml圆底烧瓶中混合，立刻可得到乳白色细小颗粒沉淀。机械搅拌，并加入5ml氨丙基三乙氧基硅烷，1小时之后，停止搅拌，并立刻加入8ml甲醛水溶液，陈化24小时后，洗涤沉淀物，室温真空干燥，产品取出研磨，可得颗粒状青霉素酰化酶固定化产物，活力可达1100～1400U/g。
权利要求
1.一种在聚电解质离子的协同作用下对青霉素酰化酶的固定方法，包括如下步骤(1)将浓度为100～3000U/ml的青霉素酰化酶的溶液与聚阴离子溶液进行预混合，得到预混合液，然后将预混合液与聚阳离子溶液混合，生成带有絮状沉淀的悬浊液；(2)将带有絮状沉淀的悬浊液进行搅拌，搅拌下加入硅烷类物质并均匀混合，加入交联剂，再经过陈化，真空干燥，研磨，得到颗粒状的青霉素酰化酶固定化产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的聚阴离子溶液是将聚阴离子溶于pH值5.0～9.0的磷酸缓冲溶液或8.0～11.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，所述的聚阴离子为聚对苯乙烯磺酸钠、硫酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸或海藻酸钠中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的聚阳离子溶液是将聚阳离子溶于pH值3.5～6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液或5.0～9.0的磷酸缓冲溶液中，所述的聚阳离子为壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚三甲基烯丙基氯化铵、聚二甲基二烯丙基氯化铵或聚烯丙基氯化铵中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的聚阴离子溶液浓度为0.1mg/ml～0.2g/ml；聚阳离子溶液浓度为0.1mg/ml～0.2g/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的青霉素酰化酶与聚阴离子溶液进行预混合时pH值控制在5.0～11.5；所述的预混合液与聚阳离子溶液进行混合时pH值控制在3.5～9.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的硅烷类物质为四甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷含氨基衍生物、四甲氧基硅烷含环氧基团衍生物、四甲氧基硅烷含羧基衍生物、四乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷含氨基衍生物、四乙氧基硅烷含环氧基团衍生物或四乙氧基硅烷含羧基衍生物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的硅烷类物质的用量为聚阳离子质量的0.2～5.0倍。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的交联剂为戊二醛、乙二醛、甲醛、N，N-二甲基甲酰胺或环氧氯丙烷。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的交联剂的用量为硅烷类物质质量的0.1％～20％。
全文摘要
本发明公开了一种在聚电解质离子的协同作用下对青霉素酰化酶进行固定的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将浓度为100～3000U/ml的青霉素酰化酶的溶液与聚阴离子溶液进行预混合，然后将预混合液与聚阳离子溶液混合，生成带有絮状沉淀的悬浊液；(2)将带有絮状沉淀的悬浊液进行搅拌，搅拌下加入硅烷类物质并均匀混合，加入交联剂，再经过陈化，真空干燥，研磨，得到颗粒状的青霉素酰化酶固定化产物。通过本发明方法固定的青霉素酰化酶，提高了的酶活性和使用稳定性，可以改善β－内酰胺抗生素工业化生产条件，降低生产成本。
文档编号C12N9/78GK1995338SQ20061015552
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月28日 优先权日2006年12月28日
发明者林贤福, 吴起, 金鑫, 吕德水, 陈志春 申请人:浙江大学