专利名称：一种木聚糖酶的固定方法
技术领域：
本发明所属酶工程研究开发技术领域。本发明涉及木聚糖酶固定化方法的研究，适合科学研究或エ业化生产。
背景技术：
木聚糖是半纤维素的主要成分，属于植物细胞壁中的结构性非淀粉性多糖，
约占细胞干重的15% 30%，为自然界第二大可再生性资源。木聚糖酶(endo-1，4-β -D-xylanxylanohydrolase EC3. 2. I. 8)以内切方式作用于木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键，其主要水解产物为木ニ糖与木ニ糖以上的低聚木糖，还有少量木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶降解过程具有得率高、污染小和产物的安全性高等优点，是降解半纤维素最有潜力的方法。木聚糖酶是半纤维素酶的ー种，是ー种能降解木聚糖的复合酶。被广泛用于酿造中的澄清以及食品、饲料、造纸和纺织エ业中。目前国内大多数厂家使用的都是进ロ酶。但该酶稳定性差，保质期短，重复利用率低，往往使应用成本增高而限制了其应用。所以在酶的应用研究中，固定化酶的研究是生物技术领域中新兴的ー门技术。酶的固定化是指用载体材料将酶限制于一定空间内进行催化反应，固定化酶可回收及反复连续利用的ー类技木。固定化酶保留了游离酶高效专一、温和的催化性质，同时又克服了游离酶的缺点，具有高稳定性、易分离纯化、回收使用、操作简便等优点。然而，广泛投入エ业化应用的固定化酶却不多。因此，进一歩开发更经济适用的固定化方法，使更多的酶取得エ业上的广泛应用，仍是科技工作者追求的目标。酶的固定化方法常用的是吸附法、交联法、共价结合和法包理法。在此基础上还出现了上述方法的结合法等酶固定化研究中，良好的载体是固定化酶成功的关键。所以在酶固定化领域，作为固定化载体的筛选和制备就成为了主要研究方向。选择合适的载体，从实用性方面来考虑，探索研制高效、廉价且制备简单的载体乃是酶工程应用基础研究急需解决的ー个重要课题。在近几年来，我们在工作中发现，苯酚类物质和福尔马林作用可产生ー种凝胶状物质，此类物质疏松多孔，具有极强的亲水性.不溶于水和有机溶剂，有很好的机械强度.可快速、有效地对各种酶和蛋白质加以固定，对蛋白质有很高的结合量。此类固定化剂在国内外尚未见报道。尽管木聚糖酶的固定化载体目前很多，但该方法所制备的凝胶成本低廉，且操作简单、无毒性，是ー种可以推广使用的优良酶载体.所以利用廉价的该载体固定木聚糖糖酶具有较大的理论和实践意义。而本方法研究的目的是开发新型的酶的固定化载体，并可以增强木聚糖酶在エ业、医学、食品、环境保护等领域的应用。
发明内容
I.本发明涉及木聚糖酶固定化载体的制备和木聚糖酶的固定化方法，其特征在木聚糖酶载体的制备和木聚糖酶的固定化方法，包括以下过程步骤(一)取对苯ニ酚30-40g、福尔马林水溶液80-90mL、盐酸20_30mL，搅拌混匀；步骤(ニ)将步骤(一)的混合液搅拌加热至形成凝胶； 步骤(三)将步骤(ニ)的凝胶用去离子水洗涤至中性，干燥，研磨，过筛，取直径大约O. 05 O. 2mm的颗粒，经水溶涨即得固定化载体；步骤(四)取步骤(三)的凝胶载体I克(含水量85%)，加入3 4%的戊ニ醛溶液5-8mL，室温下搅拌O. 5小时，室温交联5_6小时，离心去上清，水洗除去残余戊ニ醛，留沉淀；步骤(五)步骤(四)中的沉淀载体加入10_15mL稀释的木聚糖酶，搅拌均匀，4°C固定5 6小时，离心，留沉淀；步骤(六)步骤(五)中的沉淀用O. lmol/L HAc-NaAc缓冲液洗漆，除去多余酶液；步骤(七)将步骤(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。2.根据本发明所述，制备固定化木聚糖酶的载体是对苯ニ酚、福尔马林水溶液和盐酸的混合物。
具体实施例方式本发明所述的涉及凝胶载体的制备和木聚糖酶的固定化方法包括以下实施例，下面的实施例可进ー步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例I :步骤(一)取对苯ニ酚30g、福尔马林水溶液80mL、盐酸20mL，搅拌混匀；步骤(ニ)将步骤(一)的混合液搅拌加热至形成凝胶；步骤(三)将步骤(ニ)的凝胶用去离子水洗涤至中性，干燥，研磨，过筛，取直径大约O. 05 O. 2mm的颗粒，经水溶涨即得固定化载体；步骤(四)取步骤(三)的凝胶载体I克，加入3%的戊ニ醛溶液5mL，室温下搅拌O. 5小时，室温交联5小时，离心去上清，水洗除去残余戊ニ醛，留沉淀；步骤(五)步骤(四)中的沉淀载体加入IOmL稀释的木聚糖酶，搅拌均匀，4°C固定5小时，离心，留沉淀；步骤(六)步骤(五)中的沉淀用O. lmol/L HAc-NaAc缓冲液洗漆，除去多余酶液；步骤(七)将步骤(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。实施例2 步骤(一)取对苯ニ酚40g、福尔马林水溶液90mL、盐酸30mL，搅拌混匀；步骤(ニ)将步骤(一)的混合液搅拌加热至形成凝胶；步骤(三)将步骤(ニ)的凝胶用去离子水洗涤至中性，干燥，研磨，过筛，取直径大约O. 05 O. 2mm的颗粒，经水溶涨即得固定化载体；
步骤(四)取步骤(三)的凝胶载体I克，加入4%的戊ニ醛溶液8mL，室温下搅拌O. 5小时，室温交联6小时，离心去上清，水洗除去残余戊ニ醛，留沉淀；步骤(五)步骤(四)中的沉淀载体加入15mL稀释的木聚糖酶，搅拌均匀，4°C固定6小时，离心，留沉淀；步骤(六)步骤(五)中的沉淀用O. lmol/L HAc-NaAc缓冲液洗漆，除去多余酶液；步骤(七)将步骤(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。附实验例证I.凝胶与蛋白质的结合量凝胶与蛋白质的结合量受其成分、反应时间和pH的影响·凝胶成分对载体的影响改变凝胶成分的比例可影响载体与蛋白质的结合量(表I)
表I凝胶成分对载体的影响
对苯ニ酿(g) 福尔马林(ml)盐酸(ml) 蛋白质结合量(mg/g干胶)
T-5-K)35U5^
210156380
315209406
4202512480
5254515501从表I可见，处理I和5与蛋白结合量较大些，其次是处理4和3，最差的是2，所以在制备载体时采用的是福尔马林为对苯ニ酚的二倍量，而盐酸约为福尔马林的1/3倍量(1:2: 1/3)。2.作为载体固定木聚糖酶2. I温度对固定化反应的影响当在pH4. 6,0. lmol/L HAc-NaAc缓冲液中，以不同的温度进行固定化反尖，可得不同温度下固定化酶的活力回收，得知其活力回收随温度升高而下降，所以在对酶进行固定化时，尽量在低温下(冰箱)进行(表2)。表2.温度对固定化反应的影响
温度CC )さカ回收(％)
-5-5 Γ5
1095.8
15 94.3 20 81.3 _ 25 _70. I_2. 2ρΗ值对固定化反应的影响
权利要求
1.本发明涉及木聚糖酶固定化载体的制备和木聚糖酶的固定化方法，其特征在木聚糖酶载体的制备和木聚糖酶的固定化方法，包括以下过程 步骤(一)取对苯二酚30-40g、福尔马林水溶液80-90mL、盐酸20-30mL，搅拌混匀； 步骤(二)将步骤(一)的混合液搅拌加热至形成凝胶； 步骤(三)将步骤(二)的凝胶用去离子水洗涤至中性，干燥，研磨，过筛，取直径大约O. 05 O. 2mm的颗粒，经水溶涨即得固定化载体； 步骤(四)取步骤(三)的凝胶载体I克，加入3 4%的戊二醛溶液5-8mL，室温下搅拌O. 5小时，室温交联5-6小时，离心去上清，水洗除去残余戊二醛，留沉淀； 步骤(五)步骤(四)中的沉淀载体加入10-15mL稀释的木聚糖酶，搅拌均匀，4°C固定5 6小时，离心，留沉淀； 步骤(六)步骤(五)中的沉淀用O. lmol/L HAc-NaAc缓冲液洗漆,除去多余酶液； 步骤(七)将步骤(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。
2.根据本发明所述，制备固定化木聚糖酶的载体是对苯二酚、福尔马林水溶液和盐酸的混合物，其三者比例约为1 2 1/3。
全文摘要
本发明所属酶工程研究开发技术领域。本发明涉及木聚糖酶载体的制备和木聚糖酶的固定化方法研究。取对苯二酚30-40g、福尔马林水溶液80-90mL、盐酸20-30mL，搅拌混匀；混合液搅拌加热至形成凝胶；凝胶用去离子水洗涤至中性，干燥，研磨，过筛，取直径大约0.05～0.2mm的颗粒，经水溶涨即得固定化载体；取凝胶载体1g，加入3～4％的戊二醛溶液5-8mL，室温下搅拌0.5h，室温交联5-6h，离心去上清，水洗除去残余戊二醛，留沉淀；沉淀载体加入10-15mL稀释的木聚糖酶，搅拌均匀，4℃固定5～6h，离心，留沉淀；沉淀用0.1mol/L HAc-NaAc缓冲液洗涤，除去多余酶液；抽真空得到固定化木聚糖酶。本发明载体和固定化酶的制备方法，载体原料廉价易得，工艺简单，条件温和，对酶活性损失小，酶活回收率可达到80.5％。
文档编号C12N11/04GK102660532SQ20121014396
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月29日 优先权日2012年4月29日
发明者朱启忠 申请人:山东大学威海分校